के लिग्निन नीचे विनियमन
1The School of Plant Sciences, University of Arizona, 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University, 3The Institute for Sustainable and Renewable Resources, The Institute for Advanced Learning and Research, 4Department of Plant, Soil and Microbial Sciences, Michigan State University

Bioengineering

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Summary

एक डबल असहाय शाही सेना हस्तक्षेप (dsRNAi) तकनीक मक्का cinnamoyl कोएंजाइम कम संयंत्र लिग्निन सामग्री के लिए एक रिडक्टेस (ZmCCR1) जीन नीचे विनियमित करने के लिए कार्यरत है. सेल की दीवार से लिग्निन नीचे विनियमन सूक्ष्म विश्लेषण द्वारा कल्पना और Klason विधि द्वारा मात्रा निर्धारित है. Hemicellulose और क्रिस्टलीय सेलूलोज में compositional परिवर्तन विश्लेषण कर रहे हैं.

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Park, S. H., Ong, R. G., Mei, C., Sticklen, M. Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51340, doi:10.3791/51340 (2014).

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Abstract

जैविक रूपांतरण की प्रक्रिया के दौरान एक वैकल्पिक bioenergy संसाधन के रूप में lignocellulosic बायोमास के उपयोग की सुविधा के लिए, एक pretreatment कदम कोशिका दीवार कार्बोहाइड्रेट की पहुंच बढ़ाने, संयंत्र सेल दीवार की संरचना को खोलने की जरूरत है. लिग्निन, कई सेल दीवार प्रकार में मौजूद एक polyphenolic सामग्री, का उपयोग एंजाइम के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा होने के लिए जाना जाता है. संयंत्र की संरचनात्मक अखंडता और रक्षा प्रणाली के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक स्तर तक लिग्निन सामग्री में कमी bioethanol उत्पादन की लागत को कम करने के लिए एक मूल्यवान कदम हो सकता है. इस अध्ययन में, हम आनुवंशिक रूप से एक डबल असहाय शाही सेना के हस्तक्षेप तकनीक के माध्यम से लिग्निन जैवसंश्लेषण से संबंधित जीन में से एक, cinnamoyl सीओए रिडक्टेस (ZmCCR1) नीचे विनियमित है. ZmCCR1_RNAi निर्माण कण बमबारी विधि का उपयोग मक्का जीनोम में एकीकृत किया गया. ट्रांसजेनिक मक्का के पौधों में बिना जंगली प्रकार नियंत्रण पौधों की तुलना में सामान्य रूप से बढ़ीट्रांसजेनिक पौधों के पत्ते मध्य पसलियों, भूसी में भूरे रंग के प्रदर्शित करने के अपवाद के साथ, बायोमास विकास या सुरक्षा तंत्र के साथ terfering, और उपजा है. सूक्ष्म विश्लेषण, ऊतकीय परख के साथ संयोजन के रूप में, पत्ती बादाम आदि का कड़ा ऊपरी आवरण फाइबर पतला कर रहे थे लेकिन अन्य प्रमुख नाड़ी तंत्र घटकों की संरचना और आकार बदल नहीं था कि पता चला. ट्रांसजेनिक मक्का में लिग्निन सामग्री 7-8.7% की कमी थी, क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री लिग्निन कमी के जवाब में वृद्धि हुई है, और hemicelluloses अपरिवर्तित रहा था. विश्लेषण करती है कि कार्बन प्रवाह सेलूलोज जैव संश्लेषण के लिए लिग्निन जैवसंश्लेषण से स्थानांतरित कर दिया गया हो सकता है का संकेत हो सकता. यह लेख आरएनएआई प्रौद्योगिकी के माध्यम से मक्का में लिग्निन सामग्री नीचे विनियमित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं रूपरेखा बनाती है, और सेल दीवार compositional कोशिका दीवार संरचना पर संशोधनों के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया विश्लेषण करती है.

Introduction

lignocellulosic बायोमास से जैव ईंधन के उत्पादन की वजह से अमेरिका 1 में इसके वर्तमान बहुतायत के लिए अति आवश्यक है, और कृषि और वानिकी अवशेषों की स्थायी फसल के मामले में, भोजन और पशु चारा उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया cropland के लिए सीधे प्रतिस्पर्धा नहीं करने की क्षमता. हालांकि, वर्तमान में अमेरिका में उत्पन्न जैव ईंधन का मुख्य स्रोत है, जो मक्का अनाज, के विपरीत, lignocellulosic सामग्री काफी अधिक जटिल और मुश्किल नीचे तोड़ने के लिए कर रहे हैं. लंबी श्रृंखला कार्बोहाइड्रेट, सेलूलोज़ और hemicellulose, lignocellulosic सामग्री के किण्वन के दौरान शक्कर का मुख्य स्रोत हैं, जो संयंत्र सेल दीवारों के कई प्रकार के भी लिग्निन होते हैं, रोगज़नक़ हमले के खिलाफ ताकत, रक्षा प्रदान करता है कि एक phenylpropanoid बहुलक, और hydrophobicity के अलावा दीवारों सेल. संयंत्र विकास और अस्तित्व के लिए आवश्यक है, जबकि लिग्निन भी सेलूलोज और hemicellu के सफल एंजाइमी रूपांतरण के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा प्रस्तुतघुलनशील शर्करा को खो देते हैं. उच्च लिग्निन सामग्री के साथ सामग्री आम तौर पर (जैविक रूपांतरण रास्ते के माध्यम से) जैव ईंधन और प्रसंस्करण विशेषताओं और उत्पाद की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभावों के कारण लुगदी और कागज उद्योग दोनों के लिए कम वांछनीय सामग्री रहे हैं. इसलिए, फसल संरचनात्मक ताकत और रक्षा प्रणालियों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक स्तर पर लिग्निन कमी के लिए संयंत्र सामग्री की आनुवंशिक हेरफेर lignocellulosic जैव ईंधन और लुगदी और कागज उद्योग दोनों के लिए उत्पादन लागत में कमी के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है.

