인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

Medicine

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Summary

직접 인체 조직에서 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 분리는 생물학적 특성 분석을위한 필수입니다. 또한 어려운 단계를 문제 해결에 대한 팁을 제공하면서이 원고는, 인간의 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를위한 방법을 설명합니다.

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Vidal, S. J., Quinn, S. A., de la Iglesia-Vicente, J., Bonal, D. M., Rodriguez-Bravo, V., Firpo-Betancourt, A., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples. J. Vis. Exp. (85), e51332, doi:10.3791/51332 (2014).

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Abstract

암 줄기 세포 (CSC) 모델은 상당히 지난 20 년간 재 방문하고있다. 이 시간 동안 암줄 기세포를 확인하고 직접 고립 된 인간의 조직에서 순차적으로 일반적으로 유동 세포 계측법에 의해 세포와 분별의 모집단의 항체 라벨링을 통해, 면역 결핍 쥐에 전파되었다. 그러나, 전립선 암의 유일한 임상 적 특징은 상당히 신선한 인간 종양 샘플에서 전립선 CSC 추가의 연구를 한정 하였다. 우리는 최근 자신의 HLA 클래스 I (HLAI) 음성 표현형의 미덕에 의해 직접 인체 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를보고했다. 전립선 암 세포는 수술 표본에서 수확 기계적으로 분해된다. 세포 현탁액은 생성과 형광 복합 HLAI과 기질 항체가 표시되어 있습니다. HLAI 부정적인 세포의 모집단은 마지막으로 유동 세포 계수기를 사용하여 격리됩니다. 이 프로토콜의 주요 제한은 자주 현미경 및 다 초점 본성전립선 절제 표본의 기본 암. 그럼에도 불구하고, 고립 된 라이브 전립선 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스에 이식하여 분자 특성 및 기능 검증에 적합하다.

Introduction

종양 내 이질 암 (1)의 특징으로 간주됩니다. 실제로, 종양 내 이성의 몇 가지 메커니즘이 유전자 변이와 미세 환경과의 상호 작용을 포함하여 기술되었다. 또한, 일부 암은 직렬 이식 분석 2-5 종양 개시 용량과 자기 갱신의 특성을 나타내는 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 모집단으로 셀룰러 계층 구조를 포함 할 수있다. 초기에 혈액 6, 유방 78 악성 종양에 설명, 암줄 기세포는 전립선 암 9-12뿐만 아니라 다른 종양 유형 2-5에서 연구되고있다.

암줄 기세포는 일반적으로 이종 인구 2-5 내에서 세포 부분으로 간주됩니다. 따라서 암줄 기세포의 기능 및 분자 특성은 대량 집단에서 자신의 농축에 달려있다. 따라서, 지난 20 년간 여러 가지 사항이 충족CSC 농축 hodologies는 일반적으로 유동 세포 계측법에 의해 표시 인구의 분리를 포함하는 고안되었다. 또한, 암줄 기세포의 연구에 중요한 고려 사항은 인체 조직의 계층 적 조직 등의 문화 또는 면역 결핍 생쥐의 일련 계대으로 실험 조작에 의해 중단 될 수 있다는 것이다. 그 결과, 인간의 조직으로부터의 직접적인 CSC 추가 절연은 CSC 분야에서 중요한 방법으로 떠오르고있다.

전립선 암은 암 이환율 및 미국 및 세계 (13) 주변의 사망의 주요 원인이다. 따라서, 전립선 암줄 기세포의 분리 및 생물학적 특성은 상당한 관심입니다. 전립선 암줄 기세포는 이전 세포주, 환자 유래의 이종 이식, 낮은 통로 환자 파생 된 서스펜션 문화 9,10,12,14에서 풍성하게한다.

우리는 최근에 직접적으로 인간의 수술들에서 전립선 암줄 기세포의 분리를보고자신의 HLAI 음성 세포 표면 표현형 (10)의 미덕 amples. 여기서 자세하게는 이들 세포의 분리를 위해 구현 된 절차를 우리. 전립선 종양 수술 표본에서 수확 세포 현탁액으로 만들어집니다. 세포는 다음 HLAI에 대한 항체뿐만 아니라 간질과 생존 마커를 사용하여 염색하고, 암줄 기세포는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)에 의해 격리됩니다. 고립 된 암줄 기세포는 가능한 세포를 필요로하는 분석에 사용할 수 있습니다.

