Inducir miointimal Hiperplasia Versus aterosclerosis en ratones: una introducción de dos modelos válidos

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Summary

Este video muestra a dos modelos de desarrollo de la placa de la íntima en las arterias murinos y hace hincapié en las diferencias en la hiperplasia miointimal y la aterosclerosis.

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Stubbendorff, M., Hua, X., Deuse, T., Ali, Z., Reichenspurner, H., Maegdefessel, L., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models. J. Vis. Exp. (87), e51459, doi:10.3791/51459 (2014).

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Abstract

Se han establecido varios modelos in vivo de roedores de laboratorio para la inducción de la estenosis de la arteria para imitar enfermedades que incluyen la formación de placa arterial y la estenosis, como se observa por ejemplo en la enfermedad isquémica del corazón. Dos modelos de ratón altamente reproducibles - tanto resulta en estenosis de la arteria pero cada subyacentes un camino diferente de desarrollo - se introducen aquí. Los modelos representan las dos causas más comunes de la estenosis de la arteria; a saber, se muestran un modelo de ratón para cada hiperplasia miointimal, y la aterosclerosis. Para inducir la hiperplasia miointimal, se realiza una lesión de catéter de balón de la aorta abdominal. Para el desarrollo de la placa aterosclerótica, la ApoE - se utiliza el modelo del ratón en combinación con dieta de grasos occidental - /. Diferentes opciones de modelo-adaptado para la medición y evaluación de los resultados se nombran y describen en este manuscrito. La introducción y la comparación de estos dos modelos ofrece Information para los científicos para elegir el modelo de estenosis de la arteria apropiada de acuerdo a la pregunta científica pedido.

Introduction

En los países industrializados la enfermedad isquémica del corazón sigue siendo una causa principal de mortalidad 1. Las causas de la estenosis de la arteria coronaria son múltiples e incluyen la hiperplasia miointimal así como la aterosclerosis, con la revascularización restante la estrategia de tratamiento más común 2. Modelos de investigación que distinguen claramente entre las vías mecanicistas de la hiperplasia de la íntima y la aterosclerosis son esenciales para investigar la pathobiological y los procesos fisiopatológicos en el desarrollo de la placa arterial. En este video se presentan dos modelos diferentes de ratones utilizados para estudiar bien el desarrollo de la hiperplasia miointimal o aterosclerosis.

Hiperplasia miointimal se postula para formar a través del paradigma de la "respuesta a la lesión", originalmente descrito para la aterosclerosis 3. La ruptura mecánica de la capa endotelial conduce a una intensa remodelación mejorada por los efectos paracrinos. Hay varios diferentes modelos animales comúnmente utilizados para estudiar la hiperplasia miointimal. Algunos grupos utilizan dispositivos metálicos en la aorta ascendente de 4 ratas. El modelo de la denudación aórtica se realiza con un catéter de balón también se usa comúnmente en ratas de laboratorio 5,6. El modelo de hiperplasia de la íntima realizado en ratones de laboratorio 7 implementa la ligadura de la arteria carótida e induce lesiones miointimales 8. En nuestro laboratorio el modelo de la denudación de la aorta abdominal - para estudiar el desarrollo de la hiperplasia miointimal - así como un modelo de reestenosis del stent humanizado 9 son de uso general. Este video hace hincapié en que la elección del modelo animal experimental apropiado es crucial para los estudios mecanicistas o fisiopatológicos de la estenosis arterial.

Modelos hiperplasia miointimal deben diferenciarse de los modelos de aterosclerosis. Para estos últimos, la apolipoproteína E-deficiente (ApoE - / -) ratones en combinación con dieta occidental se utilizan comúnmente para inducir atheroscllesiones eróticos 10,11,12,13. Ejemplos para la inducción de ambos de estos tipos de enfermedad miointimal en ratones se muestran aquí, junto con diferentes opciones de modelo adaptado para analizar estenosis de los vasos 14.

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Protocol

Todo animal de trabajo debe llevarse a cabo según las directrices de cuidado de los animales pertinentes. Obtener la aprobación institucional para el trabajo con animales antes de protocolo de inicio.

1. Miointimales Hiperplasia Modelo (A)

Para el modelo de hiperplasia de la íntima, la compra de C57BL/6J (Stock número 000664, C57BL/6J) ratones a la edad de 8 semanas con un peso aproximado de 25 g. Los ratones de estos experimentos en condiciones convencionales; alimentar a los ratones estándar chow ratón y proporcionar agua a voluntad.

  1. Preparación del ratón: Introducir el ratón a un estado de anestesia con isoflurano (2%) que utiliza una cámara de inducción.
    1. Quite el pelo abdominal usando un cortador de pelo, poner el ratón sobre su espalda y cubrir su nariz y boca con la máscara facial para asegurar la anestesia.
    2. Con Provo-yodo, la desinfección de la zona abdominal universalmente, seguido de etanol 80%, en dos ciclos.
    3. Asegurar la ausenciade los reflejos por pellizco la extremidad posterior para controlar la profundidad suficiente de la anestesia.
    4. Separar la piel y los músculos a lo largo de la línea alba en dos pasos para destapar los órganos abdominales.
    5. Coloque los intestinos en un guante de solución salina hidratada. Envuelva el guante alrededor de los intestinos para mantenerlos húmedos.
    6. Atentamente limpiar el tejido graso láminas de la aorta abdominal. Exponer la aorta infrarrenal hasta su bifurcación, teniendo cuidado de no dañar ningún ramas vasculares.
    7. En primer lugar, colocar una pinza de microcirugía en la proximal, la aorta infrarrenal para apagar el flujo de sangre. Ahora, aplique una segunda pinza distal próximo a la bifurcación aórtica.
    8. Cuando se interrumpe el flujo de sangre, hacer una pequeña incisión en la aorta cerca de la pinza proximal.
    9. Insertar el catéter con punta de balón, que ha sido hidratada con 0,9% de solución salina, y avanzar hacia la mordaza distal de la aorta.
    10. Por lesión endotelial, desnudar la aorta inflando el balloon cuidadosa y lentamente tirando del catéter en la dirección de la mordaza proximal.
    11. Repita la maniobra de la denudación dos veces.
    12. Retire el catéter y cerrar la incisión de la aorta utilizando prolene 10-0 suturas continuas.
    13. Abra con cuidado la pinza distal. En caso de sangrado en el sitio aortotomía, cierre la pinza de nuevo, localizar el sangrado y colocar puntos interrumpidos adicionales, según sea necesario.
    14. Si hay sangrado se puede observar, abra lentamente la pinza proximal.
    15. Un pulso aórtica debe ser visible distalmente desde la incisión. Ahora los intestinos se pueden arreglar de nuevo in situ.
    16. Enjuague la cavidad abdominal utilizando solución salina estéril precalentada.
    17. Cierre de la pared abdominal que comienza con la capa muscular utilizando 6-0 suturas de prolene en ejecución.
    18. Siguiente adaptar la piel bajo el uso de 5-0 prolene realizar suturas continuas.
    19. Durante el tiempo que el ratón sigue anestesiado, aplicar 4-5 mg / kg Carprofeno través de una inje subcutáneacción.
    20. Añadir metamizol al agua de beber (50 mg Metamizol por 100 ml) para el control del dolor y continuar durante 3 días después de la cirugía. Monitorear los animales en toda la recuperación.
      Nota: El período de observación para este modelo es de 28 días.

2. La aterosclerosis Modelo (B)

Para el modelo de aterosclerosis, comprar (ApoE - / -)-E deficientes apolipoproteína ratones (Stock número 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) a una edad de 4 semanas, y luego se alimentó durante 4-6 meses. Los ratones de estos experimentos en condiciones convencionales; alimentar a los ratones una dieta alta en lípidos occidental a la llegada (Harlan Laboratorios TD.88137) y proporcionar agua ad libitum con una duración de 4 a 6 meses.

  1. Preparación del ratón:
    1. Alimentar a la ApoE - / - ratones con dieta occidental a partir de las 4 semanas de edad. La manipulación de la dieta debe comenzar directamente a la llegada.
    2. Mantener dieta occidental a lo largo de la duración del experimento. </ Li>

3. Análisis

  1. Modelo de hiperplasia miointimal (A)
    La región de interés en este modelo es el "área de la lesión". Opciones para el análisis incluyen obliteración luminal, relación I / M (relación íntima / media), grosor myointima máxima, área miointimal, tinción tricrómica para la fibrosis y tinción H & E para las células mononucleares (como se ilustra en las figuras 1A-1C). De acuerdo con la pregunta científica numerosas otras tinciones como el rojo Picrosirius para el colágeno, la inmunohistoquímica, y métodos confocales se pueden aplicar.
  2. Modelo de aterosclerosis (B)
    Las regiones de interés en este modelo son la válvula aórtica, arco aórtico, así como la aorta descendente. Opciones para el análisis: Sudán tinción con rojo para los lípidos y la tinción tricrómica de la válvula aórtica, arco aórtico y la aorta descendente (como se ilustra en la Figura 1D).
    Este modelo también produce una variedad de otras opciones de tinción comopor ejemplo Oil Red O de lípidos neutros, Picrosirius rojo, inmunohistoquímica, y métodos confocal.
    1. Sudán tinción con rojo: Realizar la tinción con rojo Sudán el tejido aórtico recién cosechado.
      1. Retire la 6h dieta antes de la cosecha.
      2. Introducir el ratón a un estado de anestesia con isoflurano (2%) la utilización de una cámara de inducción. Asegurar la ausencia de reflejos pellizcando el miembro posterior para controlar la profundidad suficiente de la anestesia.
      3. Abra el pecho; cortar la punta del corazón y perfundir a través del ventrículo izquierdo, primero con solución salina (3 ml), seguido de PFA al 4% (3 ml) a través de la raíz aórtica para fijar la aorta.
      4. Libere la aorta desde la raíz hasta su bifurcación. Trate de eliminar el tejido graso tanto como sea posible.
      5. Cortar el corazón y la raíz de la aorta, y almacenarlos en el 4% PFA para histología.
      6. Para la histología la raíz aórtica tiene que ser colocado con cuidado en el bloque de parafina en una posición vertical para permitir el corte de la AORdiapositivas generadoras raíz de tics que muestran los 3 valvas valvulares.
      7. Corte un extremo del árbol de la aorta y fijarlo sobre la capa de silicona con alfileres finos. Abra la aorta longitudinalmente y fijar el tejido aórtico.
      8. Enjuague el tejido con etanol al 50%. Sumergir el tejido con una solución de tinción de Sudan III durante aproximadamente 15 min.
      9. Enjuague ligeramente con etanol al 50% para eliminar el exceso de Sudán III. (Nota: El 50% de etanol puede lavar el tinte de distancia.) Enjuagar con dH 2 O, y tomar fotos para su posterior análisis.

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Representative Results

La figura 1 muestra las diferentes opciones de análisis y el estado de la enfermedad inducida por ambos modelos. Para el modelo de hiperplasia de la íntima, se muestra el análisis de secciones transversales representativas en la tinción tricrómica. A partir de estas secciones transversales, resultados como relaciones de I / M, espesor máximo de la placa, el espesor máximo de la íntima en el lumen, la obliteración luminal en por ciento, así como área de la placa pueden ser medidos y calculados.

Para evaluar el resultado del modelo de la aterosclerosis, todos los métodos mencionados anteriormente se pueden utilizar. Además, el área de la placa cuantitativa en la aorta abdominal, la medida de la formación de placa en la válvula aórtica, el arco aórtico, la aorta descendente y se puede medir a través de la tinción tricrómica.

Figura 1
Figura 1. Aortas de ratones denudados se cosechan, embebidos en parafina, y una sección transversal representativa se muestra en la tinción tricrómica (A). Cocientes I / M se calculan sobre tricrómico secciones teñidas mediante la medición de la íntima y el espesor de los medios de comunicación utilizando el análisis del equipo seguido de cálculo de la relación (B). El espesor máximo de la placa se mide como el espesor máximo de la íntima en el lumen por morfometría ordenador (B). Obliteración luminal (en porcentaje) se determina restando los nuevos lumen interior de las antiguas lumen, dividido por los antiguos lumen, multiplicado por 100% (C). El área de la placa se evaluó restando los nuevos lumen interior de las antiguas lumen (C). La aorta descendente, se abrió longitudinalmente con estructuras lipófilos y se tiñó con rojo Sudán se muestra (D). Para determinar el área cuantitativa placa, Sudán lesiones teñidas de rojo, así como el área total de la aorta, se miden y análisiszeta utilizando el software de análisis de imagen. Las secciones transversales de las muestras de parafina embebidos de la válvula aórtica, el arco aórtico y la aorta descendente en tricrómico se representan (E). Obliteración luminal, área de la placa, y el espesor máximo de la placa se calculan como se describió anteriormente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aunque ambas enfermedades resultan en síntomas similares en el paciente, los mecanismos subyacentes de desarrollo de la placa y por lo tanto, los enfoques de tratamiento son muy diferentes 2. En diferentes formas de estenosis arterial los hallazgos clínicos en los pacientes, así como el marco de tiempo de desarrollo de la placa dependen del mecanismo subyacente.

En función de los hallazgos clínicos en el paciente, diferentes métodos de análisis de la muestra deben realizarse 5,15. Es necesario adaptar el análisis a los hallazgos característicos en la enfermedad que está siendo imitada por el modelo elegido 14. A la inversa, dependiendo de la enfermedad que se está estudiando, el modelo animal más posible y apropiado debe ser elegido. Por otra parte, es fundamental que los nuevos medicamentos deben coincidir de manera mecánica el modelo.

Ambos modelos presentados en esta publicación son rápidos y fáciles de realizar y altamente reproducible. Hay algunos MAjor diferencias entre los modelos. Por ejemplo, el tiempo de observación en el modelo de hiperplasia miointimal es de 28 días 16, mientras que el desarrollo de la placa aterosclerótica necesita cuatro a seis meses 17.

Otra diferencia importante es la aplicabilidad a diferentes cepas de ratón. El modelo de aterosclerosis se basa en la ApoE - / - o LDL - / - en ratones y puede, por tanto, sólo se puede realizar en ratones portadores de esta eliminatoria específica. Para crear ratones que portan tanto la ApoE - / - y otro nocaut deseado es mucho tiempo. La hiperplasia miointimal la inducción de la lesión por balón de la cirugía se puede realizar en cualquier ratón. Los miointimales rendimientos más potenciales para modificar la cepa de ratones de interés, mientras que el modelo aterosclerótica se enfrenta a una limitación estricta a los ratones que llevan la ApoE modelo hiperplasia - / -.

La intensidad de la denudación con balón es crucial para el resultado de las lesiones de hiperplasia miointimales. Si la lesión del catéter se realiza demasiado aggressively, se puede producir la formación de aneurismas; si el despojo se realiza demasiado suavemente, desarrollo de la placa podría ser demasiado débil para ver las diferencias entre los grupos. En este procedimiento es útil que todas las cirugías en un estudio se llevan a cabo por la misma persona. La ventaja de la lesión por balón hacia otras técnicas que requieren la introducción de obstáculos rígidos o afilados como cables, es la flexibilidad, así como la opción de ajustar el tamaño y la presión del balón a través de la inflación del catéter de balón en la punta. Además, el catéter con punta de balón desinflado es delgada y se puede insertar en la aorta a través de una incisión relativamente pequeña en comparación con más gruesas, herramientas de denudación más rígidos. Para el modelo de formación de la placa aterosclerótica que puede ser crucial para iniciar la alimentación de la dieta occidental a una temprana edad de los ratones debido a que pueden tener un gran impacto en la gravedad de las lesiones. Dado que las lesiones en los dos modelos presentados se desarrollan tanto en ratones de ambos sexos, el género puede ser ADAPTEd para los requisitos del experimento.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Christiane Pahrmann para la asistencia técnica. SS recibió fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 y SCHR992/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thyoglycollate Broth 3% Fluka 70157 powder
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S 20%
Sudan III staining solution Sigma Aldrich S4131 powder
mouse C57BL/6J Jackson Laboratories Stock # 0006664
mouse ApoE -/- Jackson Laboratories Stock #002052
Western Diet Harlan Laboratories TD.88137
hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Forene Abbott Isoflurane
microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator Fine Science Tools 18056-14
catheter
10-0 prolene suture Ethicon 788G
6-0 prolene suture Ethicon 8709H
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
Rimadyl Pfizer Carprofen
Metacam 1.5 mg/ml Boehringer Ingelheim Metamizol

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References

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