मक्का (मक्का) में, लिग्निन covalently ferulate और diferulate पुलों 2 के माध्यम से प्राथमिक कोशिका दीवार में hemicellulose के लिए पार से जुड़े है. लिग्निन-hemicellulose जटिल माध्यमिक सेल दीवार को ईमानदारी और ताकत प्रदान कि एक जटिल मैट्रिक्स के गठन, हाइड्रोजन बांड के माध्यम से सेलूलोज़ microfibrils को बांधता है. संयंत्र सेल दीवारों के यांत्रिक शक्ति काफी हद तक ली के प्रकार से निर्धारित होता हैgnin 3-5 यूनिटों. पिछले अध्ययनों में, लिग्निन सब यूनिटों के अनुपात में फेरबदल एंजाइमी पाचनशक्ति 6-11 पर कोई स्पष्ट प्रवृत्ति दिखाई है. हालांकि, लिग्निन सामग्री में कटौती आम तौर पर रूपांतरणों 12,13 में एक सुधार दिखा और endocellulases, cellobiohydrolases, और β-glucosidases 14 सहित hydrolytic एंजाइमों से संयंत्र सामग्री की पाचनशक्ति को बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण हो सकता है.

टेप की अभिव्यक्ति के स्तर को विनियमित करने के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग बड़े पैमाने पर फसल लक्षण में सुधार करने के लिए अभ्यास किया गया है. विरोधी भावना 15 और सह दमन 16 प्रौद्योगिकियों सहित उन्नत तकनीक, नीचे विनियमन लक्ष्य जीन की प्रभावी सक्षम. पूरी जीन दस्तक बाहर भी एक बाल के लिये कांटा संरचना 17 से Intron-spliced ​​आरएनए जीन एन्कोडिंग निर्माणों का प्रयोग कर प्राप्त किया गया है. इसके अलावा, एक डबल असहाय शाही सेना हस्तक्षेप (dsRNAi) तकनीक, यानी एक शक्तिशाली और प्रभावी जीन अभिव्यक्ति मीडियालक्षित कर प्रतिलेख गिरावट या अनुवाद दमन या तो द्वारा काम करता है कि टो, लक्ष्य mRNA 18 पर दमन प्रभाव की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रेरित करने के लिए एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है. जीन मुंह तकनीक कई सीमाएं दिखा. इन तकनीकों में ठीक प्रतिलेखन के स्तर को विनियमित नहीं है और यह अन्य मुताबिक़ जीन पर अप्रत्याशित मुंह बंद प्रभाव हो सकता है.

इस विधि में, हम dsRNAi मक्का जीनोम में constructs ले जाने के लिए कण बमबारी कार्यरत हैं. तिथि करने के लिए, पौधों की प्रजातियों की एक विशाल सरणी सफलतापूर्वक कण बमबारी, Agrobacterium मध्यस्थता परिवर्तन, electroporation, और microinjection तरीकों का उपयोग बदल दिया गया है. यह सबसे कारगर है क्योंकि मक्का आनुवंशिक परिवर्तन में, कण बमबारी विधि सभी अन्य तरीकों से अधिक लाभप्रद है. कण बमबारी बैक्टीरिया पर निर्भर नहीं है, तो विधि ऐसे जीन की जीन, प्रजातियों का आकार या रूप में जैविक बाधाओं से मुक्त हैigin, या संयंत्र जीनोटाइप. शारीरिक transgene वितरण प्रणाली उच्च परिवर्तन दक्षता 19 में क्लोरोप्लास्ट में संयंत्र जीनोम में और कुछ मामलों में पेश होने के लिए उच्च आणविक वजन डीएनए और कई जीनों में सक्षम बनाता है. पत्ती के मध्य रिब की नाड़ी तंत्र में लिग्निन कमी नमूनों की स्थलाकृति और संरचना की जांच के लिए फायदेमंद है जो स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के माध्यम से देखे जा सकते हैं.

मक्का के पौधों में, cinnamoyl सीओए रिडक्टेस की दो (ZmCCR1: X98083 और ZmCCR2: Y15069) जीन मक्का जीनोम 20 में पाया गया. Cinnamoyl सीओए रिडक्टेस cinnamyl aldehydes में hydroxycinnamoyl सीओए एस्टर का रूपांतरण catalyzes. जीन सभी lignifying ऊतकों में व्यक्त किया है क्योंकि हम इस एंजाइम नीचे विनियमित करने ZmCCR1 जीन चुना है. दृश्यों होना को दिखाई दिया क्योंकि ZmCCR1 जीन की 3 'टर्मिनस पर 523 nucleotides एक dsRNAi निर्माण के लिए चुना गयाZmCCR2 के उन लोगों की तुलना में अधिक विविध. इस प्रकार, dsRNAi निर्माण ठीक 21 मुंह बंद बंद लक्ष्य से परहेज ही ZmCCR1 के लिए बाध्य होगा. एक ZmCCR1_RNAi निर्माण cytoplasmic अभिव्यक्ति प्रणाली ImpactVector1.1 टैग में इंजीनियर था (चतुर्थ 1.1) हरी ऊतक विशिष्ट प्रमोटर युक्त, ribulose-1, 5 बाइफोस्फेट कार्बोज़ाइलेस oxygenase (RuBisCO).

DsRNAi ट्रांसजेनिक पौधों पर निर्माण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, लिग्निन सामग्री मात्रा निर्धारित किया गया था. Klason (एसिड अघुलनशील) लिग्निन माप लिग्निन 22 के कुछ solubilize जो एसिड डिटर्जेंट लिग्निन मात्रा का ठहराव तरीकों की तुलना में अधिक सटीक होना करने के लिए जाना जाता है. इसलिए, Klason लिग्निन ट्रांसजेनिक मक्का डंठल में मापा गया था. इस प्रक्रिया में घुलनशील मोनोसैक्राइडों 23 में polymeric कार्बोहाइड्रेट धर्मान्तरित एक दो कदम एसिड हाइड्रोलिसिस के होते हैं. हाइड्रोलाइज्ड बायोमास तो एसिड घुलनशील और अघुलनशील materi में fractionated गया थाए एल एस और एसिड अघुलनशील लिग्निन पिछले अध्ययनों 23,24 के अनुसार मापा गया था. आदर्श रूप में, लिग्निन विश्लेषण पिछले परिणामों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि घुलनशील सामग्री हटाने के लिए आदेश में हाइड्रोलिसिस कदम है, और अवशेषों में मौजूद किसी भी राख के लिए खाते में लिग्निन अवशेषों की एक के बाद हाइड्रोलिसिस दहन करने के लिए पानी और इथेनॉल के साथ एक्सट्रेक्शन को शामिल करना चाहिए. इन कदमों के बिना, नमूना के लिग्निन सामग्री कृत्रिम फुलाया जा सकता है. पूर्ण विधि हालांकि हमारे प्रयोगों के लिए हम कारण परीक्षण के लिए उपलब्ध सामग्री की छोटी मात्रा के लिए इन चरणों के दोनों प्रदर्शन करने में असमर्थ थे, यहां प्रस्तुत किया है