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Protocol

1. 수확 및 수술 표본에서 인간의 전립선 암 조직의 처리

  1. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 1640 배지 15 ㎖를 50 ㎖이 함유 폴리스티렌 원추형 튜브를 준비한다.
  2. 병리학 서비스 담당자가 프로토콜을 승인 한 기관 심사위원회에서 각각 전립선 및 완화 수술 표본에서 기본 및 전이성 전립선 암 샘플을, 수확. 전이성 샘플 차 수술 중 림프절 해부에서 얻을 수 있습니다, 다른 사람의 사이에서 하나의 전이성 병변의 진단 제거, 동안 고식적 수술 척수 압축 해제 등의 절차, 폐 동안 척추.
    1. 단계 1.1에서 첫 번째 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 관에 임상 진단을 위해 필요하지 초과 대량 조직을 수확, 4 ℃에서 바로 저장 harvesteD 조직은 적어도 지역 4 ~ 5 ㎠의 두께에서 1-2 cm를 측정해야한다.
  3. 연구소 직원은 세포 현탁액의 조직 학적 검사와 세대를위한 준비에 병리 서비스에서 얻은 대량 조직을 처리합니다.
    1. 대량 조직의 처리는 최대한의 세포 생존을 보장하기 위해 수술 적 절제에서 24 시간을 초과 할 수 없습니다.
    2. 멸균 메스와 집게와 생물 안전 캐비닛에서 작업, 거시적 종양 결절 2-4 mm 두께의 수평 조직 섹션을. 즉시 단계 1.1에서 두 번째 50 ㎖ 폴리스티렌 원뿔 튜브에 섹션을 저장합니다.
    3. 거시적 결절이 전립선 샘플에서 가시화되지 않을 경우, 후부의 엽 (叶) 및 전환 영역에서 임의의 2~4밀리미터 두께 수평 조직 섹션을 수집합니다.
  4. 멸균 메스와 핀셋을 사용하여 수술 조직의 일부를 분리하고 이전 세대에서 10 % 포르말린에 고정세포 현탁액의 기. 보관 및 전립선 암 조직의 존재를 확인하기 위해이 물질을 조직 학적 분석.

2. 조직 섹션의 세포 현탁액의 생성

  1. 멸균 생물 안전 캐비닛에서 작업, 멸균 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 1 ㎖를 포함하는 60 X 15mm 배양 접시에 조직 섹션을 전송합니다.
    1. 기계적으로 멸균 메스와 집게를 사용하여 샘​​플을 씹다.
    2. 어떤 효소 digestions이 프로토콜에 없습니다.
  2. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖ 현탁액을 전송합니다.
    1. 배양 접시에 1 ㎖를 추가하고 조직 절편이 완전히 보통 3 - 4 배, 해리 될 때까지 분쇄 단계를 반복합니다.
    2. 모든 조직 섹션이 분해 될 때까지 순차적으로이 절차를 반복합니다.
  3. 5 ㎖의 혈청 학적 PI로 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관의 내용을 재현 탁pette 1 분 동안 최대 속도 (약 3,200 RPM)에서 소용돌이.
  4. 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 생성 된 현탁액을 필터 및 제 멸균 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 수집합니다.
  5. 10 분 450 XG에서 원심 분리하여 펠렛을 생성합니다.
  6. , 상층 액을 버린다 적혈구 세포 용해 완충액 5 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고, RT에서 5 분을위한 솔루션을 품어. RT 450 XG에 5 분 동안 원심 분리하여 적혈구 세포 용해 버퍼를 제거합니다.
  7. 상층 액을 버리고 5 % FBS로 보충 된 PBS 1X에 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 실행 가능한 (트리 판 블루 음성) 세포의 수를 정량. 1 × 10 6 세포 / ㎖ 현탁액을 생성하고 더 이상 1 시간 이상 동안 얼음에 보관하지.
    1. 생존과 세포의 수율은 종양 표본 사이에 상당히 다를 수 있습니다. 전립선 설정에서 생존 능력 45~70%와 인터넷 사이의 범위 수거시적 종양 결절에서 두꺼운 수평 조직 섹션은 약 3 × 6 가능한 세포를 얻을 것으로 예상 할 수있다 2-4밀리미터을했습니다.

3. FACS에 대한 세포의 항체 염색법

  1. 아래 그림과 같이 다섯 15 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브 레이블을 지정합니다. 각각 조혈 및 내피 요소를 제외 CD45 및 CD31 항원 라벨을 사용합니다.
    1. 흠없는
    2. 의 IgG 2A의 κ-PE + IgG의 1 κ-FITC
    3. HLAI-PE + IgG의 1 κ-FITC
    4. 의 IgG 2A의 κ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
    5. HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
  2. 3.1 단계에있는 5 개의 튜브에 이전 섹션 (단계 2.7)에서 정량화 된 세포 현탁액을 배포합니다. 1:250의 희석에 항체를 추가하고 30 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 품어.
  3. 4 ° C에서 3 분 450 XG에서 세포를 원심 분리하고, 상층 액을 버린다. 멸균 1X PBS 각 펠렛을 재현 탁하여 세포를 씻으 4 ℃에서 3 분 450 XG에서 원심 분리 한 다음 10 % FBS와 보충
  4. 10 ㎍ / ㎖의 농도의 4를 함유하는 1X PBS를 1 ㎖ 용액 ',6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)로 세포를 재현 탁.
  5. 12mm X 75mm의 폴리스티렌 튜브에 35 ㎛의 여과기 모자를 통해 최종 솔루션을 필터링합니다.

