אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

Cite this Article

Copy Citation

Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. עם זאת, יש לי פלטפורמות הנוכחיות גורמים מגבילים שונים, כגון הכנות עבודה אינטנסיבית מדגם, מגבלות זיהוי נמוכות, מהירויות סריקה איטיות, אופטימיזציה בשיטה אינטנסיבית עבור כל המטבוליט, וחוסר היכולת למדוד גם באופן חיובי ויונים טעונים שלילי בניסויים אחת. לכן, פרוטוקול metabolomics רומן יכול לקדם מחקרי metabolomics. כרומטוגרפיה הידרופילי מבוססת אמיד מאפשרת ניתוח המטבוליט קוטבי ללא כל derivatization כימי. MS ברזולוציה גבוהה באמצעות Q-Exactive (QE-MS) השתפר אופטיקה יון, גדל במהירויות סריקה (256 msec ברזולוציה 70,000), ויש לו את היכולת לבצע מיתוג חיובי / שלילי. משתמש באסטרטגית חילוץ מתנול קרה, וצימוד עמודה אמיד עם QE-MS מאפשרת זיהוי חזק של 168 מטבוליטים ממוקדים קוטב ואלפים תכונות נוספות בו זמנית. Datעיבוד מתבצע עם תוכנה זמינה באופן מסחרי בצורה יעילה ביותר, ותכונות ידועות שחולצו מן הספקטרום ההמוני ניתן שאילתה במסדי נתונים.

Introduction

Metabolomics, שהוגדר כניסוי שמודד מטבוליטים מרובים בו זמנית, כבר שטח של עניין רב. Metabolomics מספק readout ישיר של פיזיולוגיה מולקולרית וספק תובנות פיתוח ומחלות כגון סרטן 1-4. תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה מסה (GC-MS) הן בין המכשירים 5-9 הנפוצים ביותר. NMR, במיוחד נעשה שימוש בניסויי שטף מאז תרכובות האיזוטופ הכבד שכותרתו, כגון 13 מטבוליטים C שכותרתו, הם NMR פעיל 10,11. עם זאת, אסטרטגיה זו דורשת טוהר מדגם גבוה יחסית וכמות מדגם גדולה, אשר מגבילה את היישומים שלה בmetabolomics. בינתיים, הנתונים שנאספו מתמ"ג ניתוח הצרכים אינטנסיבי והקצאת מתחם של ספקטרום NMR המורכב הוא קשה. GC-MS כבר בשימוש נרחב למטבוליטים קוטב ומחקרי שומנים בדם, אבל זה דורש compoun נדיפיםDS ולכן לעתים קרובות derivatization של מטבוליטים, שלעתים כרוך כימיה מורכבת שיכול להיות זמן רב ומכניס רעש ניסיוני.

כרומטוגרפיה נוזלית (LC) מצמידים ספקטרומטריית מסת quadrupole משולשת משתמשת quadrupole הראשון לבחירת יוני ההורה שלמים, אשר לאחר מכן מקוטעים בquadrupole השני, בעוד quadrupole השלישי משמש לבחירת ברים אופייניים או יונים בתו. שיטה זו, המתעדת את המעבר מיוני הורה ליונים בתו ספציפי, שמכונה ניטור תגובה מרובה (MRM). MRM הוא שיטה מאוד רגישה, ספציפית וחזקה עבור שתי מולקולה קטנה וquantitation חלבון 12-15,21. עם זאת, MRM יש מגבלות שלה. כדי להשיג סגוליות גבוה שיטת MRM צריכה להיות בנויה לכל המטבוליט. שיטה זו מורכבת מזיהוי שבר ספציפי ומתאימים אנרגיית התנגשות מותאמת, אשר דורשת מראש ידע של נכסrties של מטבוליטים של עניין, כגון מידע על מבנה כימי. לכן, עם כמה יוצאים מן הכלל הכולל אובדן הניטרלי של שברים נפוצים, לא ניתן לזהות מטבוליטים ידועים בשיטה זו.

בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה מכשירים (HRMS) כבר פורסמו, כגון סדרת LTQ-Orbitrap וExactive, QuanTof, וTripleTOF 5600 16-18,22. HRMS יכול לספק המוני לחייב יחס (m / z) של יוני שלם בשגיאה של כמה עמודים לדקה. לכן, מכשיר HRMS המופעל על ידי איתור כל היונים המבשר (כלומר מצב סריקה מלא) ניתן לקבל מידע מבני ישיר מהמסה המדויקת והרכב יסודות וכתוצאה מכך של אנליטי, ומידע זה יכול לשמש כדי לזהות מטבוליטים פוטנציאליים. ואכן, ניתן לקבל את כל המידע על מתחם עם מסה מדויקת, עד לרמה של איזומרים מבניים. כמו כן, מלאשיטת סריקה אינה דורשת ידע קודם של מטבוליטים ואינו דורשת אופטימיזציה של שיטה. יתר על כן, מאחר שניתן לנתח את כל היונים עם מ '/ z נופל לתוך טווח הסריקה, יש HRMS קיבולת בלתי מוגבלת כמעט במונחים של מספר מטבוליטים שניתן לכמת בטווח אחת בהשוואה לשיטת MRM. HRMS הוא גם דומה לMRM quadrupole משולש ביכולת כמותית בשל מחזור העבודה הקצרה וכתוצאה מכך מספר דומה של נקודות נתונים שניתן להשיג בטרשת נפוצה סריקה מלאה. לכן, HRMS מספק גישה חלופית לmetabolomics כמותית. לאחרונה, גרסה משופרת של HRMS מכונה ספקטרומטריית מסת Q-Exactive (QE-MS) יכול להיות מופעלת תחת המיתוג בין מצבים חיוביים ושליליים עם זמני מחזור מהיר מספיק בשיטה אחת, אשר מרחיבה את טווח הגילוי 19. כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו באמצעות metabolomics QE-MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת LC-MS ריאגנטים, הקמת שיטת כרומטוגרפיה, וקביעת נהלי הפעלה מכשיר

  1. הכנת ממסים LC
    1. הכן 500 שלבי מיליליטר ניידים. הוא אמוניום אצטט 20 מ"מ ו15 מ"מ אמוניום הידרוקסיד ב3% אצטוניטריל / מים, pH הסופי 9.0; ו-B הוא אצטוניטריל 100%.
    2. באופן רופף מכסה את הבקבוק, למקם אותו בsonicator אמבט מים, וsonicate עבור 10 דקות ללא חימום נוסף. (שלב זה הוא להבטיח שכל מלחי אמוניום מתמוססים לחלוטין ושאין בועות אוויר שיורית.)
    3. 250 מיליליטר העברת הממס לבקבוק זכוכית מיליליטר 250 לשימוש LC-MS, ולשמור את היתרה ב 4 ° C.
  2. הכן את פתרון כיול טווח מסה הנמוך. חשוב להשתמש בתערובת כיול טווח מסה נמוכה מותאמת אישית עבור יישומי metabolomics כדי להבטיח שהמונים מדויקים זוהו במשקל מולקולרי נמוך.
    1. שוקל 5 מ"ג של שני sodiאממ fluoroacetate וחומצת homovanillic ולפזר אותם לתוך 5 מיליליטר מים כדי להפוך את הריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. ממיסים diazinon במתנול כדי להפוך את הריכוז סופי של 10 מ"ג / מיליליטר.
    2. כדי להכין 1 מיליליטר של תמיסת כיול מסה נמוכה שלילית, לערבב 960 מיליליטר טרמו פתרון כיול שלילי עם 20 מיליליטר של fluoroaceate נתרן וחומצת פתרון homovanillic. כדי להפוך 1 מיליליטר של תמיסת כיול מסה נמוכה חיובית, לערבב 990 מיליליטר טרמו פתרון כיול חיובי ו10 מיליליטר פתרון diazinon. (פתרון כיול המסה הנמוכה צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס ולהיות מוכן טרי בכל 2 חודשים.)
  3. כיול של QE-MS בטווח מסה נמוכה
    1. לפני ביצוע כיול טווח מסה נמוך, לבצע כיול סטנדרטי מסה (m / z, 150-2,000) במצבים חיוביים ושליליים המבוססים על הוראות היצרן.
    2. ברגע שכיול מסה רגיל עובר, להתאים את טווח הסריקה ל60-900 מ '/ z בלוח הבקרה של המכשירוCID מקור 25 eV למצב חיובי ו35 eV למצב שלילי מיושם. (זה ייתן אותות חזקים של יון בר קפאין ויון סולפט. טווח הסריקה כאן הוא קבוע, כי מ '/ z האחרון לא צריך להיות גדול יותר מאשר 15x של m / z מתחיל)
    3. ברגע שמקור יון הוא יציב, ולאחר מכן לבצע את הכיול המותאם אישית. הערה: מקור יציב מוגדר כפחות מ -10% מהשונות יון הנוכחיות הכוללת במצב חיובי, ופחות מ 15% במצב שלילי. יוני הכיול המותאמים אישית ומתאים מ '/ z מופיעים בטבלה 1.
  4. להקים את מכשור LC-MS לניתוח המטבוליט קוטב. LC הוא מצמידים את QE-MS להפרדת המטבוליט וזיהוי.
    1. לצייד את QE-MS עם בדיקה מחוממת electrospray יינון (H-ESI). הגדר את הפרמטרים כוונון הרלוונטיים לבדיקה כפי שמופיעה ברשימה: טמפרטורת תנור, 120 מעלות צלזיוס; גז נדן, 30; גז עזר, 10; לטאטא גז 3,; לרסס מתח, 3.6 קילו וולט עבורמצב חיובי ו2.5 קילו וולט עבור מצב שלילי. הגדר את טמפרטורת נימים ב320 ° C, ו-S-עדשה ב55.
    2. לבנות שיטת סריקה מלאה כדלקמן: טווח מלא סריקה: 60-900 (m / z); רזולוציה: 70,000; זמן הזרקה מרבי: 200 אלפיות שני עם זמני הזרקה טיפוסיים סביב 50 אלפיות שניים; בקרה אוטומטית רווח (AGC): 3,000,000 יונים. הגדרות אלה יגרמו למחזור עבודה של כ 550 msec לבצע סריקות במצב חיובי ושלילי.
    3. להקים את שיטת כרומטוגרפיה. מעסיק עמודה אמיד (100 x 2.1 id מ"מ, מ"מ 3.5) להפרדת מתחם בטמפרטורת חדר 13,15. השלב הנייד הוא כפי שתואר לעיל, והשלב נייד B הוא אצטוניטריל. השתמש בשיפוע ליניארית כדלקמן: 0 דקות, 85% B; 1.5 דקות, 85% B, 5.5 דקות, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 דקות, 35% B, 14.5 דקות, 35% B, 15 דקות, 85% B, ו20 דקות, B. 85% קצב הזרימה הוא 0.15 מיליליטר / דקה 0-10 דקות ו15 ל20 דקות, ו0.3 מיליליטר / דקה 10.5-14.5 דקות.