दो अन्य सेल दीवार घटकों, सेलूलोज़ और hemicellulose भी लिग्निन नीचे विनियमित ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों में विश्लेषण किया गया. यह बताया गया है कि या तो उनके फेनिलएलनिन अमोनिया lyase (पाल) 25, 4 coumarate में नीचे विनियमित किया गया है कि ट्रांसजेनिक पौधों: कोए ligase (4CL) 26, या cinnamyl एकlcohol डिहाइड्रोजनेज (सीएडी) 27 अन्य सेल दीवार संरचनात्मक घटकों में वृद्धि दिखा. हमारे अध्ययन में एक पहला कदम के रूप में, क्रिस्टलीय सेलूलोज Updegraff विधि 28 का उपयोग कर मापा गया था. इस विधि मूल रूप से Cellulolytic बैक्टीरिया और कवक की एक बड़ी संख्या में सेलूलोज के निर्धारण के लिए तैयार किया गया था. Hemicellulose, लिग्निन, और xylosans दूर करने के लिए संक्षेप में, milled मक्का शेयरों Updegraff अभिकर्मक (पानी: नाइट्रिक एसिड एसिटिक एसिड) के साथ इलाज किया गया. क्रिस्टलीय सेलूलोज पूरी तरह से तो 4 एच 2 जोड़कर Saeman हाइड्रोलिसिस के माध्यम से ग्लूकोज में hydrolyzed गया था. क्रिस्टलीय सेलूलोज तो वर्णमिति anthrone विधि 29 का उपयोग assayed किया गया था. Hemicellulose सामग्री बदल रहे थे, तो सत्यापित करने के लिए, milled डंठल से मोनोसैकराइड अर्क, trifluoroacetic एसिड का उपयोग hydrolyzed alditol एसीटेट विधि का उपयोग derivatized और फिर गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) 30 से विश्लेषण किया गया. क्रिस्टलीय सीईएल के लिए विस्तृत प्रक्रियाओंlulose सामग्री और मैट्रिक्स polysaccharides रचना विश्लेषण फोस्टर एट अल में वर्णित हैं. (2010) 31.

यहाँ, हम लिग्निन के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं का वर्णन नीचे विनियमन एक आरएनएआई प्रौद्योगिकी, कण बमबारी परिवर्तन, और जैव ईंधन के लिए उफानने शर्करा में मक्का lignocellulosic बायोमास के त्वरित deconstruction के लिए लिग्निन विश्लेषण के माध्यम से मक्का में.

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Protocol

1. ZmCCR1 के नीचे विनियमन के लिए प्रयुक्त dsRNAi constructs की तैयारी

  1. एक dsRNAi नाक आउट करने ZmCCR1 जीन का निर्माण करने के लिए आवश्यक प्रतिबंध एंजाइम साइटों सहित डिजाइन जीन विशिष्ट प्राइमरों. दो प्राइमर सेट ZmCCR1 सीडीएनए की दो टुकड़ा क्षेत्रों बढ़ाना डिजाइन किए गए थे. 1271 को न्यूक्लीओटाइड 748 से 523 बीपी टुकड़ा है, और 1271 के लिए न्यूक्लियोटाइड 986 से 285 बीपी टुकड़ा ZmCCR1 सीडीएनए एरिज़ोना जीनोम संस्थान (आंदोलन) से प्रदान किया गया. अधिक जानकारी के लिए चित्र 1 में वर्णित हैं.
  2. प्राइमरों ZmCCR1_748F_BglII (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC -3 ') और ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT -3') का उपयोग ZmCCR1 सीडीएनए टेम्पलेट से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा बड़े टुकड़ा बढ़ाना. प्राइमरों ZmCCR1_986F_BglII (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC -3 ') और एक ZmCCR1_1271R_SacI (5R का उपयोग छोटे टुकड़ा (285) बीपी बढ़ाना17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT -3 ').
  3. व्यक्तिगत रूप से निर्माता के निर्देशों का पालन pGEM आयकर आसान में टुकड़े ligate.
  4. प्रत्येक युक्त व्यक्ति transformants से मिनी प्रस्तुत करने का प्लाज्मिड डीएनए अलगाव प्रदर्शन करना pGEM आयकर एक वाणिज्यिक मिनी प्रस्तुत करने का प्लाज्मिड किट का उपयोग निर्माण करती है.
  5. दोनों को पचाने BglII और NcoI दोनों साथ pGEM आयकर :: ZmCCR1 (523 बीपी) और ImpactVector (चतुर्थ) -1.1 (कोशिका द्रव्य अभिव्यक्ति वेक्टर).
  6. चतुर्थ-1.1 शुद्ध किया पचा ​​जेल में बड़े पचा जेल शुद्ध किया ZmCCR1 टुकड़ा (523) बीपी ligate.
  7. चतुर्थ-1.1 :: ZmCCR1 (523 बीपी) में छोटा सा टुकड़ा डालने के क्रम में BglII और Saci दोनों साथ pGEM आयकर :: ZmCCR1 (285 बीपी) और चतुर्थ-1.1 :: ZmCCR1 (523) बीपी डाइजेस्ट.
  8. चतुर्थ-1.1 शुद्ध किया पचा ​​जेल :: ZmCCR1 (523 बीपी) में छोटे पचा जेल शुद्ध किया ZmCCR1 टुकड़ा (285) बीपी ligate.
  9. 523 बीपी और 285 बीपी fragmen दोनों क्लोनउल्टे दोहराने टुकड़े के बीच में एक 238 बीपी स्पेसर (चित्रा 1 देखें) के साथ एक 285 बीपी उल्टे दोहराने अनुक्रम है जो ZmCCR1 आरएनएआई का निर्माण करने के लिए चतुर्थ-1.1 में टीएस,.
  10. इस Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) में निर्माण स्थानांतरण, उन्हें आगे बढ़ने और मक्का आनुवंशिक परिवर्तन के लिए पर्याप्त प्लास्मिड डीएनए प्राप्त करने के लिए एक वस्तु प्रस्तुत करने का आकार प्लास्मिड डीएनए अलगाव प्रदर्शन करते हैं.

2. जेनेटिक परिवर्तन मक्का

  1. टंगस्टन कणों की तैयारी
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में टंगस्टन मोतियों की 60 मिलीग्राम (M10) प्लेस और 2 मिनट के लिए vortexing द्वारा 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर से धो लें. 23 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं तो 2 मिनट के लिए 18,894 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    2. 2 मिनट के लिए centrifuging और सतह पर तैरनेवाला discarding, 1 एमएल 100% इथेनॉल के साथ 3x धो लें. 60 मिलीग्राम / मिलीलीटर microparticle एकाग्रता लाने के लिए बाँझ 50% ग्लिसरॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. बमबारी के लिए डीएनए की तैयारी
    1. Plएक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 50% ग्लिसरॉल में तैयार टंगस्टन मोतियों की 50 μl (3 मिलीग्राम) ACE. चतुर्थ-1.1 से 5 μl (1 ग्राम) :: ZmCCR1 आरएनएआई प्लास्मिड डीएनए, 2.5 एम 2 CaCl के 50 μl, और 0.1 एम spermidine के 20 μl जोड़ें. संक्षेप में ऊपर अभिकर्मकों इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बीच भंवर.
    2. भंवर 30 सेकंड के लिए 18,894 XG पर टंगस्टन मनका डीएनए मिश्रण संक्षिप्त अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला डालो और 70% इथेनॉल के 140 μl में छर्रों resuspend. तरल हटाने और त्यागें. 100% इथेनॉल के 140 μl जोड़ें. तरल हटाने और त्यागें.
    3. 100% इथेनॉल के 48 μl जोड़ें. पूर्व बमबारी करने के लिए 4 घंटे के लिए तुरंत प्रयोग करें या बर्फ पर दुकान.
  3. बमबारी
    1. 32 (osmotium के रूप में) कम से कम 4 घंटे पूर्व बमबारी करने N6OSM मीडिया वाले 100 मिमी पेट्री डिश के बीच में (आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के मक्का परिवर्तन केंद्र से प्रदान की) एक 3-5 सेमी व्यास हाय-II embryogenic मक्का Calli रखें.
    2. Preparनिर्माता के निर्देशों 33 के अनुसार ई PSD-1000/He कण वितरण डिवाइस.
    3. 70% इथेनॉल के साथ चैम्बर दीवार जीवाणुरहित. बाँझ बनाए रखने की टोपी में बाँझ 650 साई टूटना डिस्क लोड करें. एक macrocarrier, शुष्क संक्षिप्त की सतह पर M10 डीएनए समाधान के 5-6 μl बिखरा हुआ है. लोड macrocarrier और microcarrier लांच विधानसभा में स्क्रीन रोक नहीं सकता.
    4. रोक स्क्रीन (एल 2 = 6 सेमी) और दरवाजा बंद से एक चयनित दूरी पर चैम्बर में microcarrier लांच विधानसभा और मक्का Calli रखें. एक तार जाल स्क्रीन के खिलाफ 27 साई की एक निर्वात में तेजी लाने के.
    5. टूटना डिस्क फटने और हीलियम दबाव गेज शून्य करने के लिए चला जाता है जब तक आग बटन दबाएं. आग बटन छोड़ें.
    6. 27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 16 घंटे के लिए N6OSM (आसमाटिक मध्यम) 32 युक्त एक पेट्री डिश में बमबारी Calli सेते के बारे में दस टुकड़ों में Calli तोड़ और N6E (घट्टा प्रेरण मध्यम) को पेट्री डिश में 32 हस्तांतरण और 5 दिनों के लिए सेते मैंn 27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरा.
  4. चयन
    1. N6E पर 5 दिनों के बाद, N6S मध्यम (चयन मीडिया) 32 पर Calli हस्तांतरण. उपसंस्कृति चयन माध्यम पर सभी Calli Calli संरचना के बिना परेशान 8-12 हफ्तों के लिए हर 30 दिन.
    2. के बारे में 8-10 सप्ताह के बाद, सफेद तेजी से बढ़ते क्षेत्रों में गैर proliferating और आंशिक रूप से परिगलित मां Calli से बाहर हो जाना होगा. सफेद तेजी से बढ़ रही ऊतकों उत्पाद शुल्क और ताजा चयन मध्यम (N6S) 32 करने के लिए उन्हें उपसंस्कृति और ऊपर के रूप में सेते जारी है.
  5. उत्थान
    1. उत्थान मध्यम 32 पर सफेद और तेजी से बढ़ रही भ्रूण Calli स्थानांतरण और 1 सप्ताह के लिए ऊपर के रूप में सेते हैं. 25-27 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा दिन के उजाले और 8 घंटा अंधेरे की अवधि के लिए regenerating embryogenic Calli स्विच
    2. Regenerating पक्ष पर 3-4 सप्ताह के बाद एक गिलास टेस्ट ट्यूब में मध्यम 32 गोली मारता स्थानांतरण, ऊपर के रूप में सेते जारी है. पर्याप्त आर के बादoot विकास मिट्टी के साथ 4 "बर्तन के लिए पौधे प्रत्यारोपण तो, पानी के नल के नीचे ध्यान से जड़ों धोने, प्रकट होता है. नम रखने के लिए प्लास्टिक की थैलियों के साथ बर्तन को कवर किया. 2 दिन छोटे छेद प्लास्टिक बैग बनाने के बाद. 5-6 दिनों के बाद प्लास्टिक बैग को हटा दें. एक और 5-6 दिनों के लिए ऊपर के रूप में सेते जारी.
  6. ग्रीनहाउस
    1. मिट्टी के साथ 18 "बर्तन में seedlings के स्थानांतरण और पूरी गर्मियों में सूरज की रोशनी या ग्रीनहाउस प्रकाश में बनाए रखें. पहले बीज टी 1 पीढ़ी के हैं, जबकि प्रारंभिक पुनर्जीवित पौधों टी 0 कहा जाता है.