4. FACS에 의한 전립선 암줄 기세포의 분리

  1. 셀 정렬의 흐름 세포 계수기를 사용한다.
  2. 튜브에서 # 1, # 2, # 3 세포를 사용하여 보정 컨트롤을 설정하고, # 4.
  3. 전방 및 측면 산란 매개 변수를 사용하여 파편과 세포의 클러스터를 제외 게이트를 만듭니다.
  4. 각각 튜브 # 3, # 4 관에서 현탁액을 사용하여 FITC와 PE 게이트를 설정합니다.
  5. 퍼시픽 블루-A 채널을 사용 가능한 게이트 (DAPI 음성) 세포.
  6. 관 # 5 폐기는 CD31 양성 및 CD45 양성 세포를 사용하여RPMI 2 ㎖를 10 % FBS와 보충을 포함하는 멸균 15 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 모두 HLAI 음성 및 HLAI 양성 인구를 수집합니다.
  7. 원심 분리기 5 분 450 XG에서 세포 현탁액을 분류하고 10 % FBS와 보충 RPMI의 200 ~ 500 μL에 펠렛을 재현 탁.
  8. 혈구 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 (트리 판 블루 음) 세포를 정량화.

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Representative Results

그림 1
그림 1. 인간의 전립선 암 종양의 수확과 인간 전립선 암의 특정 집단을 설명 줄거리 유동 세포 계측법. (A) 종양 결절 세포 현탁액을 생성하기 위해 수확. 처리 된 샘플의 종양의 콘텐츠는 종래의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 이용하여 확인된다. DAPI에 대해 긍정적으로 염색 (B) 세포는 생존 세포를 분리 제외됩니다. (C) HLAI 음성 게이트 제어 isotypic IgG의 1 κ-FITC와의 IgG 2A κ-PE 항체로 염색 된 세포를 기반으로 작성됩니다. HLAI 음성 및 HLAI 양성 세포의 비율이 게이트에 나와 있습니다. 여기를 클릭하세요이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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Discussion

이 프로토콜은 신선한 인간의 전립선 암 조직에서 암줄 기세포의 분리에 대해 설명합니다. 몇 가지 중요한 고려 사항은이 프로토콜의 성공적인 결과에 영향을 미친다.

가능한 전립선 암 세포의 높은 숫자의 회복 수술 견본 조심 총 평가에 의존한다. 거시적 종양 결절이 관찰 10을 처리 할 때 우리의 경험에서, 종양 형성 전립선 세포의 성공적인 분리가 가장 확실하다.

그러나, 전립선 표본에서 파생 된 요즘 차 질환은 자주 다 초점 현미경입니다. 이러한 경우에, 가능한 시료 처리가 수확 전립선 암 세포의 가능성을 증가시키기 위해 이전 임상 생검 결과로 통지되어야 할 때. 잘 훈련 된 실험실 직원이 배수에서 전립선 암줄 기세포의 성공적인 분리를 보장하기 위해 자주 프로토콜을 수행하기 위해 우리의 경험, 그것은 필요가있다iple 임상 전립선 샘플.

우리는 여기에 세포 표면 HLAI 식 관련된 부정적인 선택 프로토콜을 설명 이후 또한, 그것은 FACS에 의해 처리 된 전립선 암 세포 현탁액으로부터 HLAI 음성 요소를 잠재적으로 오염 제거하는 것이 중요하다. 특히, 적혈구 세포 용해 완충액 및 DAPI 염색에 의해 세포의 생존 불가능한 누락의 사용은 중요한 고려 사항이다. 이러한 조치에게는 드물게 암 세포가 HLAI 부정적인 인구를 오염시키지 않는 것을 보장 할 수 있지만, 우리의 이전 제한 희석 연구는 전립선 암줄 기세포는 그럼에도 불구하고 효율적으로 구획 (10)에 충실하는 것이 좋습니다.

예를 들어 자신의 능력을 효율적으로 다른 사람의 사이에서, 면역 마우스에 이종 이식을 시작하기 위해 마지막으로, 살아있는 세포의 분리는 기능적 특성을 수 있습니다. 발현 프로파일을 포함한 분자 연구 역시 달성 할 수있다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 하리리 가족 재단과 TJ 마텔 재단에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Gibco Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum Gibco Life Technologies 10437-028
Penicillin Streptomycin Gibco Life Technologies 15140-122
PBS Corning Cell Gro 21-031-CM
60 mm, 15 mm Cell culture dish Corning 3295
35 µm Cell Strainer BD Falcon 352340
50 ml conical tube Crystalgen 23-2263
15 ml conical tube Crystalgen 23-2265
Red blood cell lysing buffer Sigma R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody Abcam ab43545
CD31 FITC antibody eBioscience 11-0319-42
CD45 FITC antibody Abcam ab27287
IgG2aκ PE antibody BD Pharminogen 555574
IgG1κ FITC antibody BD Pharminogen 551954
DAPI Invitrogen d3571
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap BD Falcon 352235
Vortex Mixer Crystalgen CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin Fisher RBBP-0480

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References

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