2. Preparation של דוגמאות המטבוליט

  1. הכן ממס חילוץ. מערבבים 40 מיליליטר מתנול (כיתה LC-MS) ו10 מיליליטר מים (כיתה LC-MS) בצינור 50 מיליליטר, ולשמור אותו במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 לפני השימוש. הערה: הליך זה ואת הצעדים הבאים יכולים להיות שונה עבור החילוץ של רקמות ביולוגיות ודגימות נוזלים.
    1. 8 תאי HCT לסרטן מעי גס בתרבות בשלוש 10 מנות סנטימטר או 6 צלחות היטב עם מדיום גידול מלא, RPMI 1640 תוספת 10% חום בסרום שור עוברי מומת ו100,000 יחידות פניצילין / L ו100 סטרפטומיצין מ"ג / ליטר.
    2. כאשר תאים מגיעים למפגש 80%, להסיר במהירות בינונית, ומניח את הצלחת או צלחת על גבי 13,15 קרח יבשים. הוספת מיצוי 1 מיליליטר ממס באופן מיידי (80% מתנול / מים), ולהעביר את הצלחת למקפיא -80 מעלות צלזיוס. למנה 10 סנטימטר, להוסיף 3 מיליליטר של מיצוי בממסים היטב כל אחד. (נסה להסיר את המדיום ככל האפשר כדי למנוע את אפקט דיכוי יון בשל מלחים שיורית מבינוני.)
    3. השאר את הצלחת ל15 דקות. הסר אותו מהמקפיא, ומגרד תאים לתוך הממס על קרח יבש. מעביר את הפתרון ל1.7 צינורות מיליליטר Eppendorf, ו צנטריפוגות עם המהירות של 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. (הכן מטבוליטים תא משלוש מנות נפרדות כדי להפוך את שלוש דגימות לשכפל. המטרה של שמירה על שני צינורות היא שיש אחד כגיבוי).
    4. מעביר את supernatant לשני צינורות Eppendorf חדשים, ולייבש אותם בחלל ריק במהירות. זה לוקח בערך 3-6 שעות בהתאם לוואקום במהירות בשימוש. (יכולות להיות גם מיובשים דגימות לילה מתחת לגז חנקן.)
    5. לאחר צינורות הייבוש, חנות של כל דגימה ב-80 ° C במקפיא. כאשר מוכן, מחדש דגימה אחת ל20 מיליליטר מים (כיתה LC-MS), ולהזריק 5 מיליליטר לLC-QE-MS לניתוח.

3. הגדרה של רצף לדוגמא

  1. לאחר הכיול בוצע כראוי על QE-MS, לאזן עמודת LC למשך 5 דקות עם 85% בזרימהשיעור 0.15 מיליליטר / דק ', המהווה את המצב ההתחלתי של שיפוע LC.
  2. הגדר את רצף המדגם בסדר אקראי. הערה: בדרך זו, שהיא מחלקת התנודות הוצגו על ידי LC-MS לכל דגימה ומבטיחה השוואה מדויקת יותר בין מדגמים שונים. כל 6 דגימות, להוסיף ריצה לשטוף, אשר המניות באותה שיטת MS, למעט שיפוע LC הוא 95% עבור 10 דקות ואחריו איזון עמודה 5 דקות ב85% בקצב זרימה של 0.15 מיליליטר / דקה. להוסיף דגימות ריקות (100% מים) אחרי כל הסיבוב לשטוף להעריך את הרקע של המערכת ולשאת מעל הרמות.
  3. שמור את הרצף וברגע שעמודת LC תערוכות לחץ יציב, סביב 400 psi, להתחיל את ריצת הרצף. אם אין דוגמא אחרת להפעלה לאחר רצף זה, ולאחר מכן להוסיף ריצה להפסיק בסופו של הרצף, שבו יש קצב זרימה של 0 מיליליטר / דקה בסוף השיפוע ולבחור "המתנה" לאחר שסיים את רצף.
  4. להפעיל מחדש את אותו המדגם להגדיר שעות 12 לאחר כיול. (I זהים להעריך את תנודות השגיאה ההמונית לאחר כיול).

4. הודעה ניתוח כלי ניקוי ותחזוקה

  1. בסופו של רצף, לשטוף את העמודה עם 95% בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר / דקה במשך 2 שעות, ואם יש צורך, להפוך את העמודה לפני הכביסה.
  2. הסר את עמודת LC ולהתחבר ישירות לLC יון המקור על ידי איגוד. הכן את חומרי ניקוי, מים / מתנול / חומצה פורמית (v: v: v, 90:10:0.2), להגדיר MS במצב המתנה, ומערכת השטיפה LC-MS בקצב זרימה של 0.1 מיליליטר / דקה במשך שעה 1 כדי להסיר שיורי זירז מלחים או זיהומים אחרים. מנמיכים את קצב הזרימה אם יש לחץ במערכת יותר מדי.
  3. הגדר את טמפרטורת נימים על 50 מעלות צלזיוס, ולהסיר את כלוב היונים. מוציא בזהירות את קונוס לטאטא יון וצינור העברת יון לאחר טמפרטורת הנימים יורדת ל 50 ° C. השתמש ברשת מחוספס, כמו נייר זכוכית, כדי להסיר זיהומים שנשארו על פני השטח של חרוט לטאטא יון.
  4. הנח את העברת יוןצינור לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר מכיל 10 מיליליטר 90% מים / מתנול עם 0.1% חומצה פורמית. לאחר sonicating הצינור בsonicator אמבט מים עבור 20 דקות, למזוג הממס בפנים, תחליף אותו במתנול הטהור 10 מיליליטר וsonicate עוד 20 דקות. (במידת צורך, sonication ניתן לעשות ב-C ° 40 או טמפרטורה גבוהה עוד יותר כדי להשיג תוצאות ניקוי טובות יותר.)

