कृंतक अधिवृषणी शुक्राणु के Phosphopeptide विश्लेषण

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Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).

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Abstract

शुक्राणु कोशिका प्रकार के बीच काफी अद्वितीय हैं। वृषण में उत्पादित हालांकि पूर्व कर्सर दौर सेल बढ़ाना और आकृति विज्ञान एक शुक्राणु के रूप में पहचाना जाता है में अंतर करने के लिए शुरू होता है, एक बार दोनों परमाणु जीन प्रतिलेखन और अनुवाद बंद कर रहे हैं। हालांकि, शुक्राणु गतिशीलता या अंडा मान्यता के लिए कोई क्षमता वाले, बहुत अपरिपक्व है। इन घटनाओं से दोनों शुक्राणु पारगमन एक बार अधिवृषण के रूप में जाना एक माध्यमिक अंग होते हैं। एक शुक्राणु कोशिका अधिवृषण के माध्यम से पारित करने के लिए इसे लेता है कि ~ 12 दिन बीतने के दौरान, मौजूदा प्रोटीन के बाद translational संशोधनों सेल की परिपक्वता में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं। इस तरह का एक प्रमुख पहलू प्रोटीन फास्फारिलीकरण है। शुक्राणु परिपक्वता के दौरान जगह लेने के फास्फारिलीकरण घटनाओं को चिह्नित करने के लिए, शुद्ध शुक्राणु सेल आबादी और phosphopeptides की पूर्व विभाजन दोनों की स्थापना की जानी चाहिए। शुद्ध शुक्राणु ओ के अलगाव के लिए, एक विधि निस्तब्धता तकनीक पीछे का उपयोगबाहर का या दुम epididymides से च उच्च गुणवत्ता और उपज उल्लिखित है। solubilization, पाचन, और 2 Tio आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुक्राणु phosphopeptides की पूर्व-विभाजन के लिए कदम समझाया जाता है। अलग होने के बाद, phosphopeptides शुक्राणु परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान फास्फारिलीकरण जगह लेने के स्तर विशिष्ट एमिनो एसिड के अवशेष पर दोनों प्रोटीन फास्फारिलीकरण घटनाओं की पहचान करने और यों के लिए एमएस में इंजेक्ट किया जा सकता है।

Introduction

वृषण से उभरा करने के बाद, शुक्राणु अत्यधिक अभी तक उल्लेखनीय भेदभाव कर रहे हैं, इन कोशिकाओं 1,2 अपरिपक्व हैं। जैसे, वे एक oocyte 3 करने के लिए तैरने की क्षमता और बाँध सहित पूर्ण कार्यक्षमता की कमी है। शुक्राणु कोशिका के आगे परिपक्वता की आवश्यकता है हालांकि उनके सेल भेदभाव प्रक्रिया के इस चरण में, वे जीन प्रतिलेखन और आगे प्रोटीन जैवसंश्लेषण 4 के काबिल नहीं हैं, के बाद से यह विहित मार्गों के माध्यम से जगह नहीं ले सकता। वे वृषण छोड़ दो और अधिवृषण 5 के रूप में जाना पुरुष प्रजनन प्रणाली का एक हिस्सा के रूप में दर्ज जैविक क्षमता शुक्राणुओं पर प्रदत्त है। अधिवृषण वीएएस deferens करने के लिए (वृषण का) अपवाही नलिकाओं को जोड़ता है और सभी पुरुष स्तनधारियों 6 में मौजूद है कि एक कसकर कुंडलित, अत्यधिक विभेदित ट्यूब है। शुक्राणु उत्तरोत्तर सीआर है जो कभी बदलते luminal वातावरण पर निर्भर है, अधिवृषणी वंश के दौरान उनके fertilizing संभावित अधिग्रहणस्थानीय अधिवृषणी उपकला कोशिकाओं 7 द्वारा eated। अधिवृषणी परिवेश अधिनियम में मौजूद विभिन्न स्रावी और पुनः अवशोषण गतिविधियों इसकी प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट और लिपिड रचना छह बदल रहा है, शुक्राणु खुद को संशोधित करने के लिए। इस संरचना का विशेष रूप से प्रारंभिक 'निस्सार' क्षेत्र अधिवृषण के महत्व, शल्य बंधाव तकनीक 8 का उपयोग कर उदाहरण दिया गया है। अपवाही वाहिनी बंधाव द्वारा वृषण भीतर बनाए रखा शुक्राणु पूरी तरह से डिम्बाणुजनकोशिका 9-11 खाद के लिए किसी भी क्षमता में कमी कर रहे हैं।

अधिवृषणी पर्यावरण के लिए इसके अलावा, शुक्राणु काम के भीतर संकेत पारगमन रास्ते-translationally पोस्ट मौजूदा शुक्राणु कोशिका पूरक संशोधित करने के लिए। उदाहरण के लिए, अधिवृषण के शुरुआती क्षेत्रों से शुक्राणु उन उत्तरार्द्ध क्षेत्रों 5,12 की तुलना में प्रोटीन फास्फारिलीकरण के विभिन्न पैटर्न प्रदर्शित करते हैं। सी में विशाल अंतर के बाद से वहाँ यह आश्चर्य की बात नहीं हैइन क्षेत्रों से शुक्राणु की apability। उदाहरण के लिए, जल्दी से, अधिवृषण निस्सार शुक्राणु immotilite हैं। इसके विपरीत, पुच्छ क्षेत्र से शुक्राणु कोशिकाओं को आगे एक बार आइसोटोनिक मध्यम में रखा प्रगतिशील गतिशीलता से गुजरना होगा। अधिवृषणी शुक्राणु कोशिकाओं डी-नोवो प्रोटीन जैवसंश्लेषण के काबिल नहीं हैं, शुक्राणु समारोह को विनियमित करने के लिए सभी आंतरिक रास्ते बाद translational संशोधनों (PTM) के माध्यम से किया जाना चाहिए। इसलिए, यह है कि प्रोटिओमिक्स कारण खड़ा है, और हम शुक्राणु कोशिका परिपक्वता को समझने के लिए कर रहे हैं विशेष रूप से इस तरह के फास्फारिलीकरण के रूप में PTMs की जांच एक प्रमुख जोर होना चाहिए।

एक वैकल्पिक तरीका 13-16 रेट्रो backflushing उपयोग करने के लिए epididymidies से शुक्राणु प्राप्त करने के लिए। इस तकनीक निश्चित रूप से अधिक समय लगता है और ऑपरेटर द्वारा कौशल का एक बड़ा डिग्री लेता है, शुक्राणु लगातार 99.99% से अधिक शुद्धता का प्रदर्शन प्राप्त की। इसके अलावा, सभी अन्य तकनीकों के विपरीत, शुक्राणु सीएn यह संभव शुक्राणु गतिशीलता शुरू की है कैसे अध्ययन करने के लिए कर रही है, एक मौन राज्य में अलग किया। नमूना तैयार प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह है के रूप में, शुक्राणु के अलगाव शुक्राणु-प्रोटिओमिक पढ़ाई के सर्वाधिक महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक बन गया है। इस प्रोटोकॉल पुच्छ अधिवृषण से अलग कर रहे हैं कि कैसे शुक्राणु पर एक विवरण प्रदान करता है। इस के बाद, 2 Tio phosphopeptide संवर्धन प्रक्रिया अत्यधिक विभेदित शुक्राणु कोशिकाओं से पेप्टाइड्स निकालने के लिए कैसे पर विशेष संदर्भ के साथ, उल्लिखित है। एमएस दृष्टिकोण एक के बाद एक राज्य में दुम अधिवृषणी शुक्राणुओं की तुलना रहे थे अगर बदलते phosphopeptides भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (immotile या गैर capacitated) शुक्राणु अध्ययन करने के लिए यह एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बनाने (आदि, प्रतिक्रिया व्यक्त की गतिशील, capacitated, अग्रपिण्डक) दूसरे करने के लिए समारोह।

Protocol

संस्कृति मीडिया और व्यंजन के 1. तैयारी

  1. 5.54 छ NaCl, 0.356 छ KCl, 0.25 छ 2 CaCl, 0.162 जी एच 2 को 4 पी, और 0.294 जी MgSO 4 मिल्ली क्यू पानी के एल 1 से जोड़कर Biggers Whitten और Whitten (BWW) 17 काम कर समाधान की 200 मिलीलीटर बनाओ । इस शेयर समाधान है और एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  2. शेयर समाधान से, 3 NaHCO की 420 मिलीग्राम जोड़ -, 200 मिलीग्राम ग्लूकोज, 6 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट, 600 मिलीग्राम गोजातीय सीरम albumin, 0.74 मिलीग्राम सोडियम लैक्टेट, और BWW स्टॉक के 4.0 HEPES बफर के मिलीलीटर 193 मिलीलीटर। यह काम कर समाधान है और हमेशा प्रयोग करने से पहले दिन पर ताजा किया और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए equilibrated है।
  3. प्रवेशनी बनाने के लिए, ट्यूबिंग पिघला करने के लिए शुरू होता है (आमतौर पर मेथनॉल लौ) इस तरह के 0.4 मिमी की एक आंतरिक व्यास और 1.1 मिमी की एक बाहरी व्यास के साथ पॉलीथीन (पीई) ट्यूबिंग लेने के लिए और एक कम गर्मी पर पकड़। इसके तत्काल बाद outw ट्यूबिंग खींचएआरडी खिंचाव और बाहरी व्यास संकरा बनाने के लिए।
  4. वीएएस deferens की आसान केन्युलेशन के लिए अनुमति देता है जो एक छोर की एक संकुचन उत्पादन के लिए काटा।
  5. के बारे में 15 सेमी तक प्रवेशनी के दूसरे छोर काटें। कुंद अंत में एक 30 जी सुई डालें, और यह करने के लिए एक 3 मिलीलीटर सिरिंज देते हैं (पूरी तरह से मुकर)।
  6. पीई ट्यूबिंग (4.2 मिमी आंतरिक व्यास, 6.4 मिमी बाहरी व्यास) के एक 20 सेमी लंबाई काटने से एक चूषण मुखपत्र बनाओ। एक छोर में एक मुखपत्र डालें।
  7. सूक्ष्म केशिका ग्लास ट्यूब धारक और कांच सूक्ष्म केशिका ही (एक माउस के लिए आमतौर पर 3 μl, एक चूहे के लिए 40 μl) डालें।

माउस से Epididymides 2. निकालना

  1. प्रत्येक संस्था के लिए विशिष्ट IACUC-अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों euthanize।
  2. पशु ले लो और अधिवृषण को बेनकाब करने के अंडकोश की थैली में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। घड़ीसाज़ # 5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग गुहा के बाहर वृषण और अधिवृषण खींचो।
  3. ऐसी है कि कम से कम 1-2 सेमी पुच्छ अधिवृषण में जुड़े रहते हैं वीएएस deferens काटें। इसके अलावा, वृषण को अधिवृषण जोड़ने समीपस्थ अपवाही नलिकाओं और ऊतक में कटौती और पूरे पुरुष प्रजनन ट्रैक को हटा दें।
  4. 5-40X के क्रम में एक बढ़ाई रेंज के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पूरे पुरुष प्रजनन ट्रैक रखें।

3. अधिवृषण Cannulating

  1. संकुचित (शंकु के आकार का) अंत के 1-2 सेमी लेंस के माध्यम से नि: शुल्क और दिख रहा है कि इस तरह की खुर्दबीन के लिए प्रवेशनी नीचे टेप,।
  2. घड़ीसाज़ # 5 संदंश की एक जोड़ी ले लो और धीरे वीएएस deferens के प्रत्येक पक्ष पकड़ और प्रवेशनी वीएएस deferens में चला जाता है, जैसे कि प्रवेशनी पर वीएएस deferens खींच।
  3. गैर absorbable काली लट में इलाज रेशम (आकार 5-0) की लंबाई ले लो और cannulated वीएएस deferens के चारों ओर एक गाँठ बाँध। सुनिश्चित करें गाँठ वीएएस deferens अंदर प्रवेशनी पकड़ को कसकर खींच लिया है जब हवा के दबाव frओम सिरिंज लागू किया जाता है।

4. प्रतिगामी या दुम अधिवृषणी शुक्राणु के Backflushing

  1. Watchmakers # 5 संदंश का प्रयोग, पुच्छ epididymides के बाहर का अंत हड़पने के लिए और एक एकल अधिवृषणी छोटी नली का पर्दाफाश करने के क्रम में Tunica धवल हटा दें।
  2. संदंश का प्रयोग, धीरे पर्दाफाश करने के लिए छोटी नली बाहर खींचने के लिए और शुक्राणु रिलीज होने के लिए के लिए एक खोलने बनाने के लिए इतनी के रूप में तो अलग तंग।
  3. वीएएस deferens में सिरिंज से हवा निष्कासित करने के लिए इतनी के रूप में धीरे 3 मिलीग्राम (माउस) या 20 मिलीलीटर (चूहा) सिरिंज पर धक्का। उचित दबाव में, शुक्राणु धीरे धीरे पुच्छ अधिवृषण के बाहर अंत में टूटा छोटी नली से बाहर आने के लिए शुरू कर देंगे। इस समय, कांच केशिका में शुक्राणु आकर्षित करने के मुखपत्र के लिए सक्शन लागू होते हैं। नोट: आमतौर पर एक माउस में, शुक्राणु के 2-3 μl जानवर की उम्र के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है। एक चूहे की इच्छा, औसत उपज 30-40 μl पर।

5. धुलाईऔर प्रोटिओमिक्स के लिए तैयारी में शुक्राणु lysing

  1. धीरे मुखपत्र में उड़ाने या एक सिरिंज संलग्न और केशिका से बाहर वापस शुक्राणु पुश करने के लिए इतनी के रूप में हवा को खदेड़ने द्वारा BWW समाधान के 1 मिलीलीटर समाधान (37 डिग्री सेल्सियस) में कांच केशिका से शुक्राणु निष्कासित।
  2. शुक्राणु कोशिकाओं को दूर तक फैला हुआ हो जाने के बाद, contaminating प्रोटीन को हटाने के लिए 1 मिलीलीटर BWW साथ 3x (300 XG, 5 मिनट) धो लें। अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटा दें। नोट: इस बिंदु पर, शुक्राणु कोशिकाओं बाद में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है।
  3. रुक-रुक कर vortexing के साथ 1 घंटे के लिए 4% CHAPS, 2 एम Thiourea, और 50 मिमी Tris, पीएच 7.4 का उपयोग कर प्रोटीन solubilize।
  4. कोशिकाओं, अपकेंद्रित्र (10,000 XG, 20 मिनट) lysing के बाद, सतह पर तैरनेवाला लेने के लिए और एक नया ट्यूब को हस्तांतरण। नोट: इस बिंदु पर, प्रोटीन मात्रा का ठहराव किया जा सकता है।

6. डाइसल्फ़ाइड बांड कमी और alkylation

  1. Lysed प्रोटीन के लिए एक अंतिम एकाग्रता के रूप में 10 मिमी डीटीटी जोड़ें, vortपूर्व और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  2. Lysate, भंवर के लिए एक अंतिम एकाग्रता के रूप में idodoacetamide 50 मिमी जोड़ें और अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।

7. वर्षा

  1. मेथनॉल क्लोरोफॉर्म, lysate के एक मात्रा (एक उदाहरण के रूप में 400 μl) जोड़कर नमूना वेग मेथनॉल की एक मात्रा (400 μl) और 0.5 मात्रा (200 μl) क्लोरोफॉर्म जोड़ें।
  2. भंवर नमूना और स्पिन (10,000 XG, दो मिनट)।
  3. दो चरणों Centrifugation के बाद दिखाई देगा कि ध्यान दें। शीर्ष परत (सावधान किया जा रहा इंटरफ़ेस परेशान करने के लिए नहीं) के सभी लेकिन 2 मिमी त्यागें।
  4. मेथनॉल की एक मात्रा (400 μl) जोड़ें, पलटना ट्यूब धीरे (10,000 XG, 15 मिनट) का मिश्रण है और फिर से स्पिन करने के लिए 1-2x। 3-4 मिनट के लिए बर्बाद करने के लिए सतह पर तैरनेवाला और शुष्क हवा गोली त्यागें।

8. ट्रिप्सिन पाचन

  1. 50 के अनुपात को 1 एम यूरिया युक्त 25 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट में ट्रिप्सिन पुनर्गठित: 1 (/ डब्ल्यू डब्ल्यू, प्रोटीन: ट्रिप्सिन) और ove incubatedअधिमानतः एक thermomixer पर 700 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर rnight।
  2. स्पिन (10,000 XG, 15 मिनट) पचाया सामग्री गोली। नई ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।

9. Phosphopeptide संवर्धन

  1. पहले से 18 के रूप में वर्णित पचाने tryptic से शुद्धि और phosphopeptides के संवर्धन कार्य करें। 350 मिलीग्राम / एमएल 2,5 dihydrobenzesulfonic एसिड (DHB), 80% (वी / वी) ACN (acetonitrile), 2% (वी / वी) में TFA (trifluoroacetic: tryptic पेप्टाइड्स DHB बफर में 10 गुना पतला [DHB बफर के होते हैं एसिड)] और 2 Tio मोती (200 माइक्रोग्राम प्रति) सुखाने के लिए लागू होते हैं।
  2. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक रोटेटर पर छोड़ दें।
  3. , DHB बफर के साथ नमूना धो स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। तो नमूना धोने बफर [80% ACN (वी / वी), 2% TFA (वी / वी)] DHB को दूर करने के साथ तीन बार धोएं।
  4. अंतिम स्पिन के बाद, सीधे 2.5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 25 μl, पीएच ≥ 10.5 समाधान जोड़कर क्षालन बफर का उपयोग phosphopeptides elute। एसपिन और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। इसके तत्काल बाद ~ 0.3 μl फार्मिक एसिड के साथ बेअसर।

Representative Results

किसी भी प्रोटिओमिक विश्लेषण से परिणामों की गुणवत्ता को शुरुआती सामग्री पर निर्भर है। आधुनिक एमएस के साथ, नमूना तैयारी में मामूली संदूषण आसानी से उठाया जाता है। इसलिए, यह अत्यधिक शुद्ध शुक्राणु देता है एक विधि का चयन करने के लिए, शुक्राणु कोशिका प्रोटिओमिक्स के मामले में गंभीर है। चित्रा 1 में सचित्र के रूप में, प्रतिगामी backflushing पुच्छ अधिवृषण से शुक्राणु कोशिकाओं को पुन: प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह एक धीरे-धीरे जुड़ी सिरिंज से हवा का दबाव लागू करने के लिए अनुमति देता है जो पीई ट्यूबिंग साथ वीएएस deferens cannulating शामिल है। चित्रा 1 ए वीएएस deferens के साथ मिलकर पुच्छ अधिवृषण को दर्शाता है। चित्रा 1 बी वीएएस deferens बंधा हुआ है कि कैसे एक ऊपर बंद गोली मार दी है, जहां प्रवेशनी डाला जाता है। करने में, तो, शुक्राणु दुम epididymides से एक छोटी नली के excised अंत में जारी किया जाता है। 2A चित्रा में दिखाया गया है, शुक्राणु caud के शीर्ष क्षेत्रों से निकाले जाते हैंएक अधिवृषण और एक मौन राज्य (चित्रा 2B) में एक गिलास केशिका में शोषित कर रहे हैं। इस से पहले और गतिशीलता की सक्रियता के बाद शुक्राणु का एक phoshoproteomic विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता नहीं है जो कम से कम पारंपरिक "तैरना अप" के तरीकों, पर कई फायदे हैं। शुक्राणु तो किसी की पसंद के मीडिया में निष्कासित कर दिया जा सकता है। चित्रा -2 (बाएं हाथ की ओर) शुक्राणु BWW मीडिया में निष्कासन के बाद तुरंत देखने के लिए दर्शाता। कोशिकाओं के कई एक साथ clumped कर रहे हैं। वे समाधान (चित्रा -2, दाहिने हाथ की ओर कोशिकाओं) में एकरूपता के लिए बाहर तैर हालांकि, क्योंकि कोशिकाओं के बाद 10 मिनट क्षमता का प्रदर्शन किया है। Backflushing तकनीक शुक्राणु कोशिकाओं पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है के बाद से, हम करीब 100% गतिशीलता को प्राप्त करने और कोशिकाओं को बाहरी उत्तेजना के बिना मीडिया में तेजी से फैलाने के। एक ठेठ backflushing प्रयोग में, शुक्राणु स्विस माउस को समाहित से बरामद6 से 10 एक्स 1-5 के बीच कोशिकाओं। इस जानवर की उम्र पर निर्भर है और चूहों के विभिन्न प्रकारों से भिन्न हो सकते हैं। एक नार्वे चूहे में, हम आम तौर पर 200 एक्स 10 6 शुक्राणु प्राप्त, 20% ±। चित्रा 2 डी चूहे पुच्छ अधिवृषण से प्राप्त शुक्राणुओं की पवित्रता का प्रतिनिधित्व करता है।

नमूना खुद इसके अलावा, नमूना तैयार करने के विषय में प्रमुख मुद्दों में से एक trypsin पाचन की उपज है। प्रोटीन तेज़ी लेकिन यह भी प्रोटीन denaturing में, न केवल एमएस के साथ असंगत हैं, जो दोनों के अवांछित डिटर्जेंट और लवण, को दूर करने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। हम सबसे अच्छा काम करने के लिए मेथनॉल क्लोरोफॉर्म वर्षा पाया है। इतना ही नहीं इस प्रक्रिया टीसीए वर्षा 19 सहित अन्य लोगों की तुलना में बेहतर कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन वेग को सूचित किया गया, लेकिन यह अतिरिक्त फायदे की है। टीसीए वर्षा के बाद, यह काफी रह सकते हैं जो टीसीए गोली के निलंबन के बाद पीएच मरम्मत करने के लिए अक्सर आवश्यक हैअम्लीय। टीसीए की उपजी गोली एसिड को दूर करने के लिए उच्च कार्बनिक समाधान में धोया जा सकता है, इस से निपटने और परिणामों की irreproducibility नमूना करने के लिए कहते हैं। एसिड बेअसर करने में विफलता गरीब tryptic पेप्टाइड पैदावार में परिणाम होगा। मेथनॉल क्लोरोफॉर्म वर्षा न केवल जल्दी है लेकिन नमूना खट्टा करना नहीं होगा। 3 आम तौर पर निचले और ऊपरी interphase के बीच नमूना के 100 माइक्रोग्राम प्रति से देखा प्रोटीन गोली दिखाता है चित्रा।

phosphopeptides के अलगाव के तरीकों की एक संख्या में हो सकता है; हालांकि reproducibility के नमूना इस स्तर सहित अप करने के लिए नियंत्रित किया गया है और कैसे पर निर्भर करता है। अधिक आम है, के विकास के तरीकों में से एक 2 Tio है, मूल रूप से मार्टिन लार्सन 18,20,21 के समूह द्वारा विकसित की है। Microcolumns में उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया के रूप में वर्णित है, हम बैच क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त कर सकते हैं। प्रक्रिया की सफलता क्षालन बफर पर निर्भर है, पागल, जो होना चाहिए सही संरचना के साथ ई; अन्यथा phosphopeptides सब पर eluted नहीं कर रहे हैं।

2 Tio से प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि डेटा के reproducibility एक गैर गतिशील (चित्रा 4 ऊपर) और मीटर से गतिशील (चित्रा 4 नीचे) राज्य में पुच्छ अधिवृषणी शुक्राणु से phosphopeptides समृद्ध / Z 650-670 देखा जा सकता है। हम इस जैविक प्रतिकृति 17 का उपयोग करते हुए भी जब एक बेहद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक है कि प्रदर्शन किया है। समय के साथ प्रदर्शित होने नीली धारियाँ acetonitrile बढ़ जाती है की एकाग्रता के रूप में एक C18 नैनो स्तंभ से eluting पेप्टाइड्स हैं। जाहिर है, गतिशील आबादी में (एन = 3, दिखाया एन = 8 आम तौर पर चलाने के लिए), गैर गतिशील रेंज में पूरी तरह से अनुपस्थित है कि 651.5 दा रेंज के चारों ओर एक monoisotopic जन के साथ, एक पेप्टाइड क्लस्टर है। अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री तो इस पेप्टाइड की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है।

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चित्रा 1:। पुच्छ अधिवृषण के पुच्छ अधिवृषण की केन्युलेशन (ए) चित्र। प्रवेशनी खुद पूर्व खींचा अंत के लगभग 1-2 सेमी का पर्दाफाश करने के लिए नीचे टेप है। यह ठीक # 5watchmakers संदंश का उपयोग वीएएस deferens में डाला जाता है। (बी) प्रवेशनी वीएएस deferens और प्रवेशनी दोनों से युक्त एक खंड के आसपास ठीक रेशम बांधने द्वारा जगह में आयोजित किया जाता है। माउस से, दुम अधिवृषणी कोशिकाओं और तरल पदार्थ के लगभग 2-3 μl 1 एक्स 10 6 / μl की एकाग्रता में एकत्र कर रहे हैं। चूहे (दिखाया गया है) से, तरल पदार्थ की लगभग 30-40 μl समान मात्रा में प्राप्त कर रहे हैं।

चित्रा 2
चित्रा 2: सक्षम अधिवृषणी शुक्राणु एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया गिलास केशिका। (ए) पुच्छ ई के शीर्ष से एक छोटी नली pididymis पृथक और टूटी हुई है। इस दिखाया जाता है तब होता है, जिसमें से लगभग स्थिति। (बी) छवि के ऊपर एक खाली गिलास केशिका ट्यूब से पता चलता है और नीचे एक पहले से backflushed चूहे से एक से पता चलता है। कोई रक्त प्रदूषण और कम से कम उपकला कोशिका संदूषण है। (सी) शुक्राणु अभी अधिवृषणी तरल पदार्थ में undiluted कर रहे हैं, वे सक्रिय करने के लिए शुरू नहीं किया है। शुक्राणु शुरू में एक BWW समाधान में निष्कासित कर रहे हैं, वे एक कॉम्पैक्ट "स्ट्रिंग" (बाएं हाथ की ओर) के रूप में बाहर आ गए। 10 मिनट के बाद शुक्राणु के सबसे अधिक किसी भी बाहरी अशांति (दाहिने हाथ की ओर) के बिना समाधान में तैरने के बाद से सेल की क्षमता को आसानी से स्थापित है। (डी) वे तैरने के लिए छोड़ दिया गया है के तुरंत बाद दुम अधिवृषणी कोशिकाओं के एक विभाज्य की तस्वीर बाहर की कोशिकाओं की पवित्रता को दर्शाता है।

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चित्रा 3:। मेथनॉल क्लोरोफॉर्म तेज़ी एक बार शुक्राणु solubilized किया गया है, घुलनशील अंश मेथनॉल क्लोरोफॉर्म प्रोटीन और दूषित पदार्थों को हटाने की विकृतीकरण सुनिश्चित करने के लिए उपजी है। प्रोटीन गोली मेथनॉल / पानी और क्लोरोफॉर्म चरणों के बीच इंटरफेस पर दिखाई देता है। इस गोली को परेशान करने के लिए नहीं के रूप में तो ऊपर परत ध्यान से निकाल दिया जाता है। यह कोई प्रोटीन खो जाता है तो के रूप में ऊपरी चरण के बारे में 2-3 मिमी छोड़ने के लिए आम बात है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। ठेठ 2 Tio -enriched phosphopeptide प्रोफाइल वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, दुम अधिवृषणी शुक्राणु (शीर्ष N = 3) immotile दोनों में अलग-थलग पड़ गए थे या गतिशील राज्य अमेरिका (नीचे, एन = 3)। ~ 651.5 डी का एक मोनो समस्थानिक जन के साथ एक पेप्टाइड क्लस्टरएक immotile वाले (तीर) में गतिशील आबादी में मौजूद है, लेकिन पूरी तरह से अनुपस्थित होने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार की तुलना "लेबल से मुक्त (एमएस-आधारित)" के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। पेप्टाइड द्रव्यमान और अवधारण समय तो पेप्टाइड निकाली थी जिसमें से प्रोटीन मिलकर-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए परिसर को निशाना बनाने और पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

Discussion

शुक्राणु का एक सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: शुरू सामग्री की 1) पवित्रता; अवांछित लवण और डिटर्जेंट की 2) को हटाने; ट्रिप्सिन प्रोटीन की एक उच्च उपज को पचाने के लिए अनुमति देने के लिए इतनी के रूप में 3) अपनी पूरी हद तक प्रोटीन denaturing और 4) पेप्टाइड के नुकसान को कम करने के लिए से निपटने नमूना कम से कम।

सफलतापूर्वक पुच्छ अधिवृषण backflush करने के लिए, यह शुक्राणु बाहर निकल जाएगा, जिसमें से क्षेत्र का पता लगाने के लिए आवश्यक है। चूहे और चूहों दोनों के मामले में, इस अधिवृषण की दुम क्षेत्र के बीच में (2A चित्रा देखें), अवतल क्षेत्र के शीर्ष पर है। एक वीएएस deferens की ओर आगे आता है, backflushing आसान होता है और सफलता की दर आम तौर पर अधिक है। हालांकि, इस शुक्राणु संख्या के नुकसान पर आता है। एक कोष को और अधिक समीपस्थ स्थानांतरित करने के लिए प्रयास करता है, तो वैकल्पिक रूप से, फिर दबाव की राशि epididym के माध्यम से वापस शुक्राणु पुश करने के लिए आवश्यकअल नलिकाओं अधिवृषण के लिए नुकसान का अनिवार्य रूप से होता है कि, अक्सर बहुत अधिक है।

अधिवृषण की Backflushing पारंपरिक रूप से शुक्राणु 22-25 दूर करने के लिए पानी से संतृप्त खनिज तेल और एक माध्यम के रूप में सिरिंज अपने आप में एक संतुलित नमक समाधान का उपयोग किया जाता है। दोनों प्रक्रियाओं नियंत्रण रेखा-एमएस की संभावित समस्याग्रस्त हैं। सबसे पहले, खनिज है कि कोई भी प्रक्रिया में आगे किया जाता है ताकि लिया जाना चाहिए मूल रूप से प्रोटिओमिक विश्लेषण और देखभाल के लिए दुनिया भर में उपयोग किया जाता है कि नैनो-C18 नैनो स्तंभों को ब्लॉक करने की संभावना है। यदि ऐसा होता है, इसे जारी करने के लिए असंभव है और नमूना अनिवार्य रूप से खो दिया है। यह इस सफल है, हम जल्द ही BWW समाधान संपर्क में आया जल्द ही के रूप में के रूप में शुक्राणु के कई गतिशील हो जाते हैं कि मान्यता प्राप्त है और दुम अधिवृषणी के साथ मिश्रित है, तथापि BWW या सिरिंज में अन्य संतुलित नमक समाधान है, के उपयोग के द्वारा दूर किया जा सकता है कोशिकाओं। इस समस्या को नाकाम करने के लिए हम बस हवा के साथ शुक्राणु backflush। इतना ही नहीं योग्यता को सीधे हैतरल आधारित विधियों के बराबर शुक्राणु के अल्पसंख्यक, लेकिन मात्रा समान है।

Phosphoproteomics शायद संकेत दे रास्ते शुक्राणु के बाद स्खलन में उत्पन्न कर रहे हैं, जो स्थापित करने के लिए केवल तरीकों में से एक है। हम जांच कर रहे हैं प्रमुख रास्ते में से एक कैपेसिटेशन की प्रक्रिया है। यह एक अंडे के लिए बाध्य करने में सक्षम है इससे पहले कि शुक्राणु "कैपेसिटेशन" से गुजरना होगा। व्यवहार में, यह समय की अवधि के लिए शुक्राणु incubating द्वारा मूल रूप से प्राप्त किया जाता है (; चूहे 1.5 घंटा, माउस 40 मिनट मानव 3-24 एचआर) सीरम albumin साथ BWW समाधान में। इससे पहले, हम और दूसरों कैपेसिटेशन में शामिल कई kinases के लिए एक भूमिका से पता चला है। ब्याज की, PKA का विलोपन द्वितीय जिसका शुक्राणु इन विट्रो में अनायास तैरना चूहों उपज है, लेकिन hyperactivation 26 से गुजरना नहीं कर सकते हैं μ। बाद के शुक्राणु एक कम करने के लिए, एक उच्च वेग, कम आयाम से उनके तैराकी पैटर्न बदलने, जिससे कैपेसिटेशन की एक बानगी हैवेग, उच्च आयाम आवृत्ति हराया। हम इस प्रक्रिया में शामिल बहाव के kinases pp60-cSRC (एसआरसी) शामिल पता चला है 13,27 सी-हाँ 28 और सी-एबीएल 14। दिलचस्प है, एसआरसी के निषेध कैपेसिटेशन निर्भर टाइरोसीन फास्फारिलीकरण 13 बंद हो जाता है। हालांकि, इस एसआरसी सीधे टाइरोसीन फास्फारिलीकरण 29 की सामान्य शुरुआत में शामिल नहीं है, लेकिन एक फॉस्फेट 29 को विनियमित कर सकते हैं, सुझाव है कि okadaic एसिड के साथ दूर किया जा सकता है। अधिवृषण के बाहर शुक्राणु के लिए मजबूर करने के लिए एक माध्यम के रूप में BWW उपयोग करने के साथ समस्या यह है कि एक बार सक्रिय, माउस शुक्राणु केवल अधिकार-युक्त करना करने के लिए लगभग 40 मिनट ले रहा है। शुक्राणु के अलगाव 5 मिनट / माउस और अक्सर कई चूहों एक प्रयोग में इस्तेमाल कर रहे हैं लग सकता है कि यह देखते हुए, तो शुक्राणु प्रयोग के शुरू में परिपक्वता के विभिन्न चरणों में किया जाएगा। इस पर काबू पाने के लिए, हवा के दबाव एक गिलास प्रवेशनी में दुम अधिवृषण से शुक्राणु पुश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इतना ही नहीं सभी शुक्राणु inact हैंive और वे दुम परिवेश में पाया जाएगा के रूप में अनिवार्य रूप से, यह है कि यह संभव गैर गतिशील और गतिशील phosphoproteomics तुलना करने के लिए बनाता है।

दो अलग अलग कार्यात्मक राज्यों में शुक्राणुओं की तुलना करते समय phosphoproteomics से निपटने के लिए नमूना एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए। प्रोटीन तेज़ी 1) के अन्य पारंपरिक तरीकों पर मेथनॉल क्लोरोफॉर्म का उपयोग 2) लवण और वसा के लगभग सभी निशान को हटा और 3) टीसीए 19 से अधिक कम बहुतायत प्रोटीन वेग के लिए एक साबित करने की क्षमता है, अतिरिक्त धोने कदम के लिए की जरूरत कम हो जाती है। ट्रिप्सिन पाचन के लिए पहले प्रोटीन तेज़ी प्रोटीन (ट्रिप्सिन पाचन एड्स) denature करने के लिए इस मदद करता है, लेकिन सेल में मौजूद एमएस असंगत चयापचयों के कई को हटा नहीं के बाद से ही सिफारिश की है।

शुक्राणु phosphopeptides की तुलना तरीकों की एक संख्या में किया जा सकता है। दूसरे में है कि बुनियादी स्तर पर, एक नमूने में पहचान phosphopeptide का एक सरल तुलना में,"वर्णक्रमीय गिनती" के रूप में जाना प्रक्रिया में नमूना किया जा सकता है। जल्दी प्रोटिओमिक पढ़ाई कम प्रतिकृति उपयोग कर रहे थे क्योंकि हालांकि आलोचना मूल रूप से इस दृष्टिकोण पर किया गया है (एक फुलर चर्चा के लिए Lundren एट अल। 30 देखें)। एक और अधिक परिष्कृत दृष्टिकोण पेप्टाइड माता पिता के लिए बड़े पैमाने पर की तीव्रता को देखो और अन्य नमूने (लेबल से मुक्त तुलना) के साथ इस तुलना करने के लिए है। चित्रा 4 में दिखाए गए उदाहरण में, मी / z 650-670 से गैर गतिशील से (चित्रा 4 ऊपर) से अनुपस्थित लेकिन गतिशील में मौजूद एक पेप्टाइड (चित्रा 4 नीचे) शुक्राणु देखा जा सकता है। एमएस आधारित लेबल मुक्त मात्रा का ठहराव के रूप में निर्दिष्ट इस प्रक्रिया को एक लेबल मुक्त रणनीति है।

सामान्यतः प्रोटिओमिक मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक रन की मात्रा को कम करने के लिए इस्तेमाल एक वैकल्पिक रणनीति आइसोटोप का उपयोग करने के लिए है। एक आइसोटोप की बड़े पैमाने पर अलग है, मास स्पेक्ट्रोमीटर elut की तीव्रता तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपेप्टाइड्स आईएनजी। हालांकि, अधिकांश अन्य प्रकार की कोशिकाओं के विपरीत, कुछ समस्थानिक लेबलिंग शुक्राणुओं को लागू नहीं किया जा सकता है। टिशू कल्चर में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, स्थिर आइसोटोप के अलावा (एक हल्का संस्करण दूसरे करने के लिए जोड़ा जाता है, whilst एक भारी आइसोटोप, एक नमूना करने के लिए कहा जाता है)। आइसोटोप प्रोटीन में शामिल हो, एक प्रोटिओमिक्स विश्लेषण दो नमूने (बहुसंकेतन) के संयोजन के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि शुक्राणु के मामले में, इस 1) आइसोटोप लेबलिंग टिशू कल्चर में () 8 तक कई मार्ग की आवश्यकता है और 2) शुक्राणु कोशिकाओं इसलिए कोई परमाणु जीन प्रतिलेखन और अनुवाद किया है और कहा कि बस तथ्य के आधार पर, नहीं किया जा सकता वे वैसे भी अपने सभी प्रोटीन में आइसोटोप को शामिल नहीं कर सकते। इस के चारों ओर एक तरह से radiolabelled चूहों ऑर्डर करने के लिए है, हालांकि, इन बेहद महंगे हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक रासायनिक टैग का उपयोग करने के लिए है। इस गैर-capacitated चूहों capacitated चूहों के साथ तुलना की गई है जब से किया गया है। इस मामले में, एक डी 0 और एक डी में 31 में एक नमूना और एक अन्य के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। अन्य दृष्टिकोण lysines अलग द्रव्यमान आइसोटोप के साथ रासायनिक चिह्नित कर रहे हैं जिससे iTRAQ (सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation के लिए समदाब रेखीय टैग), के उपयोग में शामिल कर सकते हैं; cysteines अलग द्रव्यमान आइसोटोप और भारी और हल्के जल लेबलिंग के साथ चिह्नित कर रहे हैं जिससे ICAT (आइसोटोप कोडित आत्मीयता टैग)।

प्रत्येक और हर मामले में, हालांकि, एक बात को ध्यान में रखा जाना चाहिए। एमएस केवल एक नमूने में मौजूद है क्या रिपोर्ट है, और यह है कि बात करने के लिए कि नमूना अप करने के लिए हुआ है कि सब कुछ का एक प्रतिबिंब है। हर कदम पर उपज को अधिकतम whilst के नमूना हैंडलिंग कम से कम एक सफल प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए आवश्यक है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia solution 25% Merck 1.05432
Ammonium bicarbonate Sigma A6141
Calcium chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
Disodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic acid Sigma L1750
Magnesium chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium hydrogen carbonate Medical Store CH 600
Sodium bicarbonate Sigma S3817
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium dihydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium pyruvate Sigma S8636
Tris, ultra pure grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc chloride Sigma Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 G needle Terumo NN2038R
3 ml Syringe Terumo SS035
4.2 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856

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