3. Histological परख

    1. 10% तटस्थ बफर formalin के 5 मिलीलीटर में मक्का का पत्ता मध्य पसलियों को ठीक करें.
    2. प्रक्रिया और निर्वात एक ऊतक प्रोसेसर का उपयोग कर एक ऊतक प्रोसेसर पर आयल के साथ घुसपैठ.
    3. एक HistoCentre तृतीय एम्बेड स्टेशन का उपयोग कर तेल में ऊतकों शामिल करें.
    4. किनारों से अतिरिक्त आयल निकालें एक बार गुटएस ठंडा कर रहे हैं.
    5. एक सूक्ष्म का उपयोग कर एक सूक्ष्म साथ 4-5 माइक्रोन पर धारा नमूना.
    6. माइक्रोस्कोप स्लाइड और 2-24 घंटे के लिए एक 56 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सूखे पर वर्गों रखें. सुनिश्चित करें कि वर्गों पूरी तरह से स्लाइड का पालन कर रहे हैं.
    7. 23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए xylene के दो परिवर्तन में Deparaffinize वर्गों
    8. हाइड्रेट 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के दो परिवर्तन और 23 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल के दो परिवर्तन के माध्यम से स्लाइड
    9. 2 मिनट के लिए पानी के नल चलाने में वर्गों कुल्ला.
    10. 1-2 मिनट के लिए 0.05% toluidine नीले ओ के साथ दाग और DDH 2 ओ के साथ संक्षिप्त कुल्ला
    11. प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ विसर्जन के तेल और दृश्य के साथ नमूने पर एक coverslip जगह.
  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)
    1. 4% glutaraldehyde में पार sectioned मक्का पत्ता मध्य पसलियों फिक्स और 1-2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच).
    2. संक्षेप में बफर में नमूने कुल्ला, उन्हें एक में निर्जलित10 मिनट, 3 एक्स के लिए प्रत्येक उन्नयन और 100% इथेनॉल में 10-15 मिनट के लिए इथेनॉल श्रृंखला (25%, 50%, 75%, और 95%).
    3. संक्रमणकालीन तरल पदार्थ के रूप में तरल कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर में निर्जलित पार sectioned मक्का पत्ता मध्य पसलियों सूखी.
    4. उच्च वैक्यूम कार्बन टैब का उपयोग एल्यूमीनियम आधार पर सूखे नमूनों माउंट
    5. कोट मक्का पत्ता मध्य पसलियों आर्गन गैस के साथ purged एक धूम coater में सोना (लगभग 20 एनएम मोटाई) के साथ एल्यूमीनियम आधार पर मुहिम शुरू की.
    6. एक JEOL JSM-6400V (लेण्टेनियुम hexaboride इलेक्ट्रॉन emitter) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में लेपित नमूनों की जांच.
    7. डिजिटल छवियों के एक विश्लेषण प्रो सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.2) का उपयोग करते हुए कल्पना कर रहे थे.

4. Klason Lignin मापन

  1. एक 2 मिमी स्क्रीन के माध्यम से मिल नमूनों.
  2. प्रत्येक नमूने की नमी की मात्रा का निर्धारण और मूल्य रिकॉर्ड करने के लिए एक नमी विश्लेषक का प्रयोग करें.
  3. ~ प्रत्येक नमूने की 1.5 ग्राम वजन और जन रिकॉर्ड. एxtract एक स्वचालित विलायक चिमटा (निकासी प्रति 3 चक्र, ~ चक्र के अनुसार 14 मिनट) या Soxhlet तंत्र (निकासी प्रति 8 घंटा) का उपयोग दूसरे निकासी के लिए इथेनॉल द्वारा पीछा पहले निकासी, के लिए पानी का उपयोग कर नमूने. (नोट: यह कदम स्पष्ट Klason लिग्निन सामग्री में वृद्धि, एसिड हाइड्रोलिसिस दौरान गाढ़ा और सटीक लिग्निन माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि extractives निकाल देता है.)
  4. रातोंरात 45 डिग्री सेल्सियस पर निकाले नमूने सूखी, तब उन्हें desiccator में शांत, और फिर वजन करने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. 30 डिग्री सेल्सियस के एक मशीन सेट (नमूना प्रति triplicates सिफारिश की है) पेंच शीर्ष उच्च दबाव ट्यूबों में प्रत्येक सूखी, निकाले नमूना की 0.3 ग्राम उपाय और निकटतम 0.1 मिलीग्राम वजन रिकॉर्ड. प्रत्येक दबाव ट्यूब के लिए 72% एच 2 के 3 मिलीलीटर अतः 4 जोड़ें.
  6. एक गिलास या Teflon हलचल रॉड का उपयोग नमूना मिलाएं. पानी ऊष्मायन के बाद जोड़ा जाता है जब तक ट्यूब में हलचल रॉड छोड़ दें.
  7. एक मशीन में शीशियों प्लेस एसई30 डिग्री सेल्सियस और 60 मिनट के लिए 150 rpm के लिए टी. 1 घंटा बाद 4% करने के लिए एसिड एकाग्रता पतला और हलचल छड़ी के साथ मिश्रण करने के लिए विआयनीकृत पानी की 84 मिलीलीटर जोड़ें. पानी रेखा से ऊपर शीशी की तरफ नमूना की बड़ी मात्रा में छोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
  8. कसकर सभी शीशियों पर stoppers सील और एक धातु रैक या बड़े बीकर में उन्हें जगह है. 1 घंटे के लिए एक तरल नसबंदी चक्र का उपयोग कर 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव. उन्हें खोलने से पहले कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें.
  9. कम से कम 4 घंटे के लिए 575 डिग्री सेल्सियस पर एक भट्ठी में फ़िल्टरिंग crucibles पूर्व राख. Crucibles कम से कम एक घंटे के लिए एक desiccator में शांत करने के लिए अनुमति दें.
  10. वैक्यूम क्रूसिबल सुरक्षित करने के लिए एक रबर अनुकूलक का उपयोग कर, एक अलग क्रूसिबल के माध्यम से प्रत्येक ट्यूब से समाधान फ़िल्टर. ट्यूब से किसी भी शेष कणों कुल्ला करने विआयनीकृत पानी का प्रयोग करें.
  11. 4 घंटा की एक न्यूनतम के लिए 105 डिग्री सेल्सियस पर लिग्निन अवशेषों सूखी. शुष्क क्रूसिबल और छाछ का वजन रिकॉर्ड.
  12. एक 575 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करते हैं, तो पूर्वविराम लेम्प बर्नर से अधिक नमूने वहाँ कोई धूम्रपान या राख है और उसके बाद 24 घंटे के लिए भट्ठी में जगह है, या एक प्रोग्राम भट्ठी का उपयोग करते हैं, तो राख पूर्व और निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग नहीं करते जब तक:
  13. 105 डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के तापमान से रैंप और 12 मिनट के लिए पकड़.
  14. 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट पर 250 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप और 30 मिनट के लिए पकड़.
  15. 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट पर 575 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप और कम से कम 180 मिनट के लिए पकड़.
  16. भट्ठी से crucibles निकालें और एक desiccator में शांत. क्रूसिबल और राख वजन.
  17. निम्न समीकरण का उपयोग एसिड अघुलनशील अवशेषों की गणना:

1 समीकरण

पूर्व निकाली बायोमास के एम प्री = मास
बाद निकाले बायोमास के एम पोस्ट = मास
निकाले बायोमास के एम शीशी = मास शीशी में जोड़ा
क्रूसिबल और लिग्निन resid के एम अवशेषों = मासUE
क्रूसिबल और राख के एम एएसएच = मास
पूर्व निकाली बायोमास, कुल वजन के आधार एम.सी. = नमी सामग्री

5. कार्बोहाइड्रेट विश्लेषण

  1. कोशिका दीवार कार्बोहाइड्रेट फोस्टर एट अल पर आधारित विश्लेषण करती है. (2010) प्रोटोकॉल 31 कार्य करें. संक्षेप में, फ्रीज सूखे पौधे सामग्री से शराब अघुलनशील अवशेषों को तैयार है. फिर trifluoroacetic एसिड के साथ सामग्री hydrolyze और उनके इसी alditol एसीटेट के लिए solubilized मोनोसैकराइड डेरिवेटिव मैच. एक चौगुनी मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) द्वारा इन अस्थिर डेरिवेटिव का विश्लेषण करें.

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Representative Results

हम आरएनएआई के माध्यम से मक्का के पौधों में लिग्निन सामग्री में कमी का प्रदर्शन किया है. कण बमबारी परिवर्तन विधि लगभग 30% trnasformation दक्षता झुकेंगे. ZmCCR1 का मुंह बंद जीन लगातार T0-T2 पीढ़ियों में मनाया गया. लिग्निन कम ट्रांसजेनिक्स पत्ती के मध्य रिब, भूसी, और स्टेम में भूरे रंग प्रदर्शित करने के लिए छोड़कर wildtype मक्का के पौधों की तरह ही बड़ा हुआ. ऊतकीय परख उत्परिवर्ती लाइनों मक्का पत्ती के मध्य रिब 18 में बादाम आदि का कड़ा ऊपरी आवरण फाइबर की कोशिका दीवार मोटाई में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन दिखाया है. सेल दीवार मोटाई की कमी के बावजूद, जाइलम पोत, फ्लोएम, और म्यान कोशिकाओं सहित अन्य प्रमुख संवहनी प्रणालियों की संरचना जंगली प्रकार नियंत्रण (2A चित्रा) 18 की तुलना में कोई मतभेद का खुलासा नहीं किया. यह मैं उपजा के लिए पानी परिवहन, पोषक हस्तांतरण, या यांत्रिक शक्ति के लिए या तो कोई हानिकारक प्रभाव है कि वहाँ का तात्पर्यn ZmCCR1_RNAi उत्परिवर्ती लाइनों.

लिग्निन सामग्री एक Klason lingin माप का उपयोग मात्रा था. चित्रा 3 wildtype मक्का और ZmCCR1_RNAi ट्रांसजेनिक लाइनों (T1) में एसिड अघुलनशील Klason लिग्निन (ग्राम / किलो चोर पशुओं का चारा) की राशि से पता चलता है. तीन ट्रांसजेनिक लाइनों (-1 सी -4, -5, और -6) जंगली प्रकार मक्का के पौधों में 18 की तुलना में (क्रमशः 8.1%, 7.0%, और 8.7%) एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण लिग्निन कमी देखी गई. कार्बन प्रवाह दीवार कार्बोहाइड्रेट जैवसंश्लेषण रास्ते सेल लिग्निन biosynthetic मार्ग से स्थानांतरित कर दिया गया था कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, सेल्यूलोज Updegraff विधि के माध्यम से विश्लेषण किया गया था. चित्रा 3A दो ZmCCR1_RNAi उत्परिवर्ती लाइनों (1 बी -6 और -1 सी -6) स्फटिक की काफी वृद्धि हुई स्तर निहित पता चलता है कि सेलूलोज (1.5 और 1.8 क्रमश गुना) 18. hemicellulose सामग्री भी विश्लेषण किया गया था. 4B चित्रा चार मुख्य hemicellulose घटकों (की राशि से पता चलता हैarabionose, सिलोज़, गैलेक्टोज, और ग्लूकोज). चार कार्बोहाइड्रेट समूहों में से कोई भी उत्परिवर्ती लाइनों 18 में किसी भी परिवर्तन का पता चला.

चित्रा 1
चित्रा 1 ZmCCR1 PRbcS1 के नीचे विनियमन के लिए dsRNAi प्लाज्मिड निर्माणों के लिए रणनीति क्लोनिंग:.. गुलदाउदी morifolium रमत से Ribulose बाइफोस्फेट कार्बोज़ाइलेस प्रमोटर. टी RbcS1: Asteraceous गुलदाउदी से Ribulose बाइफोस्फेट कार्बोज़ाइलेस छोटी इकाई टर्मिनेटर. यह आंकड़ा पार्क एट अल (2012) 18 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्ररूपी जंगली प्रकार मक्का का विश्लेषण करती है (हाय-II) और ZmCCR1_RNAiउत्परिवर्ती पत्ती midrib. ए) भूरा रंगाई, ZmCCR1 नीचे विनियमित मकई के पत्तों में देखा उपजी और मकई husks. बी) किया गया था जंगली प्रकार उच्च द्वितीय (बाएं) और ZmCCR1_RNAi उत्परिवर्ती लाइन (सही) के पार से sectioned मक्का पत्ती midribs 0.05% के साथ दाग रहे थे माध्यमिक जाइलम ऊतकों कल्पना करने के लिए 1 मिनट के लिए toluidine नीला हे. लाल Arrowhead पत्ती Midrib के बादाम आदि का कड़ा ऊपरी आवरण फाइबर की सेल दीवारों को इंगित करता है. (सी) ZmCCR1 की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) नीचे विनियमित जंगली प्रकार गैर ट्रांसजेनिक नियंत्रण संयंत्र (बाएं) की तुलना में ट्रांसजेनिक मक्का पत्ती midrib (दाएं). लाल तीर बादाम आदि का कड़ा ऊपरी आवरण फाइबर इंगित करता है. यह आंकड़ा पार्क एट अल से संशोधित किया गया है. (2012) 18.

चित्रा 3
चित्रा 3. Klason लिग्निन माप (ACIजंगली प्रकार उच्च द्वितीय और ZmCCR1_RNAi उत्परिवर्ती की D-अघुलनशील लिग्निन सामग्री). तीन उत्परिवर्ती लाइनों -1 सी -5, -1 सी, और शुष्क पदार्थ का प्रतिशत जंगली प्रकार नियंत्रण पौधों के साथ तुलना में -1 सी -6, क्रमशः सांख्यिकीय कम लिग्निन सामग्री, 8.5%, 7.5%, और 9.2% थी. मतलब ± मानक विचलन (पी <0.05, एन = 3). यह आंकड़ा पार्क एट अल से संशोधित किया गया है. (2012) 18.

चित्रा 4
चित्रा 4. कोशिका दीवार compositional 3). बी) hemicellulose जंगली प्रकार मक्का और ZmCCR_RNAi ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों (T1) के compositional विश्लेषण के माध्यम से. ZmCCR1_RNAi लाइनों (Tukey के जोड़ो में तुलना, * पी ​​0.05 <) एक क्रिस्टलीय सेलूलोज विश्लेषण का विश्लेषण करती है, एन = गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी). chromatograms से मुख्य चोटियों werई, एकीकृत अवधारण समय और टुकड़ा आयन हस्ताक्षर के आधार पर पहचान की, और मोल प्रतिशत के रूप में व्यक्त (पी> 0.05, एन = 3) (Tukey के जोड़ो में तुलना, पी> 0.05, n = 3). यह आंकड़ा पार्क एट अल से पुन: उपयोग किया गया है. (2012) 18.

चित्रा 5
चित्रा 5 प्रतिशत चीनी अनुपचारित (यूटी) और अमोनिया के विभिन्न सांद्रता में AFEX टीएम pretreated (90 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट) मक्का पशुओं का चारा के लिए (glucan और xylan) रूपांतरण (1.0:. 1.0 ग्राम एनएच 3 जी शुष्क बायोमास 1.5: 1.5 जी एनएच 3:. जी शुष्क बायोमास) त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं और इलाज के नमूने और pretreated नमूने लिए चार replicates (दो pretreatment प्रत्येक replicates दो हाइड्रोलिसिस साथ replicates) के लिए दो replicates पर आधारित हैं. Pretreated चीनी रूपांतरणोंअलग पत्र के साथ लेबल (24 घंटे या 72 घंटे) (पी <0.05) Tukey के जोड़ो में तुलना के आधार पर सांख्यिकीय अलग हैं. यह आंकड़ा पार्क एट अल से पुन: उपयोग किया गया है. (2012) 18.

<टीडी> 0.69 छ / एल प्रोलाइन
मीडिया रासायनिक रचनाओं
N6OSM 4 जी / एल N6 लवण
(परासरणी मध्यम) 1 मिलीग्राम / एल N6 विटामिन शेयर
2 मिलीग्राम / एल 2,4-D
100 मिलीग्राम / एल Myo-inositol
0.69 छ / एल प्रोलाइन
30 जी / एल सुक्रोज
100 मिलीग्राम / एल कैसिइन hydrolyzate
36.4 ग्राम / एल sorbitol
36.4 ग्राम / एल mannitol
2.5 छ / एल gelrite, पीएच 5.8
Autoclaving के बाद फिल्टर निष्फल चांदी नाइट्रेट (25 माइक्रोन) जोड़ें
N6E 4 जी / एल N6 लवण
(घट्टा प्रेरण) 1 मिलीग्राम / एल (1000) x N6 विटामिन शेयर
2 मिलीग्राम / एल 2,4-D
100 मिलीग्राम / एल Myo-inositol
2.76 छ / एल प्रोलाइन
30 जी / एल सुक्रोज
100 मिलीग्राम / एल कैसिइन hydrolyzate
2.5 छ / एल gelrite, पीएच 5.8
Autoclaving के बाद फिल्टर निष्फल चांदी नाइट्रेट (25 माइक्रोन) जोड़ें
N6S मीडिया 4 जी / एल N6 लवण
(चुनाव में मीडिया) 1 मिलीग्राम / एल N6 विटामिन शेयर
2 मिलीग्राम / एल 2,4-D
100 मिलीग्राम / एल Myo-inositol
30 जी / एल सुक्रोज
100 मिलीग्राम / एल कैसिइन hydrolyzate
36.4 ग्राम / एल sorbitol
36.4 ग्राम / एल mannitol
2.5 छ / एल gelrite, पीएच 5.8
Autoclaving के बाद फिल्टर निष्फल चांदी नाइट्रेट (25 माइक्रोन) जोड़ें
पुनर्जनन मध्यम 4.3 छ / एल एम एस लवण
1 मिलीग्राम / एल (1000x) एमएस विटामिन शेयर
100 मिलीग्राम / एल Myo-inositol
60 जी / एल सुक्रोज
3 जी / एल gelrite, पीएच 5.8 (100 x 25 मिमी पेट्री प्लेट)
फिल्टर निष्फल bialaphos (3 मिलीग्राम / एल) जोड़ें autoclaving के बाद जोड़ा
मध्यम सहानुभूति 4.3 छ / एल एम एस लवण
100 मिलीग्राम / एल Myo-inositol
30 जी / एल सुक्रोज
3 जी / एल gelrite, पीएच 5.8 (100 x 25 मिमी पेट्री प्लेट)
10% तटस्थ बफर formalin Formalin के 100 मिलीलीटर
(1 लीटर) DDH 2 हे के 900 मिलीलीटर
4.0 सोडियम dihydrogen फॉस्फेट, monohydrate (नाह 2 4 पीओ · 2 एच ओ) के जी

विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका 1. टेबल.

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Discussion

सेल दीवार polysaccharides संयंत्र के लिए माइक्रोबियल cellulases की पहुंच है, जो वे phenolic पॉलिमर 23 के साथ जुड़े रहे हैं करने के लिए डिग्री पर काफी हद तक निर्भर है. चीनी उफानने को lignocellulosic बायोमास से रूपांतरण दर नकारात्मक संयंत्र secondadry सेल दीवारों में जमा लिग्निन सामग्री के साथ जोड़ा जाता है. इस संबंध में इस तरह के hydrophobicity 24, रासायनिक विविधता के रूप में लिग्निन के भौतिक गुणों के लिए जिम्मेदार माना है, और नियमित रूप से hydrolysable intermonomeric के अभाव में 25 लिंकेज है.

इस अध्ययन में, एक dsRNAi तकनीक आनुवंशिक ठिकानों पर जीन नीचे विनियमन के विभिन्न स्तरों प्रेरित किया. निर्माण एक ZmCCR1_RNAi द्वारा मध्यस्थता लिग्निन नीचे विनियमन, T1 transgneic लाइनों में भूरे रंग में बदल गया है. ब्राउन midrib (बीएम) रंगाई कम लिग्निन सामग्री और बदल लिग्निन संरचना के कारण होता है कि एक स्वाभाविक रूप से होने वाली घटना है. अन्य स्वाभाविक रूप से occurr के विपरीतकेवल पत्ता मध्य पसलियों में भूरे रंग दिखाने जो एड बी.एम. म्यूटेंट, ZmCCR1_RNAi उत्परिवर्ती लाइनों उपजी और भूसी सहित संयंत्र के अन्य भागों में phenotype, का पता चला. ऊतकीय परख भी ZmCCR1 नीचे विनियमित पत्तियों का बादाम आदि का कड़ा ऊपरी आवरण सेल दीवार मोटाई जंगली प्रकार नियंत्रण पौधों (2A चित्रा) के उन लोगों की तुलना में काफी कम था कि संकेत दिया. हालांकि, जाइलम वाहिकाओं, फ्लोएम, या म्यान कोशिकाओं inclduing मुख्य संवहनी सिस्टम के sturucture और सेल दीवार मोटाई नहीं बदला गया था. इस पौधे की ऊंचाई के मामले में सामान्य रूप से वृद्धि हुई है और व्यास स्टेम जो ZmCCR1_RNAi ट्रांसजेनिक लाइनों की सामान्य वृद्धि समझा सकता है.

लिग्निन सामग्री में अधिक से अधिक 20% की कमी आम तौर पर बायोमास की क्षति हुई और माइक्रोबियल रोगज़नक़ों और कीट 27,28 के खिलाफ पौधों अधिक असुरक्षित बना दिया है. हालांकि, उत्परिवर्ती लाइनों एक 10% लिग्निन reducti से भी कम व्यक्त, इस शोध में उत्पादितपर, बायोमास संयंत्र और अजैव और जैविक तनावों के खिलाफ रक्षात्मक तंत्र समझौता नहीं किया था.

पिछले अध्ययनों से काफी कम सीसीआर अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक तम्बाकू लाइनें भी ऐसे ग्लूकोज, सिलोज़, और दीवार बाध्य phenolic यौगिकों (जैसे, sinapic और ferulic एसिड) के रूप में अन्य सेल दीवार घटक की वृद्धि देखी गई है कि पता चला है. इस अध्ययन में, हल्के लिग्निन कमी ZmCCR1 नीचे विनियमित मक्का के पौधों में से कुछ में क्रिस्टलीय सेलूलोज के स्तर में वृद्धि हुई है. इसके विपरीत, एक सेलूलोज मुआवजा तंत्र भी सेलूलोज़ संश्लेषण जीन 35 दोषपूर्ण थे जब अस्थानिक lignification प्रदर्शन किया जो एराबिडोप्सिस म्यूटेंट में मनाया गया. एक कोशिका दीवार कार्बोहाइड्रेट घटक की मात्रात्मक या गुणात्मक परिवर्तन अन्य घटकों की 36 प्रत्यावर्तन लाती है. इस तरह के मुआवजे mechansims संयंत्र संवहनी सिस्टम के homeostasis maintan के लिए महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, इस अध्ययन में, hemicelluloSES कोई सांख्यिकीय ZmCCR1 नीचे विनियमित उत्परिवर्ती लाइनों में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया. मनाया लिग्निन कमी अतिरिक्त hemicellulose संश्लेषण ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त नहीं था क्योंकि यह परिणाम हो सकता है.

लिग्निन और वृद्धि की क्रिस्टलीय सेलूलोज स्तर के कम स्तर जैव ईंधन के उत्पादन के लिए दोगुना फायदेमंद होगा. कम लिग्निन सामग्री प्रसंस्करण के दौरान कम आदानों (जैसे, एच 2 एसओ 4, cellulases, आदि) की आवश्यकता होती है और बायोमास रूपांतरण की प्रक्रिया में सुविधा होगी. अतिरिक्त सेलूलोज उफानने शर्करा की उपज में वृद्धि हो सकती है. इस अध्ययन में विस्तृत ZmCCR1 की आनुवंशिक हेरफेर lignocelluosic bimoass व्युत्पन्न bioethanol अधिक व्यावसायिक प्रतिस्पर्धी बनाने में मदद करने के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

सूक्ष्म इमेजिंग उन्नत माइक्रोस्कोपी के लिए मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी सेंटर की सेवाओं के माध्यम से आयोजित किया गया. मक्का घट्टा आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के मक्का परिवर्तन केंद्र से खरीदा गया था. लेखकों कार्बोहाइड्रेट विश्लेषण पर अपने तकनीकी सहायता के लिए MSU संयंत्र अनुसंधान प्रयोगशाला के जेफरी आर Weatherhead धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध उदारता मिशिगन मकई विपणन कार्यक्रम (CMPM) और पादप जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए कंसोर्टियम (CPBR) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N6OSM (Osmotic medium) Made in-house
N6E (Callus induction) Made in-house
N6S media (Selection media) Made in-house
Regeneration medium Made in-house
Rooting medium Made in-house
10% Neutral buffered formalin (1 L) Made in-house
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device Hercules, CA, United States
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Jena, Germany For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software.
Excelsior ES Tissue Processor Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
HistoCentre III Embedding Station Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
Microtome Model Reichert 2030 Reichert, Depew, NY, United States
Emscope Sputter Coater model SC 500 Ashford, Kent, England
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope JEOL Ltd., Tokyo, Japan
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States
Screw-top high pressure tubes Ace Glass, Vineland, NJ #8648-27
Screw-top high pressure tube plugs Ace Glass, Vineland, NJ #5845-47

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References

  1. Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
  2. Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. 275-178 (1995).
  3. Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. Michigan State University. (2011).
  4. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  5. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
  6. Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. 102-6486 (2011).
  7. Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
  8. Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
  9. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
  10. Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
  11. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
  12. Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
  13. Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
  14. Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
  15. Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
  16. Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
  17. Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
  18. Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
  19. Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
  20. Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
  21. Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
  22. Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
  23. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
  24. Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. (2008).
  25. Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
  26. Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
  27. Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
  28. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
  29. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
  30. Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
  31. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
  32. Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. (2005).
  33. Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
  34. Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
  35. Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).

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