5. ניתוח של LC-MS נתונים

  1. כדי להבטיח את רצף המדגם פועל בצורה חלקה, לאחר שסיים את שתי הדגימות הראשונות ברצף, בדוק פסגות למטבוליטים לא ידועים. השתמש בקובץ CSV רישום שמות המטבוליט, נוסחה כימית ניטראלית ומצב זיהוי (חיובי או שלילי), כקובץ הקלט וקובץ הפלט מכיל פסגות חילוץ וטעייה המונית בעמודים לדקה. אם צורת השיא היא חריגה או השגיאה ההמונית כבויה יותר מ 5 עמודים לדקה, ולאחר מכן את שאר הרצף שחייב להיפסק ופתרון בעיות שצריך לעשות.
  2. בחר את השיטה "יישור שיאומיצוי מסגרת "על תוכנה זמינה באופן מסחרי. בחר נתונים גולמיים מLC-MS ולקבץ אותם. לאסוף דגימות באמצע הרצף הארוך כמו לדוגמא התייחסות כרומטוגרפיה ליישור שיא. העלה זרע מסגרת כולל מטבוליטים ידועים לניתוח הממוקד מטבוליטים עם הנתונים שנאספו ואת זרע המסגרת המתאימה.
  3. לבצע ניתוח נתונים במצב חיובי ושלילי בנפרד. השתמש בהגדרת ברירת המחדל עבור פרמטרים נוספים. כבה את פונקציית החיפוש באתר ולהפעיל את זרימת העבודה. לייצא את הנתונים מעובדים כגיליון Excel המכיל אזור שיא של כל מסגרת. ערכות הראשונות של מסגרות מתאימות למטבוליטים ברשימה הממוקד. הערה: לניתוח המטבוליט ממוקד, מידע מטבוליטים מתקבל על סמך המחקרים הקודמים 13,15.
  4. לניתוח המטבוליט לא ממוקד, לבחור את השיטה של ​​"מיצוי רכיב". טען דגימות ריקות לחיסור רקע. סף שנקבע על שיא עוצמהלא 10 5, רוחב מ '/ z של 10 עמודים לדקה ויחס אות לרעש של 3.
  5. השתמש במסד נתוני metabolome אנושי לזיהוי תרכובות ידועות. שימוש במסנן קורות חיים כדי להסיר את הרכיבים עם קורות חיים גדולים בתוך דגימות לשכפל. באופן ידני לעבור כל רכיב ולבחור את אלה עם שיא מוגדר היטב או הבדל גדול יחסית בסוגי מדגמים שונים לחיפוש באתר. נתוני יצוא עם להיטים במסד נתונים. (יישור שיא יכל לעקוף אם ציון יישור השיא הוא נמוך מדי.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דיוק נתוני metabolomics מאוד תלוי בביצועי מכשיר LC-QE-MS. כדי להעריך אם המכשיר פועל במצב טוב, והאם השיטה מיושמת היא ראויה, כמה פסגות LC מטבוליט הידוע המחולצים כרומטוגרפיה יון הכוללת (TIC), כפי שמוצגים באיור 1. מטבוליטים פולאר, כוללים חומצות אמינו, חומרי ביניים גליקוליזה , ביניים TCA, נוקלאוטידים, ויטמינים, ה-ATP, NADP + וכן הלאה יש שמירה טובה על צורות העמודה ושיא טוב בעמודה אמיד בתנאי LC הנוכחיים. בינתיים, במבחן שגיאה המונית נעשה בתוך 24 שעות לאחר כיול מסה נמוך, כפי שמודגם באיור 2. 6 ריכוזים שונים של דגימות בשלושה עותקים מנוהלים פעמיים לאחר כיול, ואת טווח הזמן כולו מכסה כמעט 24 שעות. השגיאה ההמונית נבחנת על ידי השוואה מ '/ z זוהה למ' / z התיאורטי של מטבוליטים ממוקדים. כאן יש לי מטבוליטים הממוקדים m / zהחל 74 (גליצין) ל744 (NADP +). ציר Y כאן מייצג את האחוז המצטבר של מטבוליטים בטווח שגיאת מסה מסוים. העקומה הכחולה מראה את התוצאה 0-12 שעה, ואילו העקומה בצבע אדום מציגה את הנתונים שנאספו 12-24 שעה. איור 2 עולה בבירור כי יותר מ 90% של מטבוליטים הם בתוך 5 שגיאה המונית עמודים לדקה, מה שאומר שמסה הנמוכה שיטת כיול הטווח שפותחה כאן היא מספיק כדי לשמור על שגיאה המונית 5 עמודים לדקה לזיהוי טווח מסה נמוך.

נושא נוסף שיש לדון בה הוא הרגישות של המכשיר עם השיטה הנוכחית והתקנת מכשיר. דילול סדרתי של דגימות שלושה עותקים מ10 סנטימטר צלחת פטרי נעשה 5 פעמים עם גורם לדילול של 6, עד הסוף עם 6 ריכוזים שונים של דגימות. דוגמאות אלו מייצגות את כמות המטבוליטים מופקים 10 7, 1.67 x 10 6, 2.78 x 10 5, 4.63 x 10 4, 7.72 x 10 3, ו1.29x 10 3 תאים, בהתאמה. מאז כל ריכוז של מדגם מוכן בשלושה עותקים, בסך הכל 18 דגימות מנותחים בLC-QE-MS. רשימה ממוקדת משמשת כדי להעריך את מספר מטבוליטים שזוהו לשונה ריכוז של מדגם. התוצאה באיור 3 עולה כי המספר האופטימלי של מטבוליטים ממוקדים זוהו הוא בין 2.78 x 10 5 ו1.67 x 10 6 תאים, ואילו 1 x 10 7 תאים נותנים מספר קטן יותר של מטבוליטים שזוהו, אשר בשל השפעות דיכוי יון. תוצאה זו מצביעה על כך שהכמות האופטימלית של תאים כדי לחלץ בניתוח זה היא בערך זה של באר בצלחת 6 באר.

לניתוח המטבוליט לא ממוקד, חיתוך קורות חיים של 20% וערך עוצמה ממוצע של 10 7 משמשים כדי לסנן את טבלת הרכיבים. ערכי סף אלה נוקשה קורות חיים ועוצמה ממוצעת המשמשים למטרת הפגנה זו. כדי לשפר את שחזור, ערכי סף קורות חיים יכולים להיותמוגבר (לדוגמא, 30%) ואילו את ערכי העצמה הממוצע צריכים להיות ירידה (לדוגמא, 10 5) לכלול יותר פסגות. לאחר בדיקה ידנית פסגות, רכיבים עם צורות טובות נבחרים וחיפשו באתר metabolome האנושי. התוצאות מוצגות בטבלה 2. טבלת 2 א מפרט את התוצאות מנתונים שנאספו במצב חיובי, ואילו שולחן 2B מראה את התוצאות ממצב שלילי. חלק מהמטבוליטים שזוהו כאן חפיפה עם מטבוליטים ברשימה הממוקד, כגון גלוטתיון, פרולין וכן הלאה, אבל בינתיים, מטבוליטים נוספים נעדרו מהרשימה הממוקדות נחקרים, כגון methyglyoxal, אשר ניתן להפיק מן גליקוליזה, ו1 -Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine, אשר זוהה בחיובי עם זמן שמירה של 3.2 דקות, שהוא שמירה סבירה לפוספוליפידים בעמודה אמיד. פרוטוקול על בסיס הנתונים חיפוש המטבוליט לא ממוקד כבר יחסי ציבורדיווח eviously 20.

איור 1
איור 1. דוגמאות של פסגות כרומטוגרפיה LC-MS. הנה, כרומטוגרפיה המשוחזרת נוצרה עם חלון המוני של 10 עמודים לדקה (m / z ± 5 עמודים לדקה). ציר ה-X מראה את זמן השמירה, ואילו ציר Y מציג את העצמה היחסית, ועוצמת השיא מופיעה מעל כל המטבוליט. מראה פסגות זוהו ממצב חיובי, ואילו ב 'מראה פסגות ממצב שלילי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. 60;. הערכת כיול טווח מסה נמוך ציר Y הוא האחוז המצטבר של מטבוליטים עם שגיאת זיהוי המוני בתוך 5 עמודים לדקה. ציר ה-X הוא טווח השגיאה ההמונית בעמודים לדקה. עקומות כחולים ואדומות מייצגות 0-12 שעות ו12-24 שעות, בהתאמה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
. איור 3 הערכה של כמות מדגם -. מספר מטבוליטים הממוקדים זוהו לעומת מספר HCT 8 תאי ריבועים אדומים מייצגים מטבוליטים שזוהו במצב חיובי, עיגולים כחולים מתכוונים המטבוליטים נמדדו במצב שלילי, והמשולשים השחורים הם מספרים הכולל של מטבוליטים משני מצב חיובי ושלילי. ציר ה-X מציג את מספר תאי HCT 8.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

<td> NA
תקנים M / ת, מצב חיובי M / ת, מצב שלילי נוסחה ניטראלית מסה ניטראלית
n-Butylamine 74.096425 NA C 4 H 11 N 73.089149
בר קפאין 138.066188 NA C 6 H 8 N 3 O 137.058912
קפאין 195.087652 NA C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
Diazinon 305.108329 NA 12 C H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
פפטיד MRFA 524.264966 23 C H 37 N 7 O 5 S 523.25769
Fluoroacetate N / 77.004432 2 C H 3 FO 2 78.011708
סולפט N / 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
חומצת Homovanillic N / 181.050634 C 9 H 10 O 4 182.05791
סולפט dodecyl N / 265.147906 12 C H 26 SO 4 266.155182
Taurocholate N / 514.2844 26 C H 45 NO 7 S 515.291676

טבלת 1. סטנדרטים נמוך טווח מסת כיול וm / z המדויק שלהם.

<td> 131.05901
CSID שם נוסחה Monoisotopic המוני חיפוש מיסה שגיאה (עמודים לדקה) RT (דקות)
234 בטא אלאנין 3 C H 7 NO 2 89.04800 89.04805 0.62 8.08
1057 Sarcosine 3 C H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
5735 אלנין 3 C H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
568 קריאטינין C 4 H 7 N 3 O 113.05900 113.05889 1.00 4.41
128,566 פרולין 5 C H 9 NO 2 115.06333 115.06338 0.41 7.54
6050 L-(+)-valine C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
7762 אני ניטריט העמילן C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
135 חומצה ולריו 5-אמינו C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
242 trimethylglycine C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
911 Niacinamide C6H6N2O 122.04800 122.04793 0.55 2.60
1091 Taurin 2 C H 7 NO 3 S 125.01466 125.01469 0.20 7.61
1030 חומצת hydroxycarboxylic Pyrroline 5 C H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
7127 PCA 5 C H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
90,657 N-Acryloylglycine 5 C H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
388,752 5-Oxo-D-prolin 5 C H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
389,257 3-hydroxy-3 ,4-חומצת Dihydro-2H-pyrrole-5-קרבוקסיליות 5 C H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
8031176 חומצת Pyrrolidonecarboxylic 5 C H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.03 8.51
5605 Hydroxyproline 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
7068 N-Acetylalanin 5 C H 9 NO 3 131.05824 5.83 8.08
79,449 Ac-עלא-OH 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
167,744 l--גמא semialdehyde גלוטמית 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
388,519 5-אמינו-2-oxopentanoic חומצה 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
134 חומצת aminolevulinic 5 C H 9 NO 3 131.05800 131.05901 </ Td> 7.70 8.08
9312313 3-הידרוקסי-L-פרולין 5 C H 9 NO 3 131.05800 131.05901 7.70 8.08
566 קריאטין 4 C H 9 N 3 O 2 131.06900 131.06905 0.36 8.08
5880 L-(+)-לאוצין C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
6067 L-(+)-איזולאוקין C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
19964 L-Norleucine C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96 </ Td>
388,796 בטא לאוצין C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
548 חומצת aminocaproic C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09455 3.48 6.96
6031 L-(-)-אספרגין 4 C H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05348 0.10 8.31
109 חומצת Ureidopropionic 4 C H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05348 3.71 8.31
6026 L-ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
64,236 D-ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
5746 גלוטמין C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
128,633 D-גלוטמין C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
141,172 חומצת Ureidoisobutyric C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
21436 N-מתיל-<scp> חומצת אספרטית D </ scp> 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
21814 D-- חומצה גלוטמית-() 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
30572 L-חומצה (+)-גלוטמית 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
58,744 N-Acetyl-L-סרין 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
5907 L-(-)-מתיונין C 5 H 11 NO 2 S 149.05106 149.05095 0.70 7.39
6038 היסטידין 6 C H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06940 0.48 8.33
5910 L-(-)-פנילאלנין C 9 H 11 NO 2 165.07898 165.07887 0.63 6.60
1025 פירידוקסין C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
4463 Oxidopamine [USAN: INN] C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
102,750 5 - (2-aminoethyl)-Pyrogallol C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
388,394 נוראפינפרין C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
6082 L-(+)-ארגינין C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
64,224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
780 heteroauxin 10 C H 9 NO 2 175.06300 175.06304 0.18 2.32
67261 אינדול -3-אצטאלדהיד,-5-הידרוקסי 10 C H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
3574185 אינדול-2-חומצה אצטית 10 C H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
5833 L-(-)-טירוזין C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
389,285 3-אמינו-3-חומצה (4 hydroxyphenyl-) propanoic C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
13628311 L-threo-3-phenylserine C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
425 4 הידרוקסי--4-(3-pyridyl) butanoic חומצה C 9 H 11 NO 3 181.07401 181.07378 1.25 7.48
13899 3 - חומצה אקרילית (1H-Indol-3-י.ל.) 11 C H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
10607876 חומצת Indoleacrylic 11 C H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
389,120 N6, N6, N6-trimethyl-L-ליזין C 9 H 20 N 2 O 2 188.15248 188.15221 1.45 10.87
388,321 5 "-S-מתיל-5"-thioadenosine 11 C H 15 N 5 O 3 S 297.08957 297.08898 2.00 2.56
144 9 - (5-S-מתיל-5-thiopentofuranosyl)-9h-purin-6-אמין 11 C H 15 N 5 O 3 S 297.09000 297.08898 3.43 2.56
111,188 גלוטתיון 10 CH 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08345 1.14 8.02

לוח 2 א.

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID שם נוסחה Monoisotopic המוני חיפוש מיסה שגיאה (עמודים לדקה) RT (דקות)
857 Methylglyoxal 3 C H 4 O 2 72.02100 72.02108 1.03 7.70
1057 Sarcosine 3 C H 7 NO 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
5735 אלנין 3 C H 7 NO 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
234 בטא אלאנין 3 C H 7 NO 2 89.04800 89.04747 5.93 8.19
55423 חומצת R-לקטית 3 C H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
61,460 חומצת Hydroxypropionic 3 C H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
96,860 L-חומצה (+)-לקטית 3 C H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
592 חומצה לקטית 3 C H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
650 Dihydroxyacetone 3 C H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
731 Glyceraldehyde 3 C H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
1086 חומצה גופרתית H 2 O 4 S 97.96738 97.96683 5.63 8.13
128,566 פרולין 5 C H 9 NO 2 115.06333 115.06302 2.67 7.78
1078 חומצת succinic 4 C H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
466,979 Erythrono-1 ,4-lactone C4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
4483398 g-lactone D-Erythronic 4 C H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
473 חומצת methylmalonic 4 C H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
8527138 (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H) ואחת 4 C H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
140,384 חומצת 2-ketocaproic C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
164,251 חומצת Methyloxovaleric C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
388,419 (3S)-2-3-oxopentanoic מתיל חומצה C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
46 -Oxo-B-methylvaleric חומצה C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
69 חומצת אלפא לketoisocaproic C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
134 חומצת aminolevulinic 131.05800 131.05795 0.36 8.19
9312313 3-הידרוקסי-L-פרולין 5 C H 9 NO 3 131.05800 131.05795 0.36 8.19
5605 Hydroxyproline 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
79,449 Ac-עלא-OH 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
167,744 l--גמא semialdehyde גלוטמית 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
388,519 5-אמינו-2-oxopentanoic חומצה 5 C H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
5880 L-(+)-לאוצין C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
6067 L-(+)-איזולאוקין C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
19964 L-Norleucine C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
388,796 בטא לאוצין C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
548 חומצת aminocaproic C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09419 6.18 7.09
109 חומצת Ureidopropionic 4 C H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05321 1.60 8.28
6031 L-(-)-אספרגין 4 C H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05321 2.21 8.28
6026 L-ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08961 1.98 10.36
64,236 D-ornithine C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08961 1.98 10.36
193,317 L-- חומצת מאלית () 4 C H 6 O 5 134.02153 134.02130 1.72 7.95
510 (±), חומצת מאלית 4 C H 6 O 5 134.02200 134.02130 5.25 7.95
133,224 חומצת threonic 4 C H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
388,628 חומצת 2,3,4-Trihydroxybutanoic 4 C H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
2061231 חומצת DL-erythronic 4 C H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
21436 N-מתיל-<scp> חומצת אספרטית D </ scp> 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
21814 D-- חומצה גלוטמית-() 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
30572 L-חומצה (+)-גלוטמית 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
58,744 N-Acetyl-L-סרין 5 C H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
6038 היסטידין 6 C H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06930 1.09 8.36
199 אלנטואין 4 C H 6 N 4 O 3 158.04401 158.04387 0.88 4.76
6082 L-(+)-ארגינין C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
64,224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
58,576 חומצת N-Acetyl-L-אספרטית 6 C H 9 NO 5 175.04807 175.04803 0.18 7.87
996 Pyrophosphoric חומצה P H 4 O 7 2 177.94299 177.94331 1.79 8.42
5589 גלוקוז C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17893 מנוז C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
58238 . Beta.-D-Glucopyranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
71,358 . Alpha.-D-Glucopyranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
134,838 3-deoxy-arabino-hexonic חומצה C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,332 L-Sorbopyranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,476 beta-D-galactopyranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,480 . Alpha.-D-Galactopyranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,775 beta-D-Fructofuranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
10239179 אינוזיטול C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
16736992 Cis-אינוסיטול C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216070 allose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216093 L-Sorbose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
201 hexopyranose C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
868 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
2068 תאופילין 7 C H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
4525 1,7-דימתיל-Xanthine 7 C H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
5236 תאוברומין 7 C H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
1161 חומצה האיזוציטרית 6 C H 8 O 7 192.02701 192.02704 0.15 8.18
305 Ciחומצת tric 6 C H 8 O 7 192.02699 192.02704 0.23 8.18
963 חומצה פנטותנית C 9 H 17 מס '5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
6361 D-חומצה פנטותנית C 9 H 17 מס '5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
960 חומצה פלמיטית 16 C H 32 O 2 256.23999 256.24000 0.05 1.73
111,188 גלוטתיון 10 C H 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08339 1.35 8.03
388,337 חומצת N-Acetylneuraminic 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392,681 N-אצטיל-alpha-neuraminic חומצה C 11 H 19 NO 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392,810 Neu5Ac חומצת sialic C 11 H 19 NO 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43

2B שולחן.

. טבלה 2 רשימה של מטבוליטים לא ממוקדים זוהו בHCT 8 תאים (2.78 x 10 5 תאי שקילות) 2A ולוח 2B כולל מידע מיצוי מרכיבים:. זמן שמירה, מ '/ z וטעייה המונית, ובינתיים, תוצאות חיפוש באתר: מזהה Chemspider ( CSID), שם, נוסחה, וכן הלאה. הנה דוגמאות ניתחו הן משוואותl למטבוליטים מופקים 2.78 x 10 5 תאים, ועל סף העצמה הוא 1 x 10 7, כדי למנוע תוצאה מייגע למטרת הפגנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר לפרופיל המטבוליט מוצלח בתאים תוך שימוש בפרוטוקול זה הם: 1) שליטה על מדיום הגידול והפקה מדוקדקת של התאים; 2) לשנות את שיטת LC מבוסס על שיטת התקנת MS, כדי להבטיח שיש מספיק (בדרך כלל לפחות 10 נקודות נתונים) על פני שיא כדי לכמת; 3) עושה כיול מסה נמוך לפני הפעלת דגימות; 4) הזרקה לא יותר מ 5 מיליליטר, כדי למנוע זמן שמירת הסטה והרחבת שיא הנגרמת על ידי מים; ו5) הכנה והפעלת דגימות להשוואה באותו אצווה כדי למזער את ההשפעות אצווה.

הסטנדרטים (טבלת 1) שנבחרה כאן לכיול טווח מסה נמוך ניתנים להחלפה. כל תרכובת ידועה עם m / z שנופל לתוך טווח הסריקה ההמונית, הוא התנהג יפה במקור H 'חדשות ארכיאולוגיות, והוא מסיס במים, מתנול, או אצטוניטריל הם מועמדים סבירים לתקני כיול. מומלץ מאוד כדי לאחסן את כל פתרונות כיולt 4 ° C כדי לייצב קפאין וגם כדי למזער את האידוי של מתנול או אצטוניטריל בפתרון הכיול, כך שביצועי הכיול יכולים להיות לשעתקו יותר. בהשוואה לטווח המוני רגיל, מ '/ z 150 ל 2,000, כיול טווח מסה נמוך שצריך לעשות בתדירות גבוהה יותר, לפחות פעם ביומיים.

זרימת עבודה זו, מממס חילוץ, ממס הכינון מחדש, שלב LC נייד, למסת כיול טווח נמוך ו-MS טווח סריקה עברה אופטימיזציה כדי למדוד מטבוליטים קוטב. זה כולל חומצות אמינו, אצטיל חומצות אמינו, חומרי ביניים מסלול גליקוליזה, nucleosides, ביניים מחזור TCA, חלק ביניים מסלול חילוף חומרים של אחד פחמן וכן הלאה. עם זאת, שינויים של פרוטוקול זה לכיתות אחרות של מטבוליטים, כגון קואנזים (CoA) מינים, folates, פוספוליפידים הם אפשריים. לדוגמא, תעודות מקוריות הן יציבים יותר בתנאים חומציים, ולכן התוספת של חומצה ל80% מתנול / מים תהיה מועילה לשדרגישות לנדוד CoA. כמו כן, תעודות מקוריות ושומנים נוטים להיות הרבה משקולות מולקולריות גדולות, ובכך טווח הסריקה מ '/ z צריך להיות מותאם 60-900 לטווח הראוי שיכסה מטבוליטים אלה.

אף שחלק מתוצאות החיפוש של מסד נתונים של רכיבים לא ממוקדות חפיפה עם הרשימה הממוקד, הוא עדיין בעל חשיבות לבנות רשימה ממוקדת זו בהתבסס על סדר עדיפויות המחקר. מאז מטבוליטים ברשימה הממוקד הם נמוכים יותר מסף העצמה הממוצע, מידע על מטבוליטים אלה יוסר במהלך עיבוד. הרשימה ממוקדת כוללת מידע בזמן שמירה, אשר נותן לנו ביטחון גבוה יותר לזיהוי המטבוליט ולכמת. יתרון נוסף אחד עם הגדרת QE-MS הוא שספקטרומטריית מסת טנדם יכולה לאפשר זיהוי נוסף של מטבוליטים.

נושא אחד הקשורים לזרימת עבודה זו הוא שinse מחט H-ESIRT הוא רגיש למליחות של הדגימות, כמו הרגישות תהיה בסכנה במידה רבה אם יש כמויות גבוהות של מלחים בלתי נדיף. לכן, תוכן מלח מזעור מדגימות, וניקוי שיגרתי של הטור ולהכניס מחט H-ESI יהיה מועיל כדי להבטיח נתונים באיכות טובה ולהגדיל את חייו של הטור.

לסיכום, פרוטוקול זה מעסיק LC-QE-MS לניתוח בהצלחה מטבוליטים קוטב מהתאים בתרבית, בצעדים מינימאליים מדגם הכנה ורכישת נתונים מהיר. ניתן לבצע שינויים קטנים בהכנת מדגם להשיג נתונים ממקורות ביולוגיים אחרים כגון סרום וברקמות. לדוגמא, מאז מתנול הטהור ניתן להוסיף סרום נוזלי יתווסף לבצע ריכוז מתנול סופי 80% להפקת מטבוליטים קוטב. לדגימות רקמה, נדרשים ערבוב וערבוב קפדני כדי להשיג יעילות מיצוי טובה יותר. בדרך כלל מיליליטר סרום 10 אורקמת 1 מ"ג היא מספיק לניתוח מטבוליטים. ניתן לנתח את הנתונים הגולמיים הן במצב ממוקד, אם יש מטבוליטים ידועים בדוגמאות, ובאופן בלתי ממוקד ואחרי חיפוש באתר HRMS. metabolomics מבוסס HRMS הוא עדיין בשלביה המוקדמים. להתקדמות בעתיד, טכניקות הניסוי יכולות להיות מותאמות יותר, מידע HRMS מטבוליט נוסף ודפוסי פיצול MS / MS יהיו אלגוריתמים מועילים ורלוונטיים, כגון יישור שיא, אינטגרציה שיא, אשכולות איזוטופ וכן הלאה, יכול לשפר את היעילות ודיוק של עיבוד נתונים. סופו של דבר, עם זאת, רבים מהשאלות שמעבדת הכתובות שלנו בחילוף חומרים מוגבלות על ידי פרשנות מדוקדקת של נתונים לאחר העיבוד. עם טכניקות metabolomics בקנה מידה גדולה אלה, אנו מוגבלים לעתים קרובות על ידי הפרשנות של הנתונים וההערכה של השערות שנוצרו שלנו. לכן, כל ניסויי metabolomics צריכים להיות מנוסחים סביב שאלות ספציפיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר דטלף שומאן, ג'ניפר סאטון (תרמו פישר סיינטיפיק) ונתנאל סניידר (אוניברסיטת פנסילבניה) לדיונים חשובים בכיול מסה ועיבוד נתונים. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס R00CA168997. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2, (3), 155-168 (2001).
  2. Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30, (12), 1176-1178 (2012).
  3. Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9, (8), 772-773 (2012).
  4. Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292, (5518), 929-934 (2001).
  5. Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76, (6), 1738-1745 (2004).
  6. Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77, (17), 5635-5642 (2005).
  7. Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78, (13), 4430-4442 (2006).
  8. Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80, (1), 115-122 (2008).
  9. Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
  10. Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (5), 2708-2713 (2002).
  11. Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (14), 8235-8240 (1999).
  12. Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877, (13), 1229-1239 (2009).
  13. Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11, (6), 10-1074 (2012).
  14. Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (14), 5860-5865 (2007).
  15. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7, (5), 872-881 (2012).
  16. Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46, (6), 595-601 (2011).
  17. Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82, (8), 3212-3221 (2010).
  18. Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11, (3), 10-1074 (2012).
  19. Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10, (9), (2011).
  20. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
  21. Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6, (8), 3291-3303 (2007).
  22. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5, (6), 1005-1018 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats