공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

셀룰러 산도 교정을위한 해결책 1. 준비

  1. 교정에 사용되는 5 용액을 제조 5 개의 분리 50 ㎖ 원추형 튜브에 이하의 화합물을 추가
    • 염화나트륨 (1 M NaCl을 1 ㎖) (1 M NaCl을 10 ㎖의 H 2 0 = 0.58 g)
    • 의 KCl은 (7,425 1 M의 KCl ㎖) (1 M의 KCl은 10 ㎖의 H 2 0에서 825 g을 =)
    • 포도당 (1 M D-글루코스의 1 ㎖) (1M D-글루코스 = 10 밀리리터 H 1.80 g이 0)
    • MgS0 4 (0.05 1 M 망초의 ML) (1 M 망초 10 ㎖의 H 2 0 4 = 1.20 g)
    • 20 mM의 HEPES (1M HEPES 1 ㎖) (10 ㎖의 H 2 0 1 M HEPES는 = 2.38 g)
    • 염화칼슘 (1M 염화칼슘 0.05 ㎖) (10 ㎖의 H 1 M 염화칼슘 = 1.47 G 2 0)
      두 번 증류 된 H 2 O (DDH 2 O)의 모든 솔루션을 준비합니다.
  2. DDH 2 O 35 ㎖로 각각의 솔루션을 완료하고 그렇게 할 때까지 자석 교반기로 혼합lution가 달성된다.
  3. 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5의 pH 값을 얻기 위해 1 N KOH 또는 1 N HCl로 각 용액의 pH를 조정합니다. 이어서, 50 ㎖의 최종 부피의 탈 이온수를 사용하여 볼륨을 조절한다.
  4. 측정 5 nigericin의 MG 및 원액 nigericin 10 밀리미터를 준비하는 무수 EtOH 670 μL에 추가합니다.
    주의 : nigericin이 높은 독성과 큰 관심 (장갑, 보호 안경 및 마스크)로 처리해야합니다. nigericin가 완전히 용해 될 때까지 반전하여 솔루션을 섞는다.
  5. 각각의 보정 용액에 10 mM의 nigericin (최종 농도 10 μM)의 0.05 ML을 추가합니다. Nigericin은 세포막 투과성을 증가시키고, 세포의 K + 탈분극 농도의 존재 하에서 세포 내 및 세포 외 pH를 평형화 원인 이온 운반체이다.
  6. 교정 솔루션은 4 ° C에서 1개월까지 저장할 수 있습니다

2. 휴대 준비

  1. 생물학적 보안 시스템에서35mm의 Y 후드, 씨 세포 X 10mm 배양 접시 10 % 소 태아 혈청과 항생제가 보충 된 성장 배지 2 ㎖에. 24 시간 후에 약 50 % 합류점을 보장하기 위해 필요한 셀의 양을 사용한다.
    주 : 우리의 실험에서, 우리는 HT-1080 세포주 및 플레이트 배양 접시 당 1 × 10 5 세포를 사용합니다.
  2. 교정에 사용되는 실험 및 플레이트 (5 건) 문화 요리에 필요한 배양 접시의 수를 결정합니다.
  3. 최소 24 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 넣고 배양 접시.

pH를 감지 프로브 3. 준비

  1. DDH 2 0에서 형광의 pH 프로브 8-hydroxypyrene-1, 3,6 trisulfonic 산, 삼 나트륨 염 (HPTS / pyranine)의 1M 주식 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 실온에서 저장 빛으로부터 보호되어야한다.
  2. 는 thereâ라고, (및-6) - 카르 복실 seminaphthorhodafluor 아세 톡시 메틸 에스터 아세테이트 (C-SNARF-1 AM - 1 ~ 5 ㎜의 재고 솔루션을 준비합니다따고 SNARF-1) DMSO 1.76 ㎖에 SNARF-1의 1 MG를 용해하여. 철저 반복 피펫으로 혼합. SNARF-1 솔루션은 -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호되어야한다.

4. 셀 라벨

  1. 열 여섯 시간 라이브 세포 이미징 전에 완전 배지 2 ㎖를 포함하는 각 배양 접시에 1M HPTS 원액의 2 μL (최종 농도 1 ㎜)를 추가합니다.
  2. 배양기에 배양 접시를 돌려줍니다. HPTS 프로브 따라서 라벨에 프로브는 세포 작용에 의해 흡수되어야한다 소기관, 세포 impermeant입니다. 이 조건은 HPTS와 세포 배양 혈청이 첨가 된 배지에서 수행해야합니다.
  3. HPTS와 배양 후, 멸균 PBS로 두 번 세포를 세척하고 적어도 2 시간 동안 무 혈청 배지 2 ㎖를 추가합니다. SNARF -1 인큐베이션 혈청은 프로브의 흡수를 방지 할 수 있으므로 무 혈청 배지에서 수행 될 필요가있다.
  4. AF를 얻기 위해 1 ㎜ SNARF-1 원액의 10 μl를 추가합니다원고 판 5 μM의 농도와 세포가 희미한 빛 아래에서, 37 ° C에서 20 분 동안 배양 할 수 있습니다. C-SNARF-1 농도와 배양 시간은 세포의 종류에 따라 다를 수 있습니다.
  5. 부화의 끝에서, 멸균 PBS에 두 번 세포를 세척하고 무 혈청 배지 2 ㎖를 추가합니다.

산도 변조기 5. 추가

  1. 이 방법은 세포에 pH 변화를 감지 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 세포 내 산도를 조절하는 다른 시약을 사용할 수 있습니다 :
    • Bafilomycin A1, V-ATPase의 5 특정 억제제
    • NA + / H의 + 교환기 이소 형 1 (NHE-1) ~ (6)
    • NH 4 망할 CIA, 세포 내 pH가 7 증가 약한베이스
    1. 위에서 언급 한 시약의 주식 솔루션을 준비 :
      • Bafilomycin A1 : 100 μM의 원액을 얻기 위해 DMSO 160 μL에 bafilomycin A1의 10 μg을 추가
      • EIPA :는 obtai 메탄올 1.67 ml로 EIPA의 25 밀리그램을 추가50 mm의 최종 농도 NA
      • NH4Cl 등 : 1 mM의 최종 농도를 구하는 DDH 2 O 10ml에 염화 암모늄 0.53 g을 용해.

      참고 : 모든 주식 솔루션은 -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호되어야한다 bafilomycin의 A1을 제외하고 4 ° C에 보관해야합니다.
    2. 별도의 배양 접시에서, 아래에 설명 된대로 시약 중 하나를 추가합니다 :
      • 100 μM의 bafilomycin A1의 2 μL (최종 농도 100 NM)
      • 50 mM의 EIPA 1 μL (최종 농도 25 μM)
      • 1M NH4Cl 등 (최종 농도 20 ㎜)의 40 μL
    3. 37 ℃에서 30 분 동안 세포를 품어
  2. 이미지 수집을 진행합니다.

6. 라이브 세포 이미징 현미경의 사양 및 취득 설정

  1. 사용하여 라이브 세포 이미징을 수행 40X 목적은 스펙트럼 반전 스캐닝 공 촛점 microsco에 장착퍼가기 전동 XY 스테이지, 환경 제어 (온도, 습도, CO 2) 단계 인큐베이터에서 유리 바닥 문화 요리를 수용하는 챔버를 탑재.
  2. 여기에 사용 된 공 초점 악기 (올림푸스 FV1000)가 장착되어 있습니다 :
    • 다이오드 레이저 405 nm의
    • 40 mW의 아르곤 레이저 (458 nm의, 488 nm의, 515 nm의)
    • 헬륨 네온 레이저 (543 nm의)
    • 형석 10X 목적, NA0.4
    • LUCPLFLN 40X 목적, NA0.60
    • PLAPONSC PLAN APO 60X 오일 목적, NA1.4
    • 다이크로 익 미러 DM 405/458/488/543
    • SDM (560) 및 SDM (640), 다이크로 익 필터
    • BA655-755 차단 필터
    • 빔 스플리터 BS20/80
    • 이미지 수집 및 분석을위한 데이터 분석 소프트웨어,
  3. 무대 인큐베이터가 37 ° C로 예열하고 현미경이 설정되면, 이전에 촛점 무대 영상 실에 HPTS와 SNARF-1 배양 배양 접시를 놓습니다.
  4. 관심 영역을 위치 따고, 소프트웨어 취득 설정도 1을 조정한다.
    • 두 개의 가상 채널 세트를 설정합니다.
    • 525 nm의 570에서 543 nm의 방출 수집에 SNARF-1 여기 - - 600 nm의 505에서 405 nm의 방출 수집에 HPTS 여기에 해당하는 첫 번째 단계를 시작합니다.
    • 525 nm의 640에서 543 nm의 방출 수집에 SNARF-1 여기 - - 650 nm의 505에서 458 nm의 방출 수집에 HPTS 여기에 해당하는 두 번째 단계를 시작합니다.
    • 공 초점 조리개는 기본적으로 175 μm의 설정 및 최적의 조리개를 수동으로 300 μm의에서 설정 될 필요가있다.
    • 0.4 μm의 두께의 직렬 수평 광학 절 (800 × 800 픽셀)를 적층하여 이미지를 가져 가라.

참고 : 40X 목적은 동시에 여러 개의 세포를 관찰하는 데 유용하고 세포 기관보기에 적합합니다. 그러나, 공간 해상도 및 신호 강도는 베티 아르R은 60X 오일 목적을 사용하여 달성. 또한,이 색소 사이의 여진 또는 발광 크로스 토크는 없다.

pH를 감지 프로브의 7. 교정

  1. 교정하기 전에, 이전에 HPTS와 SNARF-1 배양 배양 접시에서 매체를 제거 멸균 PBS로 두 번 세척 한 다음 다섯 교정 솔루션 중 하나 2 ㎖를 추가합니다.
  2. 공 초점 무대 챔버로 배양 접시를 놓습니다.
  3. 다음 설정에 따라 시간 경과 이미지 수집을 진행 :
    1. 실험에 대한 이미지와 간격 기간의 횟수를 설정합니다.
      참고 : 우리는 일반적으로 최대 30 분 동안 이미지 사이에 1 분 간격을 사용합니다.
    2. 각 이미지의 취득 사이에 닫습니다 셔터를 프로그램.
  4. 스프레드 시트 소프트웨어에 분당 형광 강도를 기록하고 형광 강도가 상승 할 때의 시간을 결정한다. 20 분 - 세포 내 pH는 15 일 이후 일반적으로 안정적이다.
  5. REPEAT는 나머지 각 교정 솔루션을위한 새로운 배양 접시를 사용하여 7.4 7.1 단계를 반복합니다.

8. 데이터 수집

  1. 교정이 완료되면, 필드 당 15 ~ 20 세포를 포함하는 4-5 무작위로 선택한 분야에서 샘플 데이터를 수집. 두 이미지는 각 필드에 대해 얻을 수 있습니다 : HPTS 라벨 (소포)와 SNARF-1 라벨 (세포질)에 대한 두 번째 하나.
  2. 배경 형광 (세포 외 영역)는 디지털 두 프로브의 형광 이미지에서 차감됩니다. 각각의 저장된 이미지에서 레이블이 소포 및 세포질은 바이너리 마스크를 사용하여 선택됩니다. 각각의 pH를 감지 프로브를 들어, 형광 강도는 수치 척도 (0-4,095 회색 수준의 규모)에 측정된다. 소기관 또는 세포질 내의 모든 픽셀의 평균 휘도가 계산되고 형광 값의 비율을 계산하는 데 사용된다.

9. 데이터 분석

  1. 다양한 소프트웨어 패키지는 데이터 분석을위한 상업적으로 이용 가능하다. Fluoview 소프트웨어.
  2. 다음 스프레드 시트, 레코드 값과 형광 비를 계산 HPTS의 경우, R = (F 458 ㎚ / F 405 NM)와, SNARF-1, R = (F 644 ㎚ / F 584 ㎚의 경우 ).
  3. 같은 그래프 패드 프리즘 과학적 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 그린다. 플롯은 산도 (X 축)의 함수로서 형광 비율 (Y 축) 묘사한다. 커브 피팅 비선형 회귀 분석을 사용하여 달성된다.
  4. 단계 20.7에 기재된 바와 같이 샘플의 형광 농도 모아서 형광 비율을 계산한다. pH 값으로 비율을 변환하는 보정 곡선을 사용합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

세포 내 엔도 좀 / 리소좀 세포 구획 모두에서의 pH의 동시 측정을 위해, 비율 계량 형광 pH를 감지 SNARF-1 프로브 및 HPTS를 사용 하였다. HPTS가 엔도 솜 / 리소좀 구획의 비율 계량 산도를 측정 할 수있는 반면 SNARF-1은 세포 내 구획으로 제한됩니다. 16 시간 동안 HPTS있는 셀로드는 엔도 좀 / 리소좀 4의 선택적 지역화 할 수 있습니다. pH를 감지 프로브와 함께로드 HT-1080 세포에서 기록 된 형광의 전형적인 예는 그림 2A에 표시됩니다. HPTS는 엔도 좀과 리소좀 두 구획 레이블 증거는 알렉사 546 - 복합 트랜스페린 (엔도 솜) 또는 형광 lysotrophic 프로브 (Lysotracker 깊은 Reddye)와 공동 염색을 얻었다. 데이터는 명확하게 HPTS 두 구획 그림 2A 스테인드 것으로 나타났다.

상술 된 방법을 사용하여 살아있는 세포에서의 세포 내 pH 값을 사용하여 결정 하였다각 pH 민감성 염료의 비율 적 속성에 따라 각각의 프로브도 2B2C에 대한 교정 곡선. 오 보정 용액은 pH를 단위로 형광 강도를 변환하는 데 사용 하였다. 세 개의 독립적 인 교정의 데이터는 각각의 pH를 감지 프로브 그림 2C에보고됩니다. 각 데이터 포인트는 HPTS 또는 관련 pH에서 SNARF-1 584분의 644 ㎚의 발광 파장 405분의 458 ㎚의 여기 파장에서의 형광 강도의 비를 나타낸다. 두 프로브의 교정 곡선은 최상의 지수 방정식도 2c 장착 된 비선형 관계를 보여 주었다. 셀룰러 구획 관련 pH 변화를 검출하기위한 방법의 효율을 NH 4 카스티 세포 내 pH를 증가 약염기, bafilomycin A1, V-ATPases 및 EIPA의 약리 억제제, NHE을 이용한 라이브 HT-1080 세포에서 평가되었다 1 억제제. NH 4 망할 CIA가 트리거 intravesicular 및 사이토6.35-7.10와 7.00-7.40 solic 산도 증가는 각각 3A와 3B 피규어. Bafilomycin A1은 세포질의 산도를 변경하지 않고 엔도 좀과 리소좀 구획의 알칼리화를 유도. 대조적으로, EIPA는 미처리 세포도 3a 및도 3b에서 7.00에 비해 6.62의 pH 값에 도달 세포질의 산성화를 유발.

그림 1
도 1. 공 초점 레이저 주사 현미경을위한 인수 설정 다이어그램. (A) 첫 번째 단계는 이색 (DM405/488/543/633) 거울을 통해 동시에 543에서 405 nm의 SNARF-1에서 HPTS을 자극 할 수 nm의 설정된다. 형광 방출이 처음 다이크로 익 미러 (SDM560)를 사용하여 505-525 nm에서 HPTS 기록됩니다. SNARF-1의 형광 방출은 다음 bandpa 통해 모니터링된다570-600 nm 범위 내의 SS 간섭 필터. (B)는 두 번째 단계는 동시에 HPTS의 형광 방출 (EXC 458 NM)와 SNARF-1 (EXC, 543 나노 미터)를 수집하도록 설정된다. 각 프로브는 첫 번째 단계에서 사용되는 다이크로 익 미러를 통해 수집의 레이저 빔에 의해 생성 된 프로브 여기가 빔 스플리터 (BS20/80) 및 형광 방출을 통해 전달합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2.의 pH 감지 프로브의 현장 교정합니다. (A) HPTS 및 HT-1080 섬유 육종 세포에서 SNARF-1 하위 세포 지방화의 대표 이미지. 상부 이미지 SNARF-1 반면 세포질 레이블 보여 HPTS 관련 형광 intravesicular 지역화를 보여줍니다. HT-1080 세포 알렉사 546 공역 트랜스페린 (5 ㎍ / ㎖) 또는 lysotrophic 염료 각각 (Lysotracker 진한 Reddye) (100 NM)와 함께 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 아래 이미지는 HPTS가 트랜스페린과 lysotrophic 염료 (60X)로 colocalizes 것을 보여준다. 형광 강도의 (B)의 pH 6.0과 pH를 7.5에서 교정 솔루션으로 15 분 동안 배양 세포 모두에서 pH를 감지 프로브의 대표 이미지. (C) 관계 HPTS와 SNARF-1에 대한 비율이 산도의 함수로 보정 용액을 사용하여 결정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
내가 NT의 그림 3. 변조bafilomycin A1, EIPA 및 NH 4 망할 CIA에 의해 racellular 산도. 약물 억제제 (bafilomycin A1, EIPA) 및 세포 내 산도 조절제 NH 4 망할 CIA는 방법의 유효성을 검사하는 데 사용되었다. 그래프는 엔도 솜 / 리소좀 컴 파트먼트 (A) 또는 HPTS 및 SNARF-1 로케이션과 NH 4에서 Cl의 존재 또는 부재 (대조군)에서 30 분 동안 인큐베이션 HT-1080 세포의 세포질 (B) (에 기록 된 pH 값을 보여준다 20 MM), EIPA (25 μM) 또는 bafilomycin A1 (100 NM). 데이터는 평균 ± SEM (** P는 0.005, *** P 0.0001)로 표시됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

다른 세포 구획의 라이브 세포 이미징 양적 pH 측정은 정확하게 외부의 도전에 대한 세포 반응에서의 pH의 변화를 측정하기 위해 필요합니다. 그러나 남아있는 주요 장애물 중 하나는 쉽게 구체적으로 세포 구획을 대상으로하는 것입니다. 이 점에서, 몇 가지 연구는 일렉트로 또는 마이크로 인젝션 8-10 의해 세포 내로 도입 세포 내 pH를 지표로 HPTS의 사용을 강조했다. 이 기술은 즉 일렉트로 세포에 광범위한 피해를 발생시키고 미세 주입은 특수 장비 및 기술 능력을 필요로 심각한 결점으로 고통. 그 중에서, 힌튼 외. 이전 HPTS가 세포 작용의 과정에 의해 세포에 의해 다루어 SNARF-1 및 HPTS의 조합 / 리소좀 구획 3 세포질과 엔도 솜의 pH를 모니터링하는데 사용될 수 있다는 될 수 있다고보고했다 . 우리는 리소좀 / 엔도 좀 compartm에서의 pH 변화를 기록하기 위해이 속성을 사용했습니다라이브 HT-1080 세포의 이비인후과. HPTS이 구획에 위치했다 및 따라서, 신뢰할 수있는 산도 지표로서 역할을 할 수 있다는 증거가 형광 - 복합 트랜스페린과 공동 염색을 얻었다, 리소좀 / 엔도 좀 구획의 마커, 또는 호산 염료로 대부분 리소좀에게 그림을 레이블이 이. 또, 뚜렷한 세포 구획 타겟팅 다른 세포 내 산도 조절제의 사용은 bafilomycin A1 특히 세포질의 pH를 변경하지 않고 intravesicular pH가 증가하는 것이 나타났다. 대조적으로, EIPA 주로 세포질 산도를 변경하지만, 염화 암모늄 양 구획의 pH가 영향 동안 엔도 솜과 리소좀의 pH에​​ 거의 또는 전혀 영향을 미쳤다. 이러한 결과는 SNARF-1 및 HPTS 동시에 이러한 두 가지 세포 구획에서 pH 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다는 증거를 제공 하였다.

여기에 설명 된 방법의 한가지 중요한 특징은 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하는 것이다. 대부분의 연구의 REPO세포 내 pH 측정에 대한 문헌에서 rted spectrofluorometry에 의해 수행되었다. 쉬운 사용 및 신속한 데이터 수집을 제공하기 위하여하지만, 이러한 접근법은 실험 기간 동안 세포의 관찰을 허용하지 않는다. 는 교정 단계에서, 산성에서 연장 보육 (산도 5.5) 또는 알칼리 (산도 8.0) 조건에 악영향을 다양한 세포 유형에 영향을 세포 사멸을 실행할 수있는 우리의 경험이었다 때문에이 단점은 중요한 의미가 될 수 있습니다. HT-1080 세포의 경우, 아폽토시스 따라서 SNARF-1 (데이터 미도시)의 pH-의존적 형광 방해 적색 형광도에 이르게한다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 세포 사멸 또는 다른 세포 변화의 징후가 관찰되었다 각 교정을위한 별도의 배양 접시 폐기 실험을 사용했습니다. pH 측정을위한 공 초점 현미경의 사용은 또한보다 쉽게​​ 데이터 분석을 만든다. 예를 들어, 공 초점 형광 현미경 이미지 분석 apoptoti 아티팩트를 폐기하는 데 사용될 수있다C 세포와 배경 잡음, 계산을보다 쉽고 정확하게 만들기.

여기에서 설명하는 방법은 다른 방법에 비해 많은 장점을 제공하지만, 그것은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이들 중 하나는 각각의 프로브에 필요한 상이한 하중 조건에 관한 것이다. HPTS 관련하여, 색소 세포 작용에 의해 흡수되어야한다. 이 제한은 세포가 세포 작용과 세포 내 이입 구획하여 라벨을 촉진하기 위해 혈청이 첨가 된 배지에서 오랜 기간 (예 : 12 시간) 동안 유지해야합니다. 대조적으로, 세포 투과 SNARF -1 혈청 - 함유 비 특이성 에스 테라 제에 의해 아세 톡시 메틸 에스테르 (AM) 가수 분해의 가능성을 방지하기 위해 무 혈청 배지에서 배양해야한다. 이러한 제한은로드 호환되지 않는 세포 배양 조건을 필요로 실험 프로토콜을 제외됩니다. 또, 산성 매체 HPTS의 감도가 중요한 제한이다. 도 2의 F에 도시 한 바와 같이458 nm에서 흥분 HPTS의 luorescence 강도는 배경 값에 가까운 비율을 사용하여 pH 6.0 이하에서 최소한의 변화를 보여줍니다. HPTS이 본질적인 속성은 4.0-5.0 정도의 낮은 pH 값이 리소좀 매우 산성 세포질 구획의 연구의 경우에 고려되어야한다. 그러나, 우리의 지식으로, HPTS는 intraendosomal 산도를 측정하는데 사용될 수있는 유일한 가능 비율 적 염료이다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 lysosensor 염료보다 산성 리소좀 구획 내의 대부분 파티션 것이다. 엔도 좀 내의 격실이 염료의 파티션의 정도는 엔도 좀의 pH 항상성이 변경되는 세포 intravesicular의 pH를 측정 할 때의 주요 단점이다,이 소포 내의 pH 값에 의존 할 것이다.

결론적으로, 우리는 동시에 하나의 세포에서 세포질과 엔도 좀의 pH 값을 측정하기 위해 본 방법을 설명합니다. 이것은 세포의 pH 항상성의 연구에 특히 중요합니다 어디 있나전자의 돌연변이 또는 약물은 엔도 좀의 유출 및 양성자의 유입에 영향을 줄 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics