Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
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Biology

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Summary

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

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Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

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Abstract

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. No entanto, as plataformas atuais têm diferentes fatores limitantes, como o trabalho intensivo preparações de amostra, baixos limites de detecção, velocidades de varredura lenta, otimização de método intensivo para cada metabólito, e a incapacidade de medir tanto positivamente e íons negativamente carregados em experiências individuais. Portanto, um protocolo de metabolômica novela poderia avançar estudos metabolômica. Cromatografia hidrófilo à base de amida permite análise de metabolitos polares sem qualquer transformação química. MS de alta resolução usando o Q-Exactive (QE-MS) melhorou óptica de íons, o aumento da velocidade de varredura (256 ms na resolução 70.000), e tem a capacidade de realizar comutação positivo / negativo. Usando uma estratégia de extracção de metanol frio, e o acoplamento de uma coluna de amida com QE-MS permite a detecção robusta de 168 metabolitos polares alvo e milhares de características adicionais simultaneamente. Datum tratamento é realizado com um software comercialmente disponível de uma maneira altamente eficiente, e características desconhecidas extraídos a partir dos espectros de massa pode ser consultado na base de dados.

Introduction

Metabolomics, definido como um ensaio que mede vários metabolitos simultaneamente, tem sido uma área de grande interesse. Metabolomics fornece uma leitura direta da fisiologia molecular e forneceu insights sobre o desenvolvimento e doenças como o câncer de 1-4. Ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) estão entre os mais utilizados instrumentos 5-9. RMN, especialmente foi usado para experiências de fluxo desde que os compostos marcados de isótopos pesados, tais como 13 C metabolitos marcados, são RMN-activo 10,11. No entanto, esta estratégia requer relativamente elevado grau de pureza da amostra e grande quantidade de amostra, o que limita as suas aplicações em metabolômica. Enquanto isso, os dados recolhidos a partir de RMN precisa de análise intensiva e atribuição composto de espectros de RMN complexo é difícil. GC-MS tem sido amplamente utilizada para os metabolitos polares e estudos de lípidos, mas requer os composto volátilds e, portanto, muitas vezes derivação de metabólitos, o que às vezes envolve química complexa que pode ser demorado e introduz ruído experimental.

Cromatografia líquida (LC) acoplada à espectrometria de massa triplo quadrupolo utiliza o primeiro quadrupolo para selecionar os íons pais intactos, que são fragmentados no segundo quadrupolo, enquanto o terceiro quadrupolo é usado para selecionar fragmentos característicos ou íons filha. Este método, que registra a passagem de íons de pais para filha íons específicos, é denominado de monitoramento de reações múltiplas (MRM). MRM é um método muito sensível, específico e robusto tanto para pequenas moléculas e quantificação de proteínas 12-15,21. No entanto, MRM tem suas limitações. Para alcançar alta especificidade um método MRM precisa ser construído para cada metabólito. Este método consiste na identificação de um fragmento específico de energia de colisão e optimizado, o que requer conhecimento prévio do prope correspondentesrties dos metabólitos de interesse, tais como informações de estrutura química. Portanto, com algumas excepções que envolvem a perda neutra de fragmentos comuns, não é possível identificar metabolitos desconhecidos com este método.

Nos últimos anos, a espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) instrumentos foram lançados, como a série LTQ-Orbitrap e Exactive, o QuanTof e TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS pode proporcionar um rácio de massa para carga (m / z) de iões intactas dentro de um erro de poucos ppm. Portanto, um instrumento HRMS operado pela detecção de todos os iões de precursor (ou seja, modo de varrimento completo) pode obter informação estrutural directa da massa exacta e a composição elementar resultante da substância a analisar, e esta informação pode ser usada para identificar possíveis metabolitos. Com efeito, todas as informações sobre um composto pode ser obtido com uma massa exacta, até o nível de isómeros estruturais. Além disso, um completométodo de verificação não requer conhecimento prévio de metabólitos e não requer método de otimização. Além disso, uma vez que todos os íons com m / z cair na faixa de varredura pode ser analisado, HRMS tem uma capacidade quase ilimitada em termos de número de metabólitos que podem ser quantificados em uma única corrida em comparação com o método MRM. HRMS é também comparável ao de um MRM quadrupolo triplo da capacidade quantitativa devido ao ciclo de trabalho curto, resultando num número comparável de pontos de dados que podem ser obtidos de uma análise completa do MS. Portanto, HRMS proporciona uma abordagem alternativa para o metaboloma quantitativos. Recentemente, uma versão melhorada do HRMS denominada espectrometria de massa Q-Exactive (QE-MS) pode ser operado sob a comutação entre os modos positivos e negativos com tempos de ciclo suficientemente rápido em um único método, o que amplia o alcance de detecção 19. Aqui nós descrevemos a nossa estratégia metabolômica usando o QE-MS.

