משלוח שחרור איטי תרופות דרך Elvax 40W לרשתית העכברוש: ​​השלכות לטיפול במצבים כרוניים

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

מאמר זה מפרט כיצד Elvax 40W יכול לשמש כשיטת שחרור איטי לאספקת סמים לרשתית החולדה הבוגרת. הפרוטוקול להכנה, טעינה, ומספקים מורכב סמים שרף לעין מתואר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fiorani, L., Maccarone, R., Fernando, N., Colecchi, L., Bisti, S., Valter, K. Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions. J. Vis. Exp. (91), e51563, doi:10.3791/51563 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחלות של הרשתית הן קשות לטיפול כרשתית נמצאת עמוק בתוך העין. שיטות פולשניות של משלוח סמים פעם נדרשות לטיפול במחלות אלה. מחלות רשתית כרוניות כגון בצקת או neovascularization רשתית בדרך כלל דורשות זריקות תוך עיניות מרובות כדי לטפל במצב בצורה יעילה. עם זאת, הסיכונים הכרוכים בזריקות אלה יגדלו עם משלוח חוזר ונשנה של התרופה. לכן, שיטות משלוח חלופיות צריכה להיות הוקמו כדי למזער את הסיכונים של reinjection. כמה חקירות אחרות פיתחו שיטות לאספקת תרופות לאורך זמן ממושך, באמצעות חומרים המסוגלים שחרור כימיקלים לאט לתוך העין. בחקירה זו, אנו מתארים את השימוש בElvax 40W, שרף קופולימר, לפעול ככלי להעברת תרופות לרשתית החולדה הבוגרת. השרף הוא עשה ועמוס בסמים. מורכב סמים השרף מושתל אז לתוך חלל הזגוגית, שבו היא תשחרר לאט את התרופה מעל tiשלי. שיטה זו נבדקה באמצעות 2-אמינו-4-phosphonobutyrate (APB), אנלוגי גלוטמט שחוסם את תגובת האור של הרשתית. זה הודגם כי APB שוחרר לאט מהשרף, והיה מסוגל לחסום את תגובת הרשתית על ידי 7 ימים לאחר השתלה. זה מצביע על כך משלוח סמים שחרור איטי באמצעות שרף קופולימר זה הוא יעיל לטיפול ברשתית, ויכולים לשמש טיפולי עם בדיקות נוספות.

Introduction

הטיפול במחלות כרוניות כמו סוכרת ולחץ דם גבוה מציבה בפנינו אתגרים רבים, כמו מחלות אלה בדרך כלל דורשים טיפול לתקופות ממושכות של זמן, לעתים קרובות לכל חיים. זה נקרא לפיתוח מערכות למתן תרופות שחרור האיטי, המקטין את הצורך במינון תכוף. יעילותן של שיטות שחרור איטיות אלה הודגמה באמצעות הפיתוח של משאבות אינסולין, כדי להפחית את מספר זריקות אינסולין הנדרש לטיפול בסוכרת. מחלות כרוניות של העין, במיוחד אלה המשפיעים על השכבות הפנימיות שלה, דורשים את המתן התכוף של תרופות באמצעות הליכים פולשניים. מחלה כרונית אחת כזו המשפיעה על העין האנושית היא ניוון מקולרי גיל קשור (AMD). זה משפיע על הרשתית המרכזית, שהיא שכבה של רקמה עצבית הממוקמת בחלק האחורי של העין אחראית על ייזום חזון. AMD הוא הגורם המוביל לעיוורון בעולם המערבי 1. אתגר מיוחד בטיפול מחדשהמחלות tinal היא שנדרשת לתרופה להגיע שכבה עמוקה זו בעיניים, אשר לעתים קרובות דורשת שיטות פולשניות של משלוח. תרופות בדרך כלל מנוהלות לתא הזגוגית והרשתית באמצעות זריקות זגוגית. עם זאת, עם כל זריקה יש סיכון לסיבוכי postinjection, כולל אנדופתלמיטיס, היפרדות רשתית, קטרקט והדימום זגוגי 2. סיכון זה מוכפל עם כל reinjection של התרופה.

הקטנת הצורך של זריקות מרובות תהיה יתרון עיקרי בטיפול בAMD. לטיפול בצורה הרטובה של AMD, שבו צמיחת כלי חדשה היא סימן היכר, האסטרטגיה הטיפולית שהוקמה היא למקד את גורמי אנדותל הצמיחה (VEGF) באמצעות מעכבי VEGF 3. נכון לעכשיו, אלה מועברים באמצעות זריקות זגוגית חוזרות ונשנות. באופן דומה, בטיפול בבצקת מקולרית, סיבוך שכיח של רטינופתיה סוכרתית, סטרואידים מועברים באמצעות זריקות חוזרות ונשנות

הרעיון של מערכת אספקת הסמים שחרור איטית תואר לראשונה שימוש ברכב גומי סיליקון, כדי לספק מולקולות קטנות לתוך הרקמות של בעלי חיים 5. מאז, שיטות שחרור איטיות אחרות פותחו כדי לספק מולקולות גדולות יותר, כמה מהם נבדקו בעין. ספקי חלקיקים, כגון microspheres מתכלה, poly-lactide-CO-glycolide חלקיקים (PLGA) ושלפוחית ​​פוספוליפידים (יפוזומים) יכולים להיות שימושיים ככלי רכב משלוח 6,7. חלקיקי PLGA ויפוזומים כבר הושוו בסביבה במבחנה ליכולת שלהם לספק סוכנים אנטי סרטניים על פני לובן העין לאורך זמן 7. שני כלי הרכב היו יעילים בשחרור לאט הסמים. עם זאת, המחקר נערך רק בסביבה במבחנה. Bochot et al. (2002) 8 נבדקוהיעילות של יפוזומים להחדיר מולקולות לרשתית in vivo. הם הוכיחו כי ליפוזומים לספק בהצלחה oligonucleotides הקטן ברשתית עין הארנב. המחברים טען כי ליפוזומים יכולים להיות מועילים בטיפול במחל רשתית 8. עם זאת, הטבע של שלפוחית ​​אלה לצוף בזגוגית אומר שסביר להניח שהם לטשטש או לפגוע בראייה 9.

Okabe et al. (2003) 10 להשתמש בדיסקי פולימר מתכלה שאינם מורכבים מ33% אצטט אתילן ויניל ליישם beta-methasone בארנבות. הם מושתלים דיסקים לתוך כיס scleral והפגינו לשחרור היעיל של התרופה לתוך הזגוגית והרשתית לעד חודש 10. עם זאת, בפרוטוקול ספציפי זה, השתל היה גדול יחסית ונוקשה, ונדרש הליך כירורגי מורכב יותר הכוללים חתך scleral גדול ותפירה.

מחקר מוקדם יותר נחקר tissuתגובת דואר לכלי רכב פולימר שונים על ידי השתלה אותם לתוך הקרנית של עיני ארנב, ומצאה כי קופולימרים אצטט אתילן ויניל נשטפו באלכוהול לא לגרום לדלקת או גירוי. מתחמים אלה הוצגו כדי לקיים את המסירה של תרכובות גדולות יותר לרקמות של בעלי חיים לתקופות ממושכות של זמן, כמה עולה עד 100 ימים תלויים בתרופה 11. סוג אחד כזה של שרף קופולימר פותח תעשייתי בצורה של Elvax 40W (40% על ידי תוכן comonomer אצטט משקל אתילן ויניל עם תוסף אמיד 'W' כדי לשפר את הטיפול גלולה). שרף קופולימר זה חומר אינרטי שהוא יציב בשני חדרים וטמפרטורת גוף. זה לא הוכח לגרום לאלרגיות או רעיל ברקמות ביולוגיות. שרף זה למעשה סיפק מגוון גדול של תרופות במודלי ניסויים שונים שיחקרו את הפונקציות של מערכות שונות, כגון מערכת החלב ductal 12, שמיעתי הקליפה העיקרית 13,14 </ Sup>, וצפרדע מערכת ראייה 15. שרף זה שימש גם בעין, כדי לספק תרופות לפיתוח צב 16,17, עובר עוף 18,19, וחמוס מבוגר רשתיות 20. במערכת העצבים המרכזית החולדה, השרף יש רק שימש במוח 21-23, אך השימוש בו בעין של החולדה לא תועד.

היתרונות של שימוש בשרף קופולימר זה כדי לספק תרופות לאט לרשתית על פני שיטות אחרות, הוא שזה הוא תרכובת יציבה שאינו גורם לדלקת או גירוי בעין. בניגוד למנשא חלקיקים, מורכב סמים השרף לא לפגוע בראייה לאחר השתלה, כפי שבדרך כלל נשאר באתר של משלוח במקום צף בזגוגית. זה רק היה דורש תהליך השתלה פשוט לתוך חלל הזגוגית הקרוב לימבוס של העין, ולא דורש תפירה לאחר השתלה. לאחרונה, חלה עלייה במספר מערכות אספקת רומן, כגוןטכנולוגיית תא במארז (ECT) 24,25, הידרוג 26, ומיקרופילמים 27. עם זאת, השיטה ששמשה במחקר הנוכחי להכנה ואספקה ​​מורכבת סמים שרף היא גם קלה לעקוב ולא יקר, ובכך להיות יתרון נוסף לשימוש בסביבת מחקר בסיסית. האתגר של שימוש מורכב זה כדי לספק טיפולים תרופתיים לטווח הארוך הוא לקבוע את הריכוז האופטימלי של התרופה שיהיה למקסם את היתרונות הטיפוליים שיש זריקות זגוגית פחות.

מאמר זה נועד להדגים את השימוש במתחם הסמים השרף לטיפול לטווח ארוך של רשתית החולדה הבוגרת. היעילות של מצב של משלוח זה נבדקה באמצעות 2-אמינו-4-phosphonobutyrate האנלוגי גלוטמט (APB) כתרופה. בלוקים APB תגובת האור של התאים דו קוטביים על ידי חיקוי גלוטמט, מוליך עצבי אנדוגני ב28 הרשתית. כאשר APB מתחרה עם גלוטמט לרצפטור שלו, חוסם את הניהול התאורהתגובה לא. APB נעשה שימוש במחקרים פיסיולוגיים לשליטה בתפקוד רשתית ולמדוד את השפעתו תוך שימוש בשיטות אלקטרו כגון electroretinography (ERG). במחקרים קודמים, APB היה בשימוש כבר הקצר טווח 29 וטיפול לטווח הארוך של הרשתית המתפתחת; האחרון מעורב נותן מנה אחת באמצעות הזרקה תוך עינית יומית ל30 ימים 30. אותה הכמות של APB (0.092 מ"ג בתמיסת מלח סטרילית, בריכוז של 50 מיקרומטר) שימשה לכל הזריקות כפי שהוצעה ב28,29,31 עבודה קודמות. בחרנו APB לבדוק מורכב סמים שרף ככלי בשחרור איטי, כדי לספק תרופות לעין. השיטות שתוארו במחקר זה דומות לשיטות שתוארו קודם לכן היו מעורבות בהכנה של תרופות השרף המורכב 16,32; עם זאת אנו גם פירוט את השימוש בו באופן ספציפי בעין של החולדה הבוגרת. לאחר השתלה כירורגית של השרף הטעון APB לתוך העין, ERG בוצע כדי לקבוע אם APB מבטל את rתגובת אור etinal, ולכן אם APB כבר פורסם בהצלחה לתוך הזגוגית ורשתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שנערכו היו בהתאם להצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר, ובאישור של אוניברסיטת ועדת בעלי החיים Aquila L'אתיקה והוועדה הניסויים בבעלי החיים באוניברסיטה הלאומית של אוסטרליה האתיקה. חולדות מבוגרות (P100-200) שמשו במהלך מחקר זה.

.1 מכינים את פלטות שרף קופולימר

  1. הנח 20 כדורי Elvax 40W לתוך כוס זכוכית קטנה בארון קטר.
  2. מלא את הכוס עם 100% אתנול להבטיח לכסות את כל כדורים.
  3. כסה את הכוס עם Parafilm, ולספוג את כדורים ב100% אתנול בטמפרטורת חדר למשך 7-10 ימים. הערה: משלב זה ואילך, לא משתמש במתכת או פלסטיק כדי לטפל או לאחסן את השרף.

2 הכן את פתרון הסמים לטעינה

  1. ממיסים את תרופת בחירה ב0.1% sulfoxide דימתיל (DMSO). הפוך את פתרון הסמים עד 40 μl בנפח.טען את השרף עם שלוש פעמים את הריכוז של התרופה שתינתן במנה אחת.