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Protocol

1. Preparação de LC-MS Reagentes, Estabelecimento de um método de cromatografia, e estabelecimento de procedimentos operacionais de instrumentos

  1. Preparação de solventes LC
    1. Prepare 500 ml fases móveis. A é acetato de amónio 20 mM e 15 mM de hidróxido de amónio em 3% de acetonitrilo / água, pH final de 9,0; e B é 100% de acetonitrilo.
    2. Vagamente tampar a garrafa, coloque-o em um banho de água sonicador e sonicate por 10 minutos sem aquecimento extra. (Este passo é o de assegurar que todos os sais de amónio e dissolver completamente que não há bolhas de ar residual.)
    3. Transferir 250 ml de solvente a uma garrafa de 250 ml de vidro para uso LC-MS, e manter o restante a 4 ° C.
  2. Prepare a solução de calibração gama baixa massa. É importante a utilização de uma mistura de calibração de gama baixa massa personalizado para aplicações metabolómicos para assegurar que as massas exactas são detectados com pesos moleculares baixos.
    1. Pesar 5 mg de ambos Sodihum fluoroacetato e ácido homovanilico e dissolvê-los em 5 ml de água para fazer uma concentração final de 1 mg / ml. Dissolver em metanol diazinon para fazer uma concentração final de 10 mg / ml.
    2. Para preparar 1 ml de solução negativa baixa calibragem massa, misture 960 ml de solução de calibração térmica negativa com 20 ml de fluoroaceate sódio e solução de ácido homovanílico. Para fazer com que 1 ml de solução positiva baixa calibragem massa, misture 990 ml de solução de calibração termo positivo e 10 ml de solução diazinon. (A solução de calibração de baixa massa deve ser armazenada a 4 ° C e ser preparado fresco a cada 2 meses.)
  3. Calibração de QE-MS em uma missa Gama Baixa
    1. Antes de realizar a calibração de baixa faixa de massa, efectuar uma calibração de massa padrão (m / z, 150-2,000) nos modos positivos e negativos com base em instruções do fabricante.
    2. Uma vez que uma massa de calibração normal passa, ajustar o intervalo de varredura de 60-900 m / z no painel de controle do instrumentoe uma fonte de CID de 25 eV no modo positivo e de 35 eV no modo negativo é aplicado. (Isto dará sinais consistentes de ião fragmento cafeína e o ião sulfato. O intervalo de varrimento aqui é fixo, porque a última m / z não deve ser maior do que a 15x da partida m / z)
    3. Uma vez que a fonte de íons é estável, em seguida, realize a calibragem personalizado. Nota: Uma fonte estável é definida como inferior a 10% da variação de corrente total de iões no modo positivo, e menos do que 15% em modo negativo. Os iões de calibração correspondendo à medida e m / z são indicados na Tabela 1.
  4. Estabelecer a instrumentação LC-MS para análise metabólito polar. LC é acoplado a um QE-MS para separação e detecção de metabolito.
    1. Equipar o QE-MS com uma sonda de ionização electrospray aquecida (H-ESI). Defina os parâmetros de ajuste relevantes para a sonda, conforme listado: temperatura do aquecedor, 120 ° C; gás bainha, 30; gás auxiliar, 10; varrer a gás, 3; pulverizar tensão, 3,6 kV paramodo positivo e 2,5 kV para o modo negativo. Ajuste da temperatura de capilar a 320 ° C, e S-lente a 55.
    2. Construir um método de varredura completa da seguinte forma: faixa de varredura completa: 60 a 900 (m / z); resolução: 70.000; tempo máximo de injeção: 200 ms com tempos típicos de injeção de cerca de 50 ms; controle automático de ganho (AGC): 3.000.000 íons. Essas configurações resultar em um ciclo de trabalho de cerca de 550 ms para a realização de exames em modo positivo e negativo.
    3. Estabelecer o método de cromatografia. Empregar uma coluna de amida (100 x 2.1 mm id, 3.5 mm) para separação de compostos à temperatura ambiente 13,15. A fase móvel A é como descrito acima, e a fase móvel B é acetonitrilo. Usar um gradiente linear como se segue: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% de B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% B e 20 minutos, 85% de B. O caudal é de 0,15 ml / minuto, desde 0 até 10 minutos e 15 a 20 min, e 0,3 ml / min, 10,5-14,5 min.

2. Preparation de Amostras metabólito

  1. Preparar um solvente de extracção. Misturar 40 ml de metanol (LC-MS grau) e 10 ml de água (LC-MS grau) em um tubo de 50 ml, e mantê-lo no freezer -80 ° C durante pelo menos 1 hora antes da utilização. Nota: O procedimento e os passos que se seguem podem ser modificadas para a extracção do tecido biológico e amostras de fluidos.
    1. HCT cancro do cólon 8 Cultura de células em três placas de 10 cm ou de placas de 6 poços, com meio de crescimento completo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino e 100.000 unidades / L de penicilina e 100 mg / L de estreptomicina.
    2. Quando as células chegar a 80% de confluência, remover rapidamente o meio e coloque o prato ou prato em cima de 13,15 gelo seco. Adicionar 1 ml de solvente de extracção imediatamente (80% de metanol / água), e transferir a placa para a -80 ° C congelador. Para uma placa de 10 cm, adicionar 3 ml de solvente de extracção para cada poço. (Tentar remover o meio, tanto quanto possível, para evitar o efeito de supressão de iões devido aos sais residuais do meio.)
    3. Deixar a placa durante 15 min. Retire-o do freezer, e raspar as células para o solvente em gelo seco. Transferir a solução de 1,7 ml de Eppendorf e centrifuga com a velocidade de 20.000 xg, a 4 ° C durante 10 min. (Preparar metabólitos celulares a partir de três pratos separados para fazer três amostras idênticas. A finalidade de manter dois tubos é ter um como um backup.)
    4. Transferir o sobrenadante para dois novos tubos Eppendorf, e secá-las sob vácuo velocidade. Isto leva cerca de 3-6 horas, dependendo da velocidade de vácuo utilizado. (As amostras também podem ser secas durante a noite sob atmosfera de azoto.)
    5. Após a secagem, armazenamento de tubos de cada amostra no freezer -80 ° C. Quando pronto, reconstituir uma amostra em 20 ml de água (LC-MS grau), e injectar 5 ml de LC-QE-MS para análise.

3. Configuração de Sequência Amostra

  1. Uma vez que a calibração foi corretamente realizado na QE-MS, equilibrar coluna LC por 5 min com 85% de A a um fluxotaxa de 0,15 ml / min, o que é a condição inicial do gradiente LC.
  2. Configure a seqüência de amostra, de forma aleatória. Nota: Neste modo, que distribui as flutuações introduzidas por LC-MS para cada amostra e garante comparação mais precisa entre as diferentes amostras. Cada 6 amostras, adicionar uma corrida de lavagem, o qual partilha o mesmo método de MS, excepto o gradiente de LC é de 95% de A durante 10 min e seguido de uma coluna de equilíbrio de 5 minutos a 85% A com uma taxa de fluxo de 0,15 ml / min. Adicionar amostras em branco (100% de água) após cada corrida lavagem para avaliar o ambiente do sistema e transitar níveis.
  3. Salve a sequência e uma vez que a coluna LC mostra a pressão estável, em torno de 400 psi, iniciar a seqüência de execução. Se não há outro exemplo é para ser executado após esta sequência, em seguida, adicionar uma corrida de paragem no fim da sequência, que tem uma taxa de fluxo de 0 ml / min, no fim do gradiente e escolha de "espera", após terminar a seqüência.
  4. Re-executar a mesma amostra definida 12 horas após a calibração. (Esta is para avaliar a variação de massa de erro após a calibração.)

4. Publicar Análise Instrumento de Limpeza e Manutenção

  1. No final da sequência, lava-se a coluna com 95% de A a uma taxa de fluxo de 0,2 ml / min, durante 2 horas, e, se necessário, inverter a coluna antes da lavagem.
  2. Remova a coluna LC e se conectar diretamente a LC à fonte de íons por um sindicato. Preparar um solvente de limpeza, / metanol / ácido fórmico água (v: v: v, 90:10:0.2), definido de MS em modo de repouso, e um sistema de lavagem de LC-MS, a uma taxa de fluxo de 0,1 ml / min durante 1 hora para remover o precipitado residual sais ou outras impurezas. Abaixe a taxa de fluxo, se houver pressão do sistema muito.
  3. Ajuste da temperatura de capilar a 50 ° C, e retirar a gaiola de iões. Retire cuidadosamente o cone de varredura de íons e do tubo de transferência de íons após a temperatura capilar cai para 50 ° C. Use uma malha grosseira, tal como lixa, para remover as impurezas deixadas sobre a superfície do cone de varrimento de iões.
  4. Coloque a transferência de iõestubo dentro de um tubo Falcon de 15 ml contendo 10 ml de água 90% / metanol com ácido fórmico a 0,1%. Depois de sonicação o tubo num banho de água de ultra-sons durante 20 minutos, decanta-se o solvente no interior, substituí-la com 10 ml de metanol puro e sonicar durante mais 20 minutos. (Se necessário, a sonicação pode ser feito a 40 ° C ou mesmo uma temperatura mais elevada para obter melhores resultados de limpeza.)

5. Análise de LC-MS de Dados

  1. Para garantir a seqüência de amostra é executado sem problemas, depois de terminar as duas primeiras amostras na seqüência, verificar picos de metabolitos desconhecidos. Use um arquivo csv listando nomes metabólito, fórmula química neutra e modo de detecção (positivo ou negativo), como o arquivo de entrada eo arquivo de saída contém picos extraídos e erro em massa em ppm. Se a forma do pico é anormal ou o erro de massa é desligado por mais do que 5 ppm, em seguida, o resto da sequência deve ser parado e solução tem de ser feito.
  2. Escolha o método de "alinhamento de picoe extração frame "em software disponível comercialmente. Selecione os dados brutos de LC-MS e agrupá-los. Escolha amostras no meio da seqüência de execução como amostra de referência de cromatografia para o alinhamento de pico. Envie uma semente quadro incluindo metabólitos conhecidos para a análise metabólitos alvejado com dados coletados e as sementes quadro correspondente.
  3. Realizar análise de dados em modo positivo e negativo separadamente. Use a configuração padrão para outros parâmetros. Desligue a função de pesquisa de banco de dados e executar o fluxo de trabalho. Exportar os dados processados ​​como uma folha de excel, contendo a área do pico de cada frame. Os primeiros conjuntos de quadros correspondem aos metabolitos na lista alvo. Nota: Para uma análise metabolito alvo, a informação metabolitos é obtido com base nos estudos anteriores 13,15.
  4. Para uma análise metabólito não segmentados, escolha o método de "extração de componente". Carregar amostras em branco para o fundo subtração. Definir pico intensidade do limiar de umt 10 5, a largura m / z de 10 ppm e a relação sinal-ruído de 3.
  5. Utilizar dados metaboloma humano para a identificação de compostos desconhecidos. Use um filtro de CV para remover os componentes com grandes currículos dentro de amostras idênticas. Ir manualmente através de cada componente e escolher aqueles com pico bem definido ou relativamente grande diferença em amostras de diferentes tipos de pesquisa de banco de dados. Exportar dados com acessos em banco de dados. (Alinhamento Peak pode ser contornado se a pontuação alinhamento de pico é muito baixa.)

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Representative Results

A precisão dos dados metabolômica altamente depende do desempenho do instrumento LC-QE-MS. Para avaliar se o instrumento está a funcionar em boas condições, e se o método aplicado é adequado, vários picos LC metabolitos conhecidos são extraídos a partir da cromatografia iónica total de (TIC), como mostrado na Figura 1. Metabolitos polares, incluindo aminoácidos, intermediários glicólise , intermediários de TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, NADPH e assim por diante têm uma boa retenção na coluna e as formas bom pico na coluna amida sob condições correntes de LC. Enquanto isso, um teste de erros de massa é feito dentro de 24 horas após a calibração de massa baixa, como ilustrado na Figura 2. 6 concentrações diferentes de amostras, em triplicado, são executadas duas vezes após a calibração, e todo o intervalo de tempo cobre quase 24 horas. O erro de massa é avaliada comparando a m / z detectado ao teórico m / z de metabolitos segmentados. Aqui os metabólitos alvo têm um m / zvariando de 74 (glicina) a 744 (NADP +). O eixo Y representa aqui o percentual acumulado de metabólitos dentro de certa margem de erro de massa. A curva azul mostra o resultado 0-12 h, enquanto a curva de cor vermelha mostra os dados coletados 12-24 horas. Figura 2 indica claramente que mais de 90% dos metabolitos são dentro de 5 ppm em massa de erro, o que significa a baixa massa método de calibração gama desenvolvido aqui é suficiente para manter a massa de erro de 5 ppm para detecção de faixa de massa.

Outra questão a ser abordada é a sensibilidade do instrumento com o método atual e configuração do instrumento. A diluição em série de amostras em triplicado a partir de 10 centímetros placa de Petri foi realizada cinco vezes, com um factor de diluição de 6, terminando com seis concentrações diferentes de amostras. Estas amostras representam a quantidade de metabolitos extraídos a partir de 10 7, de 1,67 x 10 6 2,78 x 10 5, 4,63 x 10 4 7,72 x 10 3, e 1,293 x 10 de células, respectivamente. Uma vez que cada concentração de amostra é preparada em triplicado, com um total de 18 amostras são analisadas em LC-QE-MS. Uma lista alvo é utilizado para avaliar a quantidade de metabolitos detectados em diferentes para a concentração da amostra. O resultado na Figura 3 indica que o número óptimo de metabolitos detectados orientados é entre 2,78 x 10 5 e 1,67 x 10 6 células, enquanto que 1 x 10 7 células dar um menor número de metabolitos detectados, o que é devido aos efeitos de supressão de iões. Este resultado indica que a quantidade máxima de células para extrair para esta análise é aproximadamente a de um poço de uma placa de 6 poços.

Para análise de metabolitos não segmentado, um corte CV de 20% e um valor de intensidade média de 10 7 são usados ​​para filtrar a tabela de componentes. Estes CV e de intensidade média valores rígidos limites são usados ​​para este fim de demonstração. Para melhorar a reprodutibilidade, os valores de corte CV pode seraumentada (por exemplo, 30%), enquanto os valores médios de intensidade têm de ser reduzidos (por exemplo, 10 5) para incluir mais picos. Depois de verificar manualmente picos, componentes com boas formas são selecionadas e procurado no banco de dados do metaboloma humano. Os resultados são apresentados na Tabela 2. Tabela 2A lista os resultados a partir de dados recolhidos em modo positivo, enquanto que a Tabela 2B mostra os resultados de modo negativo. Alguns dos metabolitos identificados aqui se sobrepõem com os metabolitos na lista alvo, tais como a glutationa, prolina e assim por diante, mas ao mesmo tempo, metabolitos adicionais ausentes da lista alvo são exploradas, como methyglyoxal, que pode ser derivada a partir de glicólise, e 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, o que é detectado em positivo com um tempo de retenção de 3,2 min, o que é razoável para uma retenção de fosfolípidos sobre uma coluna de amida. Um protocolo de pesquisa de banco de dados irrelevantes metabólito foi previously relatado 20.

Figura 1
Figura 1. Exemplos de LC-MS picos de cromatografia. Aqui, a cromatografia reconstruído é gerado com uma janela de 10 ppm de massa (m / z ± 5 ppm). O eixo X mostra o tempo de retenção, enquanto o eixo Y mostra a intensidade relativa, ea intensidade de pico está listado acima de cada metabólito. Uma mostra picos detectados de modo positivo, enquanto B mostra picos de modo negativo. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2
Figura 2. 60;. Avaliação de baixa calibragem faixa de massa O eixo Y é o percentual acumulado de metabólitos com erro de detecção de massa dentro de 5 ppm. O eixo X é a margem de erro em massa em ppm. Curvas azuis e vermelhas representam 0-12 horas e 12-24 horas, respectivamente. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3
. Figura 3 Avaliação da quantidade de amostra - número de metabólitos. Alvo detectados versus o número de HCT 8 células quadrados vermelhos representam metabólitos detectados no modo positivo, círculos azuis significa metabólitos medidos no modo negativo, e os triângulos negros são o número total de metabólitos de ambos modo positivo e negativo. O eixo X mostra o número de HCT 8 células.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

<td> NA
Normas M / Z, modo positivo M / Z, modo negativo Fórmula Neutro Massa Neutro
n-butilamina 74.096425 NA C 4 H 11 N 73.089149
Fragmento Cafeína 138.066188 NA C 6 H 8 N 3 O 137.058912
Cafeína 195.087652 NA C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
Diazinon 305.108329 NA C 12 H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
MRFA peptídeo 524.264966 C 23 H 37 N 7 O 5 S 523,25769
Fluoroacetato N / D 77.004432 C 2 H 3 FO 2 78.011708
Sulfato N / D 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
Ácido homovanílico N / D 181.050634 C 9 H 10 O 4 182,05791
Sulfato de dodecilo N / D 265.147906 C 12 H 26 SO 4 266.155182
Taurocolato N / D 514.2844 C 26 H 45 NO 7 S 515.291676

Tabela 1. Padrões de calibração gama baixa massa e sua exata m / z.

<td> 131,05901
CSID Nome Fórmula Monoisotópico Massa Pesquisar Massa Erro (ppm) RT (min)
234 beta-alanina C 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04805 0,62 8.08
1057 Sarcosina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
5735 alanina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
568 Creatinina C 4 H 7 N 3 O 113,05900 113,05889 1,00 4.41
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06338 0,41 7,54
6050 L-(+)-valina C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0.18 7,42
7762 O nitrito de amila I C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0.18 7,42
135 Ácido 5-amino valérico C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0,38 7,42
242 trimethylglycine C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0,38 7,42
911 Niacinamida C6H6N2O 122,04800 122,04793 0,55 2.60
1091 Taurina C 2 H 7 NO 3 S 125,01466 125,01469 0.20 7,61
1030 Ácido hidroxicarboxílico pirrolina C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
7127 PCA C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
90657 N-Acryloylglycine C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
388752 5-oxo-D-prolina C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
389257 3-Hidroxi-3 ,4-di-hidro-2H-pirrol-5-carboxílico C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,02 8.51
8031176 Ácido Pyrrolidonecarboxylic C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0,03 8.51
5605 Hidroxiprolina C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5,83 8.08
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 5,83 8.08
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5,83 8.08
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5,83 8.08
167744 L-glutâmico-gama-semialdeído C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5,83 8.08
388519 5-Amino-2-oxopentanóico C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5,83 8.08
134 Ácido aminolevulínico C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 </ Td> 7,70 8.08
9312313 3-hidroxi-L-prolina C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 7,70 8.08
566 Creatina C 4 H 9 N 3 O 2 131,06900 131,06905 0,36 8.08
5880 L-(+)-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96
6067 L-(+)-isoleucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96
19964 L-norleucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96 </ Td>
388796 beta-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0,68 6,96
548 Ácido aminocapróico C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09455 3.48 6,96
6031 L-(-)-Asparagina C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05348 0,10 8.31
109 Ácido Ureidopropionic C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05348 3.71 8.31
6026 L-Ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0,02 10.37
64236 D-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0,02 10.37
5746 Glutamina C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0,93 8,25
128633 D-glutamina C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0,93 8,25
141172 Ácido Ureidoisobutyric C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0,93 8,25
21436 N-Metil-D <scp> </ scp> ácido aspártico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8,06
21814 -D - ácido glutâmico-() C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8,06
30572 Ácido L-(+)-glutâmico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8,06
58744 N-acetil-L-serina C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8,06
5907 L-(-)-metionina C 5 H 11 NO 2 S 149,05106 149,05095 0,70 7,39
6038 Histidina C 6 H 9 N 3 O 2 155,06947 155,06940 0,48 8,33
5910 L-(-)-Fenilalanina C 9 H 11 NO 2 165,07898 165,07887 0,63 6,60
1025 Piridoxina C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
4463 Oxidopamine [UNASUL: DCI] C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
102750 5 - (2-aminoetil)-Pirogalol C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
388394 Norepinefrina C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0,80 3.24
6082 L-(+)-arginina C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1,39 10.77
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1,39 10.77
780 heteroauxin C 10 H 9 NO 2 175,06300 175,06304 0.18 2.32
67261 Indol-3-acetaldeído, 5-hidroxi- C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1.65 2.32
3574185 INDOL-2-ACÉTICO C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1.65 2.32
5833 L-(-)-tirosina C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7,48
389285 3-Amino-3-(4-hidroxifenil) propanóico C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7,48
13628311 L-treo-3-fenilserina C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7,48
425 4-hidroxi-4-(3-piridil) butanóico C 9 H 11 NO 3 181,07401 181,07378 1,25 7,48
13899 3 - (1H-indol-3-il) acrílico C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0,15 6,44
10607876 Ácido Indoleacrylic C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0,15 6,44
389120 N6, N6, N6-Trimetil-L-lisina C 9 H 20 N 2 O 2 188,15248 188,15221 1.45 10.87
388321 5 "-S-metil-5"-thioadenosine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,08957 297,08898 2,00 2.56
144 9 - (5-s-metil-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-amina C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,09000 297,08898 3,43 2.56
111188 A glutationa C 10H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08345 1.14 8.02

Tabela 2A.

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID Nome Fórmula Monoisotópico Massa Pesquisar Massa Erro (ppm) RT (min)
857 Methylglyoxal C 3 H 4 O 2 72,02100 72,02108 1.03 7,70
1057 Sarcosina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2,33 8.19
5735 alanina C 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2,33 8.19
234 beta-alanina C 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04747 5,93 8.19
55423 Ácido R-láctico C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
61460 Hidroxipropiónico C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
96860 Ácido L-(+)-láctico C 3 H 6 O 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
592 Ácido láctico C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
650 Dihydroxyacetone C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
731 Glyceraldehyde C 3 H 6 O 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
1086 Ácido sulfúrico H 2 O 4 S 97,96738 97,96683 5.63 8.13
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06302 2.67 7,78
1078 O ácido succínico C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2,66 7,72
466979 Erythrono-1 ,4-lactona C4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2,66 7,72
4483398 D-Erythronic g-lactona C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2,66 7,72
473 Ácido metilmalônico C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5,96 7,72
8527138 (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-ona C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5,96 7,72
140384 Ácido 2-ketocaproic C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
164251 Ácido Methyloxovaleric C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
388419 (3S)-2-oxopentanóico 3-Metil ácido C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
46 um-Oxo-b-metilvalérico C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
69 O ácido alfa-ketoisocaproico C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
134 Ácido aminolevulínico 131,05800 131,05795 0,36 8.19
9312313 3-hidroxi-L-prolina C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05795 0,36 8.19
5605 HIDROXIPROLINA C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
167744 L-glutâmico-gama-semialdeído C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
388519 5-Amino-2-oxopentanóico C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
5880 L-(+)-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7,09
6067 L-(+)-isoleucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7,09
19964 L-norleucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7,09
388796 beta-Leucina C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7,09
548 Ácido aminocapróico C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09419 6.18 7,09
109 Ácido Ureidopropionic C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05321 1,60 8.28
6031 L-(-)-Asparagina C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05321 2.21 8.28
6026 L-Ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1.98 10.36
64236 D-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1.98 10.36
193317 L-(-)-málico C 4 H 6 O 5 134,02153 134,02130 1.72 7.95
510 (±)-ácido málico C 4 H 6 O 5 134,02200 134,02130 5,25 7.95
133224 ácido threonic C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7,70
388628 Ácido 2,3,4-Trihydroxybutanoic C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7,70
2061231 Ácido DL-erythronic C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7,70
21436 N-Metil-D <scp> </ scp> ácido aspártico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
21814 -D - ácido glutâmico-() C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
30572 Ácido L-(+)-glutâmico C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
58744 N-acetil-L-serina C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
6038 Histidina C 6 H 9 N 3 O 2 155,06947 155,06930 1,09 8.36
199 Alantoína C 4 H 6 N 4 O 3 158,04401 158,04387 0,88 4,76
6082 L-(+)-arginina C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0,80 10.76
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0,80 10.76
58576 Ácido N-acetil-L-aspártico C 6 H 9 NO 5 175,04807 175,04803 0.18 7,87
996 Ácido pirofosfórico H 4 O 7 P 2 177,94299 177,94331 1.79 8,42
5589 Glicose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
17893 Manose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
58238 . Beta-D-glucopiranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
71358 . Alfa-D-glucopiranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
134838 -Arabino-hexonic 3-desoxi ácido C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
388332 L-sorbopiranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
388476 beta-D-galactopiranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
388480 . Alfa-D-galactopiranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
388775 beta-D-fructofuranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
10239179 Inositol C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
16736992 Cis-inositol C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
17216070 alose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
17216093 L-Sorbose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0,41 7,53
201 hexopyranose C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7,53
868 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7,53
2068 A teofilina C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7,53
4525 1,7-dimetil-xantina C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7,53
5236 A teobromina C 7 H 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7,53
1161 isocítrico C 6 H 8 O 7 192,02701 192,02704 0,15 8.18
305 Ciácido tric C 6 H 8 O 7 192,02699 192,02704 0,23 8.18
963 ácido pantotênico C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0,84 6,72
6361 O ácido D-pantoténico C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0,84 6,72
960 ácido palmítico C 16 H 32 O 2 256,23999 256,24000 0,05 1.73
111188 A glutationa C 10 H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08339 1.35 8.03
388337 Ácido N-acetilneuramínico 309,10599 309,10585 0,45 7,43
392681 N-acetil-alfa-ácido neuramínico C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0,45 7,43
392810 Ácido siálico Neu5Ac C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0,45 7,43

2B Table.

. Tabela 2 Lista de metabólitos irrelevantes detectados no HCT 8 células (2,78 x 10 5 células equivalência) 2A e 2B incluem componentes de extração de informações:. ChemSpider ID (: Enquanto isso, resultados de pesquisa de banco de dados o tempo de retenção, m / z e erro em massa, e CSID), nome, fórmula, e assim por diante. Aqui, as amostras analisadas são equal para metabólitos extraídos de 2,78 x 10 5 células, eo limiar de intensidade é de 1 x 10 7, para evitar resultado tedioso para finalidade de demonstração.

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Discussion

Os passos mais críticos para perfilamento metabolito bem sucedida em células, utilizando este protocolo são: 1) o controlo do meio de crescimento e extracção cuidadosa das células; 2) ajustar o método de LC com base em MS configuração método para garantir que não são suficientes (geralmente pelo menos 10) pontos de dados em um pico para a quantificação; 3) fazer uma calibragem baixa massa antes de executar amostras; 4) a injecção de não mais do que 5 ml de evitar um tempo de retenção de deslocamento e alargamento do pico causado por água; e 5) a preparação e execução de amostras para comparação no mesmo lote para minimizar os efeitos de lote.

Os padrões (Tabela 1) escolhido aqui para calibração gama baixa massa são intercambiáveis. Qualquer composto conhecido com um m / z que cai na faixa de digitalização em massa, é bem comportado em uma fonte de H-ESI, e é solúvel em água, metanol, ou acetonitrilo são candidatos razoáveis ​​para os padrões de calibração. É altamente recomendado para armazenar todas as soluções de calibração de umt 4 ° C para estabilizar a cafeína e também para minimizar a evaporação do metanol ou acetonitrilo, na solução de calibração, de modo que o desempenho de calibração pode ser mais reprodutível. Comparado a uma faixa de massa regular, m / z de 150 a 2.000, baixa calibragem faixa de massa precisa ser feito com mais freqüência, pelo menos uma vez a cada dois dias.

Esse fluxo de trabalho, a partir de solvente de extração, solvente de reconstituição, fase móvel LC, a baixa massa calibração alcance e MS varredura gama foi otimizado para medir metabolitos polares. Isto inclui os aminoácidos, acetilo aminoácidos, intermediários da via da glicólise, nucleósidos, intermediários do ciclo do TCA, alguns intermediários da via do metabolismo de um carbono e assim por diante. No entanto, modificações deste protocolo para outras classes de metabólitos, tais como espécies Coenzima A (CoA), folatos, fosfolipídios são possíveis. Por exemplo, CoA são mais estáveis ​​em condições ácidas, de modo que a adição de um ácido a 80% de metanol / água será útil para impsensibilidade Rove CoA. Além disso, CoAs e lípidos tendem a ter muito grandes pesos moleculares, assim, o intervalo de varrimento m / z deve ser ajustado 60-900 para o intervalo adequado que irá cobrir esses metabolitos.

Mesmo que alguns dos resultados da pesquisa de banco de dados irrelevantes componente sobreposição com a lista específica, ainda é importante para construir essa lista específica com base na prioridade de pesquisa. Uma vez que os metabolitos na lista alvo são menores do que o limiar de intensidade média, informações sobre estes metabolitos vai ser removida durante o processamento. A lista alvo inclui a informação do tempo de retenção, o que nos dá maior confiança para a identificação e quantificação metabólito. Uma vantagem adicional com a instalação QE-MS é que espectrometria de massa pode permitir uma maior identificação dos metabolitos.

Um problema associado a este fluxo de trabalho é que a agulha insegurança H-ESIrt é sensível ao teor de sal das amostras, como a sensibilidade serão grandemente comprometida se há quantidades elevadas de sais não voláteis. Portanto, minimizando teor de sal a partir de amostras e limpeza de rotina da coluna e da inserção de agulha H-ESI será útil para garantir que os dados de boa qualidade e aumentar a vida útil da coluna.

Em resumo, este protocolo emprega LC-QE-MS para analisar com sucesso metabolitos polares a partir de células cultivadas, com o mínimo de etapas de preparação de amostras e de aquisição de dados rápida. Pequenas modificações na preparação da amostra pode ser realizado para obter dados a partir de outras fontes biológicas, tais como soro e tecido. Por exemplo, uma vez que o metanol puro pode ser adicionado ao soro líquido acrescentado para fazer uma concentração final de metanol de 80% de extracção de metabolitos polares. Para as amostras de tecido, a agitação e mistura rigorosa é necessária para conseguir uma melhor eficiência de extracção. Normalmente, 10 ml de soro ou1 mg de tecido é suficiente para análise de metabolitos. Os dados em bruto podem ser analisados, tanto no modo de alvo, se existem metabolitos conhecidos nas amostras, e de uma forma não-alvo seguido por HRMS busca de banco de dados. Metabolômica HRMS base ainda está em seus estágios iniciais. Para avanços futuros, as técnicas experimentais podem ser optimizadas, informações adicionais HRMS metabólitos e padrões de fragmentação MS / MS será algoritmos úteis e relevantes, tais como alinhamento de pico, a integração de pico, isótopo de agrupamento e assim por diante, pode melhorar a eficiência ea precisão dos processamento de dados. Em última análise, no entanto, muitas das perguntas que os nossos endereços de laboratório no metabolismo são limitadas pela interpretação cuidadosa dos dados após o processamento. Com estas técnicas metabolômica em larga escala, muitas vezes somos limitados por nossa interpretação dos dados e avaliação de hipóteses geradas. Portanto, todos os metabolômica experimentos precisam ser formulados em torno de questões específicas.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Universidade da Pensilvânia) pelas valiosas discussões sobre calibração de massa e processamento de dados. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R00CA168997. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

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References

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