.3 להכין וטען את קומפלקס סמים שרף

  1. העבר את 20 כדורים שטפו למשנהו כוס זכוכית קטנה. ממיסים את כדורים בdichloromethane 4 מ"ל ל45 כ דקות. כסה את הכוס עם Parafilm בעוד כדורים הולכים ומתפוגגים.
  2. הכן פתרון של גרין המהיר FCF על ידי המסתו בDMSO 0.1% לריכוז של 0.001 מ"ג / מ"ל.
  3. קח פיפטה אחד, ולהכין 40 μl של פתרון התרופה שהוכן קודם לכן. לטעון פיפטה אחרת עם 40 μl של פתרון ירוק מהיר.
  4. הוספת שני הפתרונות בו זמנית לתוך הכוס. מיקס במהירות באמצעות זכוכית ערבוב מוט עד הצבע הירוק מפוזר באופן אחיד לאורך כל התערובת.
  5. מייד להעביר את הכוס על קרח יבש ל10 דקות לצום להקפיא את השרף.
  6. הגדרה "תא אידוי" להתאדות הממס. מלאמיכל עד גדול יותר לשליש עם חלוקי נחל סידן גופרתי. צור גם בחלוקי הנחל, ולמקם בזהירות את הכוס בכל כך טוב שהחלוקים להגיע עד למחצית הכוס, כדי לייצב את הכוס בחדר.
  7. כסה את המכל מחוץ גדול יותר עם Parafilm.
  8. העבר את תא האידוי למקפיא. שמור ב-20 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שבועות.

.4 הכן את קומפלקס סמים שרף להשרשת כירורגי

  1. הסר את תא האידוי מהמקפיא. מעבירים את גוש סמים שרף המוצק לצלחת זכוכית כל הזמן על קרח.
  2. בעזרת מיקרוסקופ או זכוכית מגדלת, לחתוך חתיכה כ 0.05 מ"מ קוטר ו0.1 מ"מ אורך מהגוש באמצעות כלי מקדחה או אגרוף.
  3. לעטוף את שארית הבלוק בחומר הקפאת הוכחה (למשל, נייר אלומיניום) ולשמור ב-20 ° C עד נדרש.

.5 כירורגי של השתל מורכב סמים שרף לתוך העיניים של העכברוש

  • הכן את החיה לניתוח. הרדימי באמצעות זריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) ו xylazine (מ"ג 12 / קילוגרם משקל גוף). שים לב לבעלי החיים עד שהרדמה מלאה מושגת. הערה: בעלי החיים צריכים להיות אובדן של תנועות (פרט לנשימה), ואובדן הרפלקסים קמצוץ של קרנית ואת הבוהן.
  • מעבירים את החיה בהרדמה המלאה לשולחן הניתוחים. mydriaticum השימוש (לדוגמא, סולפט אטרופין), והרדמה מקומית (לדוגמא, hydrochloride tetracaine) יורדים על העין (ים) שעברה ניתוח. החל דמעות מלאכותיות כדי לשמור על הקרנית לחה במהלך ניתוח. משתמש במחטים חד פעמיות וכלים סטריליים לאורך כל הניתוח.
  • לייצב את העין בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים בוטים אחרי שהתלמיד הוא פתיחה מלאה. השתמש במיקרוסקופ כדי להפוך את פצע עומק מלא כדי להגיע לכ -2 מ"מ זגוגי, מימבוס באמצעות מחט 25 G.
  • הכנס את פיסת t מוכנההוא מורכב סמים שרף לתוך הפצע בעזרת זוג מלקחיים בסדר, מחודדים (לדוגמא, פינצטה) כי הם מסוגלים לחדור לאתר לנקב.
  • כטיפול מונע לזיהום חיידקים, חל משחה אנטיביוטית לעין, כדי למנוע דלקת, כמו גם מניעת יובש בקרנית בעוד החיה מתאוששת.
  • שים לב לבעלי החיים עד להחלמה מלאה. אל תשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה. אל תחזרו בעלי החיים לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאוששו באופן מלא. אם בעל החיים מראה סימנים של מתח או אי נוחות, יש להשתמש במשככי כאבים על פי הפרוטוקול שאושר על האתיקה.
  • בצע את הליכי ניסוי הרגילים לאיסוף וניתוח של הרקמה.
  • בסיום ניסויים, להרדימו עם זריקת intraperitoneal של pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) 2% פתרון hydrochloride לידוקאין.
  • הערה: Lignocaine הידרוכלוריד דקותimizes אי נוחות מקומית.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    electroretinography שדה מלא (ERG) שימש כדי לזהות את ההשפעה של APB על הרשתית. לפרטים כיצד ERG בוצע, מתייחס ללימודי 33,34 הבאים. בקיצור, אחרי הרדמת בעלי החיים, אלקטרודה זהב הונחה על הקרנית של העין, ואת האלקטרודה ההתייחסות הוצבה בקרקפת הקדמית בין העיניים, כדי להקליט את הפעילות החשמלית של הרשתית. גירויים היו שנוצרו באמצעות יחידת פלאש אלקטרונית והעוצמה נעה בין 10-10 יוני photoisomerization, המייצג את מספר המולקולות רגישות לאור הופעלו למוט. בניסויים אלה, הקלטות ERG נלקחו בהודעת הליך 1 ו -7 ימים. עין ימין של כל חיה הייתה מושתלת עם מורכב סמים שרף, ואילו הבחור עזב את העין שימשה כביקורת לא טופלה פנימית.

    איור 1 מציג את השינויים במשרעת של b-הגל עם עלייה בphotoisomerization למוט(Φ). בעיני השליטה, המשרעת של b-הגל גדלה ככל שגדלה עוצמת הפלאש. באיור 1 א, מקבלות הקלטות תגובת רשתית יום 1 לאחר השתלה. עין המושתלת הראתה דפוס משרעת דומה לעין השליטה. ההבדל משרעת בין שתי העיניים הפך שונה באופן משמעותי ב10 6 φ (p <0.0001). זה מצביע על כך בשלב מוקדם זה, מורכב סמים שרף אין השפעה על תגובת רשתית עד שמגיע בעוצמות גבוהות יותר פלאש. איור 1 מדגים את השינויים בתגובת ERG ב7 ימים לאחר השתלה. ב-הגל הוא בוטל בכל הרמות של הבזק אינטנסיביות בעין המושתל, בהשוואה לעין השליטה, שבו יש אמפליטודות דומה להקלטות היום 1. זה שונה באופן משמעותי לכל אמפליטודות לעין המושתלת ביום 1 (p <0.0001). זה מראה שתגובת הרשתית בוטלה על ידי (בשבוע אחד) לאחר implantatiעל של מתחם סמים שרף לתוך העין.

    איור 1
    איור 1 המשרעת של b-הגל ביום 1 ובשבוע 1 לאחר ההשתלה המורכבת סמים שרף. לשני הלוחות, עין השליטה מוצגת בכתום (ריבועים), ואילו בעין המושתלת מוצגת בירוק ( עיגולים). הסמל * מייצג משמעות בשלב זה בין שתי העיניים, שבי p <0.0001. לכל הקבוצות, n = 5 (א) המשרעת של היום ב-גל 1 לאחר ההשתלה המורכבת סמים שרף לתוך העין. המשרעת של b-הגל ביחס לעוצמת הפלאש (photoisomerization לφ מוט) היא אינדיקטור של תגובת רשתית. אין הבדל משמעותי במשרעת ב-הגל בין העיניים בכל עוצמות הבזק אלא ב10 6 φ, בו העין המושתלתיש משרעת נמוך יותר. (ב) משרעת של השבוע ב-גל 1 (7 ימים) לאחר השתלה. אמפליטודות שנרשמו משני העיניים שונות באופן משמעותי בכל עוצמות הבזק. ברשתית המושתל, המשרעת של b-גל לא הייתה מדידה בכל עוצמות גירוי.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    מאמר זה מדגים את השימוש בתרופה מורכב שרף עבור משלוח השחרור האיטי של תרופות לרשתית. אנחנו אמורים להציג את שיטה שבה היא זול יחסית וקל ליישום במודל של בעלי חיים קטנים.

    בהתחשב בכך שהפונקציה של APB היא לפעול כאנלוגי גלוטמט, זה יחסום את תגובת הרשתית בעין. התוצאות מראות כי APB גרם לחסימה של תגובת הרשתית על ידי postimplantation שבוע אחד. זה מצביע על כך APB שוחרר בהצלחה לתוך הזגוגית והרשתית, ושהשפעתה הייתה מוגבלת לעין שמורכבת סמים השרף היה מושתל לתוך. ההשפעה המלאה של התרופה הפכה בשבוע אחד ברור לאחר ההשתלה (איור 1). איור 1A מראה כי ביום 1 לאחר השתלה, הפחתה משמעותית של b-הגל הייתה רק נוכחים בעוצמת φ 10 6 בעין המושתלת. זה עשוי להצביע על כך בתחילת נקודת זמן זו, רקמסלול חרוט, המגיב   לעוצמות אור גבוהות יותר, הושפע. כדי לקבוע את משך הזמן שהשרף יכול לספק את APB לרשתית, יש לחקור נקודות זמן נוספות. מוצע כי הקלטות בנקודות זמן נוספות בפרק זמן 0-7 היום צריכים לקחת, למשל, בשעה 3 ו -5 ימים לאחר השתלה, כדי לקבוע בדיוק מתי תגובת הרשתית הוא בוטל באופן מלא. בנוסף, יש לקחת בהקלטות מעבר 7 ימים, כדי לקבוע כמה זמן APB הוא שוחרר ל. זה יהיה ברור כתגובת הרשתית תמשיך תבוטל אם APB הוא הרף ששוחרר לאט לתוך הזגוגית.

    במחקר זה, מורכב סמים השרף היה נמצא בטוח למסירה לרשתית. APB פורקה ב 0.1% DMSO. בריכוזים שווים או גבוה מ0.6%, DMSO יכול לגרום לרעילות ברשתית. עם זאת, 0.1% DMSO כבר נמצא בטוח לכלי רכב עבור המשלוח של תרכובות לעין חולדה 35, וריכוז זה הייתה בשימוש לאורך כל הניסויים במחקר זה. השתלים הוכנסו transclerally לתוך חלל הזגוגית בserrata האורה. השתלים נצפו להישאר בserrata האורה בcryosections של העין העכברוש, שנאספה לאחר הקלטות ERG נעשו. מיצוב זה של השתל מבטיח שמורכב סמים השרף אינו גורם לליקוי ראייה. שיטה זו כרוכה במתחם הסמים השרף נבדקה עם תרכובות אחרות (פרסום בהכנה), ונמצא כי אין נזק מבני או תפקודי לעין נצפה עד חודשים לאחר השתלה. כולל של 60 בעלי חיים הושתלו, וב90% מהמקרים עמדת השתל נותרת ללא שינוי.

    כמה שינויים יכולים להתבצע לטכניקה במידת צורך. בניסויים אלה, שלוש פעמים את הריכוז של מנה בודדת של APB הועמס לתוך השרף (50 מיקרומטר x 3 = 150 מיקרומטר), וsho זהULD לשמש כקו מנחה להכנת הפתרון התרופתי לטעינה. עם זאת, הריכוז היעיל של התרופה בשרף הוא משתנה, ויש לבדוק ולשנות בהתאם. נקודות הזמן שבו ניתוח מתבצע יכול גם להיות שונה, כדי לקבוע כמה זמן השרף הוא יעיל בשחרור התרופה. בניסויים אלו, שהראה כי המינון האפקטיבי היציב של התרופה מועבר באמצעות מורכב סמים שרף עבור שבוע אחד לפחות, ולכן מומלץ שהניתוח של הרקמה מתבצע לפחות שבוע לאחר ההשתלה. במהלך שלב טעינת סמים, ירוק מהיר שימש כדי להבטיח שהתערובת הייתה הומוגני. צבעי צבע ביולוגי בטוחים אחרים יכולים לשמש כחלופה לגרין מהיר, כדי להמחיש את האחידות של התרופה בתוך השרף. מגבלה של שיטה זו היא שהצבע הירוק המהיר הוא המדד היחיד לערבוב אחיד. טכניקה זו יכולה להיות גם נבדקה באמצעות מודלים של בעלי חיים אלטרנטיביים ובתרופות, רק עם מודעת קטיןjustments לשיטה. אם סכום גבוה יותר של התרופה צריך להיות מועבר, שתל בגודל גדול יותר עשוי להיות נחוץ. אם יצליח במודלים אלה, שרף קופולימר זה יכול להיחשב כאופציה טיפולית לאספקת תרופות באיטיות לרשתית להיות השפעה מתמשכת לאורך זמן.

    ישנם מספר צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול שבו טיפול נוסף יש לנקוט. אין להשתמש במכשירי פלסטיק ומתכת בכל רחבי הסינתזה והטיפול בשרף. זה מונע זיהום של הפולימר, כdichloromethane יכולה להמס פלסטיק ומתכת לשיתוק. יובש נכון של בלוק סמים שרף צריך להיות מושגים לפני השימוש בו להשתלה כירורגית. ודא שהמבחנה המכילה את התרופה ושרף נחשפה במלואו לסידן גופרתי כדי להתאדות הממס. לחלופין, lyophilizer יכול לשמש כדי להקפיא לייבש את הסמים השרף. בלוק הסמים השרף מוכן לשימוש כאשר הממס התאדה לחלוטין, ורק בלוק כחלחל מוצק נשאר בכוס. בעת חיתוך חתיכה מהגוש להשתלה, כל חתיכה צריכה רק להיות מוכנה מייד לפני הניתוח כחתיכות קטנות מאוד וקשים לחנות. יש להשתמש בכלי מקדחה או אגרוף לחתוך חתיכות בגודל שווה, כדי להבטיח כי כל פיסה מכילה בערך אותה הכמות של התרופה. לבסוף, בעת הכנסת החתיכה לתוך הפצע שנעשה על ידי מחט 25 G, להשתמש בפינצטה בסדר, מחודדת כדי להדריך בזהירות החתיכה לתוך הפצע. מיקרוסקופ או זכוכית מגדלת הספק גבוהה צריך לשמש כאמצעי עזר חזותי.

    רק תרופות ותרכובות הידרופילי נבדקו בשיטה זו. מתחמי סמים השרף לא הראו שום היווצרות משקעים או תוצר לוואי בלתי רצויה, כאשר התרופה הייתה מעורבבת עם הפולימר וdichloromethane. הוא הציע כי עם כל תרופה חדשה, הריכוז, זמן מחצית חיים של השפעה, וכל תגובות אפשריות עם תערובת השרף צריךלהיבדק על ידי המשתמש כדי לקבוע אם השיטה מתאימה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים אין לגילוי.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Elvax 40W Pellets Du Pont, DE, USA
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA A1910
    Dichloromethane Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 34856
    Fast Green FCF Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    Drierite, calcium sulfate Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 238910
    Ketamine, Ilium Ketamil Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Xylazine, Ilium Xylazil-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Atropine sulphate, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Chloramphenicol, Chlorsig ointment Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
    Pentobarbital, Lethabarb Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
    Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Uni-Core Punch Tool World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Curved Forceps World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 Zeiss, West Germany
    25 G Insulin needle Terumo Corp., Tokyo, Japan
    Dumont tweezers World Precision Instruments Inc., FL, USA

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Access Economics, The global economic cost of visual impairment. AMD Alliance International. 26-27 (2010).
    2. Jager, R., Aiello, L., Patel, S., Cunningham, E. Risks of intravitreous injection: A comprehensive review. Retina. 24, (5), 676-698 (2004).
    3. Rosenfeld, P. J., et al. Ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 355, (14), 1419-1431 (2006).
    4. Cunningham, M. A., Edelman, J. L., Kaushal, S. Intravitreal steroids for macular edema: The past, the present, and the future. Survey of Ophthalmology. 53, (2), 139-149 (2008).
    5. Folkman, J., Long, D. M. The use of silicone rubber as a carrier for prolonged drug therapy. Journal of Surgical Research. 4, (3), 139-142 (1964).
    6. Herrero-Vanrell, R., Refojo, M. F. Biodegradable microspheres for vitreoretinal drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 52, (1), 5-16 (2001).
    7. Kim, E., et al. Human scleral diffusion of anticancer drugs from solution and nanoparticle formulation. Pharmaceutical Research. 26, (5), 1155-1161 (2009).
    8. Bochot, A., et al. Intravitreal delivery of oligonucleotides by sterically stabilized liposomes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (1), 253-259 (2002).
    9. Bochot, A., Fattal, E. Liposomes for intravitreal drug delivery: A state of the art. Journal of Controlled Release. 161, (2), 628-634 (2012).
    10. Okabe, K., Kimura, H., Okabe, J., Kato, A., Kunou, N., Ogura, Y. Intraocular tissue distribution of betamethasone after intrascleral administration using a non-biodegradable sustained drug delivery device. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (6), 2702-2707 (2003).
    11. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263, (5580), 797-800 (1976).
    12. Silberstein, G. B., Daniel, C. W. Elvax 40P implants: Sustained, local release of bioactive molecules influencing mammary ductal development. Developmental Biology. 93, (1), 272-278 (1982).
    13. Smith, A. L., et al. An investigation of the role of auditory cortex in sound localization using muscimol-releasing Elvax. European Journal of Neuroscience. 19, (11), 3059-3072 (2004).
    14. Anomal, R., De Villers-Sidani, E., Merzenich, M. M., Panizzutti, R. Manipulation of BDNF signaling modifies the experience-dependent plasticity induced by pure tone exposure during the critical period in the primary auditory cortex. PloS one. 8, (5), e64208 (2013).
    15. Tu, S., Butt, C. M., Pauly, J. R., Debski, E. A. Activity-dependent regulation of substance P expression and topographic map maintenance by a cholinergic pathway. The Journal of Neuroscience. 20, (14), 5346-5357 (2000).
    16. Sernagor, E., Grzywacz, N. M. Influence of spontaneous activity and visual experience on developing retinal receptive fields. Current Biology. 6, (11), 1503-1508 (1996).
    17. Leitch, E., Coaker, J., Young, C., Mehta, V., Sernagor, E. GABA type-A activity controls its own developmental polarity switch in the maturing retina. The Journal of Neuroscience. 25, (19), 4801-4805 (2005).
    18. Park, C. M., Hollenberg, M. J. Basic fibroblast growth factor induces retinal regeneration in vivo. Developmental Biology. 134, (1), 201-205 (1989).
    19. Whitsel, A. I., Johnson, C. B., Forehand, C. J. An in ovo chicken model to study the systemic and localized teratogenic effects of valproic acid. Teratology. 66, (4), 153-163 (2002).
    20. Prusky, G. T., Ramoa, A. S. Novel method of chronically blocking retinal activity. Journal of Neuroscience Methods. 87, (1), 105-110 (1999).
    21. Colonnese, M. T., Constantine-Paton, M. Chronic NMDA receptor blockade from birth increases the sprouting capacity of ipsilateral retinocollicular axons without disrupting their early segregation. The Journal of Neuroscience. 21, (5), 1557-1568 (2001).
    22. Oliveira-Silva, P., et al. Matrix metalloproteinase-9 is involved in the development and plasticity of retinotectal projections in rats. Neuroimmunomodulation. 14, (3-4), 144-149 (2007).
    23. Trindade, P., et al. Evidence for a role of calcineurin in the development of retinocollicular fine topography. Neuroscience Letters. 487, (1), 47-52 (2011).
    24. Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (12), 7484-7491 (2012).
    25. Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156, (2), 283-292 (2013).
    26. Rauck, B. M., et al. Biocompatible reverse thermal gel sustains the release of intravitreal bevacizumab in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (1), 469-476 (2014).
    27. Liu, Y. C., Peng, Y., Lwin, N. C., Venkatraman, S. S., Wong, T. T., Mehta, J. S. A biodegradable, sustained-released, prednisolone acetate microfilm drug delivery system effectively prolongs corneal allograft survival in the rat keratoplasty model. PloS one. 8, (8), e70419 (2013).
    28. Slaughter, M. M., Miller, R. F. 2-amino-4-phosphonobutyric acid: a new pharmacological tool for retina research. Science. 211, (4478), 182-185 (1981).
    29. Bodnarenko, S., Jeyarasasingam, G., Chalupa, L. Development and regulation of dendritic stratification in retinal ganglion cells by glutamate-mediated afferent activity. The Journal of Neuroscience. 15, (11), 7037-7045 (1995).
    30. Deplano, S., Gargini, C., Maccarone, R., Chalupa, L. M., Bisti, S. Long-term treatment of the developing retina with the metabotropic glutamate agonist APB induces long-term changes in the stratification of retinal ganglion cell dendrites. Dev Neurosci. 26, (5-6), 396-405 (2004).
    31. Horton, J., Sherk, H. Receptive field properties in the cat's lateral geniculate nucleus in the absence of on-center retinal input. The Journal of Neuroscience. 4, (2), 374-380 (1984).
    32. Smith, A. L., Cordery, P. M., Thompson, I. D. Manufacture and release characteristics of Elvax polymers containing glutamate receptor antagonists. Journal of Neuroscience Methods. 60, (1), 211-217 (1995).
    33. Gargini, C., Bisti, S., Demontis, G. C., Valter, K., Stone, J., Cervetto, L. Electroretinogram changes associated with retinal upregulation of trophic factors: observations following optic nerve section. Neuroscience. 126, (3), 775-783 (2004).
    34. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
    35. Tsai, T., Bui, B., Vingrys, A. Dimethyl sulphoxide dose-response on rat retinal function. Documenta Ophthalmologica. 119, (3), 199-207 (2009).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics