Meting van Heme Synthesis Levels in zoogdiercellen

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Heme dient als prosthetische groep voor een grote verscheidenheid aan eiwitten bekend als heemeiwitten, zoals hemoglobine, myoglobine en cytochromen. Het is betrokken bij verschillende moleculaire en cellulaire processen zoals gentranscriptie, translatie, celdifferentiatie en celproliferatie. De biosynthese van heem niveaus uiteenlopen weefsels en celtypes en wordt gewijzigd ziektetoestanden zoals bloedarmoede, neuropathie en kanker. Deze techniek maakt gebruik van [4- 14 C] 5-aminolevulinezuur ([14 C] 5-ALA), één van de vroege voorlopers in het heem biosyntheseweg het niveau van synthese van heem in zoogdiercellen te meten. Deze bepaling omvat incubatie van cellen met [14 C] 5-ALA, gevolgd door extractie van heem en meting van de radioactiviteit opgenomen in heem. Deze procedure is accuraat en snel. Deze werkwijze meet de relatieve niveaus van heem biosynthese plaats van het totale gehalte heem. Om het gebruik van deze techn tonenique de biosynthese van heem niveaus werden gemeten in verschillende zoogdiercellijnen.

Introduction

Heem, een complex van ferro-ijzer en protoporfyrine IX een bepaalde molecule voor transport en gebruik van zuurstof in vrijwel alle levende organismen 1-3. De unieke structuur van heem in staat stelt om te functioneren als drager van tweeatomige gassen en elektronen, alsook verschillende andere functies uitvoeren 1-5. Bijvoorbeeld bindt heem zuurstof van hemoglobine en myoglobine voor de overdracht en opslag van zuurstof 6,7. Het werkt ook als een elektron drager in de cytochromen uitgeademde fungeert als elektrondonor voor redox reacties gekatalyseerd door cytochroom P450-enzymen 8,9. Een van de belangrijkste kenmerken van heem is dat het regulerende rol kunnen spelen bij de cellulaire en moleculaire processen zoals gentranscriptie, eiwitsynthese en micro-RNA biogenese 4. Zo beïnvloedt de transcriptie van veel genen door regeling van de activiteit van zoogdier transcriptionele repressor Bach1 en het zoogdier nucleaire receptor Rev-erbα 10-15. Heme regelt de activering van haem activator-eiwit (Hap) 1 die een belangrijke rol bij de activatie van genen die betrokken zijn bij de ademhaling en controle oxidatieve beschadiging speelt, in reactie op heem of zuurstof 16. Heem regelt ook gentranscriptie in neuronale cellen via zenuwgroeifactor (NGF) signalering 3,17-20. Daarnaast regelt eiwitsynthese in zoogdiercellen erythroïde cellen door het moduleren van de activiteit van haem-gereguleerde kinase eIF2α (HRI) 21-24. Voorts heem beïnvloedt de activiteit van belangrijke signalering eiwitten zoals tyrosine kinase Jak2 en Src, die essentieel voor een goede celfunctie en celgroei 4,20,25 zijn. Gevonden werd dat bij HeLa-cellen heem remming veroorzaakt celcyclus en activering van markers geassocieerd met senescentie en apoptose 26. Beide Heem deficiëntie of verhoogde niveaus van heem in verband worden gebracht met ernstige gevolgen voor de gezondheid bij de mens 27. Recente moleculaire eennd epidemiologische studies een positieve associatie hoge heem inname en verhoogde kans op ziekten, zoals type-2 diabetes, coronaire hartziekten en verschillende kankers waaronder longkanker, colorectale kanker en pancreaskanker 27,28. Met behulp van een matched pair van lab normale en kanker longcellen auteurs hebben geconstateerd dat de kankercellen niveaus van zuurstofverbruik, heem synthese en eiwitten die betrokken zijn bij de opname van heem en zuurstofverbruik 28 zijn toegenomen. Interessant remming van synthese van heem verminderde zuurstofconsumptie, proliferatie, migratie en kolonievorming van kankercellen 28. Aldus, de fluctuatie in de niveaus van endogene heem speelt een belangrijke rol bij de regulatie van moleculaire en cellulaire processen 3,4,28,29.

In zoogdieren, de biosynthese van heem plaatsvindt in acht stappen, waarbij enzymen in de mitochondria en cytosol 4 (figuur 1). Heme Biosynthesis begint in de matrix van de mitochondriën met de condensatie van glycine en succinyl-CoA om 5-aminolevulinezuur (5-ALA) te vormen, gekatalyseerd door ALA-synthase (ALAS) 4,31. Dit is de snelheid stap in heem biosynthese in nonerythroid cellen te beperken. 5-ALA wordt vervolgens uitgevoerd naar het cytosol waar de volgende vier stappen uitgevoerd om coproporphyrinogen III (CPgenIII), die vervolgens naar de mitochondriën, waar het wordt omgezet in protoporfyrine IX (PPIX) wordt ingevoerd vormen. Tot slot wordt een molecuul ijzer opgenomen om de protoporfyrine IX (PPIX) naar heem, een reactie gekatalyseerd door ferrochelatase (Fech) 2,4 produceren.

Het niveau van heem biosynthese vooral afhankelijk van de mate van ALAS enzym die strak wordt gecontroleerd door intracellulair heem ijzer en 4. De biosynthese van heem kan worden beïnvloed door genetische afwijkingen, beschikbaarheid van bepaalde mineralen en vitaminen (bijvoorbeeld riboflavine, zink), blootstelling aan toxinen (bijvoorbeeld aluminium, lood), Anoxie, koorts en waarden van bepaalde steroïden (bijvoorbeeld oestrogeen) 32-35. Het niveau van synthese van heem wordt veranderd in diverse ziektetoestanden. Verminderde heem biosynthese kan bloedarmoede evenals neurologische aandoeningen 3,36 veroorzaken. Anderzijds verhoogde biosynthese van heem speelt een belangrijke rol bij de progressie van bepaalde kankers 28,37. Heem is getoond essentieel voor de groei, differentiatie en overleving van zoogdieren vet-, erythroïde en neuronale cellen 4,38-41 zijn. Bijvoorbeeld, heem-deficiëntie leidt tot neurieten schade primaire muis corticale neuronen via de remming van glutamaat NMDA (N-methyl-D-aspartaat) receptor 17. Bovendien remming van synthese van heem veroorzaakt geprogrammeerde celdood in humane epitheliale cervixcarcinoom HeLa-cellen 26,41. Derhalve meet het heem biosynthese niveaus in verschillende cellen onder verschillende condities is van belang voor het bestuderen etiologie en Progressieen van vele ziekten.

Hier beschrijven we een snelle en gevoelige methode om het niveau van intracellulair heem-synthese gemeten door [4- 14 C] 5-aminolevulic acid. Dit is een alternatieve methode om andere methoden waarbij 55 Fe of 59 Fe. We liever met behulp van 14 C, omdat de straling is zeer zwak. Daarentegen is een krachtige bescherming vereist voor het werken met Fe isotopen. Bovendien is deze werkwijze bedoeld voor het meten en vergelijken heemsynthese in verschillende cellen in parallel op een snelle wijze. Om absolute heme te meten, kan men de eerder vastgestelde werkwijze die het gebruik van HPLC 42,43 gebruiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Tijdens het werken met radioactiviteit, passende voorzorgsmaatregelen om besmetting van de experimentator en de omgeving te voorkomen. Gooi off al het afval volgens de plaatselijke veiligheidsrichtlijnen straling.

1. Bereiding van Cellen

  1. Zaadcellen in 3,5 cm platen zodat de confluentie bereikt 80% -90% op de dag van de assay.
    1. Merk op dat zaaien confluentie van cellen afhankelijk van het celtype en de groeisnelheid. Bij de behandeling van cellen met een reagens voor een bepaald aantal dagen, zaad cellen, zodat de confluentie is 80% -90% op de dag van heem meting. Als het aantal cellen verkregen van 3,5 cm platen gering is, moet 6 cm platen met dezelfde hoeveelheid radioactief ALA zoals in de volgende stap.
      Opmerking: Het gebruik van afzonderlijke platen wordt aanbevolen omdat het gemakkelijker is om afzonderlijke platen verwerken.
  2. Een dag voor heme meting, voeg 0,1-0,3 uCi [14 C] 5-ALA ALA koud tot een uiteindelijke c bereiktoncentration van 20 urn van de totale ALA om elke cultuur schotel in een werkgebied geschikt voor het werken met radioactieve stoffen en zet de borden terug in de incubator. Idealiter geïncubeerd met radioactief ALA 16 uur.
    Opmerking: Radioactief gemerkte 5-ALA noodzakelijk kan variëren tussen cellijnen. Een radioactieve telling per minuut (cpm) van ten minste 100 is vereist om de foutenbronnen bij het tellen minimaliseren. Het is raadzaam om een minimale hoeveelheid [14C] 5-ALA vereist zijn voor de bestudeerde cellijnen te bepalen. Voor de meeste experimenten 0,1-0,3 uCi is voldoende om een ​​goede meting te krijgen. Toevoeging van koude ALA is optioneel.

2. Heme Extraction

  1. Plaats de celkweek gerechten op ijs en breng ze naar het gebied geschikt voor radioactiviteit werk.
    1. Voer de gehele extractie en verdamping in een explosieveilige hood. Omdat de opgeslagen ether kan exploderen, gebruik maken van de ether in kleine flesjes en verdampen alle resterende vloeistoffen, niet bewaren ether ineen open fles voor meer dan een maand. Gebruik geen aceton in de buurt van open vuur en kachels als het is zeer brandbaar. WINKEL aceton dat reagentia in glazen flessen lost weefselkweek kunststof.
  2. Zuig uit het medium met behulp van een pipet. Was de cellen eenmaal met 1 ml van koude 1x PBS. Aspireren off PBS.
  3. Voeg 1 ml koude 1 x PBS om de platen en het verzamelen van de cellen op de bodem van de plaat met een rubberen spatel. Breng de verzamelde cellen van elke plaat een gelabeld voorgekoelde 2 ml buis. Verzamel alle cellen in 2 ml buizen.
    Opmerking: Gebruik een verse rubber politieman voor elke plaat te schrapen cellen van elke plaat. Voor elke plaat zou je vier 2 ml buizen, een 1,5 ml buis en een scintillatieflesje nodig.
  4. Spin bij 15.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
  5. Neem PBS met behulp van een pipet, geef een korte draai en verwijder de resterende PBS. Resuspendeer cellen in 100 pi 1X PBS. Vortex om de cellen te resuspenderen en te houden op het ijs.
  6. Neem 10 &# 956; l van stap 5 overgebracht in een 1,5 ml microcentrifugebuis en bewaar op ijs eiwitconcentratie te meten.
    Opmerking: Cell lysis buffer worden aan de cellen toegevoegd en op ijs gehouden eiwitconcentratie later gemeten.
  7. Draai de resterende 90 gl van stap 5 bij 5000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C; verwijder PBS volledig met behulp van een 200 ul pipet tip.
  8. Voeg 300 ul van heem extractiebuffer (zie Materials List) aan elke buis. Dan vortex gedurende 15 seconden te mengen en op ijs gezet gedurende 1 minuut, herhaal dit 3 keer.
    1. Voeg heem extractiebuffer (HEB) en vortex de buis snel om de pellet opnieuw in suspensie, doet slechts een of twee buizen tegelijk omdat de pellet snel worden geresuspendeerd zonder meer in de HEB te lang. Zodra HEB wordt toegevoegd aan alle buizen en pellet wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd volgen 15 seconden vortex en 1 min op ijs cyclus in stap 8. Merk op dat pellet volledig intrekken door de HEB wanneer de pellet achterblijft in de HEB buffer voor een langertijd en niet snel gesuspendeerd.
  9. Voeg 1,2 ml diethylether aan elke buis en vortex gedurende 30 seconden. Spin bij 15.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    Opmerking: Diëthylether loopt snel uit pipet tips. Hieraan pipet diethylether en neer eenmaal of tweemaal besturen, daarbij helpt houd de diethylether in de pipet. Herhaal dit elke keer een frisse pipet tip wordt gebruikt.
  10. Transfer top (ether) fase met 1 ml pipet om een ​​nieuw microcentrifugebuis. Voeg 0,5 ml van 2 N HCl, vortex te mengen en draaien als in stap 9.
    Opmerking: Het is moeilijk om de afstand tussen ether en HCl fase zien. Daarom voeg kleine hoeveelheden trypan blauw in 2 N HCl-oplossing te gebruiken gedurende het experiment, voldoende om het een lichtblauwe kleur. Dit zal helpen onderscheiden van de twee fasen. De onderste fase zal blauw zijn en de bovenste ether fase kleurloos zijn. Breng de bovenste kleurloze ether fase naar een nieuwe buis en de onderste HCl (blauw) fase weggooien.
  11. Herhaal stap 10 tweekeer om de etherfase wassen met 2 N HCl. Breng alleen de bovenste etherfase naar een nieuwe buis tijdens elke herhaling en de onderste fase HCl ontdoen.
  12. Na de derde wassing met HCl, breng de bovenste fase 1 ml pipet naar een scintillatieflesje. De monsters worden door het verdampen van de diethylether door het houden van de monsters in de chemische kap O / N.

3. Meting van de radioactiviteit

  1. De volgende dag, voeg 5 ml scintillatievloeistof aan de gedroogde monsters van stap 2.12.
  2. Schud goed te mengen. Meet de radioactiviteit met behulp van een scintillatieteller.

4. Berekeningen

  1. Lyse van de cellen van stap 2,6 behulp gelijke hoeveelheden CelLytic M buffer (zie Materialen List) en centrifugeren bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  2. Breng een hoeveelheid van de bovenstaande vloeistof en meet de eiwitconcentratie met behulp BCA eiwit assay kit.
    De totale hoeveelheid eiwit in mg (TP) = (90 pl * conc. Van proteïne in81, g / ul) / 1000
    Heem synthese level (radioactiviteit / TP) = pmol / mg eiwit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methode werd toegepast om het niveau van synthese van heem vergelijken in normale (HBEC30KT) vs. kanker (HCC4017) longcellen. Figuur 2 toont een hogere synthese van heem in kankercellen (HCC4017) dan normale longcellen (HBEC30KT). Het niveau van synthese van heem werd ook gemeten in normale en kankercellen bij aanwezigheid van mitochondriale ontkoppelaar carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Cellen werden behandeld met 10 uM CCCP voor 24 uur voor het meten van heem synthese levels. Zoals verwacht, de mate van synthese van heem (figuur 2) verminderde bij aanwezigheid van CCCP in zowel normale en kankercellen. Er is eerder aangetoond dat heemsynthese kan worden geremd door succinyl aceton (SA), een krachtige en specifieke remmer van 5-aminolevulinezuur dehydratase (ALAD), het tweede enzym heem biosynthese 41. Met deze werkwijze werden de heemsynthese niveaus gemeten in HeLa-cellen in de aanwezigheid en absheid van 0,5 mM SA. Figuur 3 laat zien dat de niveaus van heem-synthese verminderd met meer dan 10-plooien in aanwezigheid van SA. Om het gebruik van deze techniek verder aan te tonen, werden de niveaus van heemsynthese gemeten en vergeleken in 4 kanker en in HEK293T cellijnen zoals weergegeven in figuur 4.

Figuur 1
Figuur 1. De heem biosyntheseroute bij mensen ALAS, 5-aminolevulinezuur synthase.; 5-ALA, 5-aminolevulinezuur; ALAD, ALA dehydratase; PBG, porfobilinogeen; HMBS, hydroxymethylbilane synthase; HMB, hydroxymethylbilane; UROS, uroporfyrinogeen III synthase; UPgenIII, uroporfyrinogeen III; UROD, uroporfyrinogeendecarboxylase; CPgenIII, coproporphyrinogen III; CPOX, coproporphyrinogen III oxidase; PPgenIX, protoporfyrinogeenoxidase IX; PPOX, protoporfyrinogeenoxidase IX oxidase; PPIX, protoporfyrine IX; Fech, Ferrochelatase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Het niveau van heem biosynthese in normale (HBEC30KT) en kanker (HCC4017) cellijnen in afwezigheid en aanwezigheid van 10 uM mitochondriale ontkoppelaar CCCP. Het achtergrondniveau was vergelijkbaar met het niveau van blancomonster (scintillatievloeistof alleen) en het was minder dan 2% van de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Niveau van heem biosynthese in HeLa-cellen in abslingen en de aanwezigheid van 0,5 mM remmer heem succinyl aceton (SA). De cellen werden behandeld met SA gedurende 3 dagen vóór heem meting. Het achtergrondniveau was vergelijkbaar met het niveau van de blanco monster (scintillatievloeistof alleen) en het was minder dan 2% van de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Vergelijking van de niveaus van heem biosynthese in 4 kanker en HEK293T cellijnen. Assay werd uitgevoerd volgens het protocol. HCC4017 werden gekweekt in ACL4 media, A549 en H1395 in RPMI1640 gesupplementeerd met 5% FBS, HEK293T en HeLa in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS. Voor statistische analyse werden de heemsynthese niveaus in kankercellen en HEK293T cellen in vergelijking met de heemsynthese niveau HCC4017 cellen, door Welch 2-sample t-test. **, P waarde <0,005. Het achtergrondniveau was vergelijkbaar met het niveau van de blanco monster (scintillatievloeistof alleen) en het was minder dan 2% van de controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heme speelt een belangrijke rol bij het ​​genereren van cellulaire energie via ademhaling 26. Veranderde haem metabolisme is bekend dat zij samenhangen met verschillende ziekten waaronder kanker 28,41. Remming van de synthese van heem is bekend celcyclus en apoptose in HeLa cellen 26,41 veroorzaken. Er werd aangetoond dat hoge heemsynthese niveau wordt geassocieerd met de progressie van longkankercellen 28. Daarom zou het van groot belang zijn om de niveaus van heem biosynthese in cellen onder verschillende condities te meten. De werkwijze die hier besproken omvat de totale hoeveelheid heem dus kwantificeren, is het niet over een absolute waarde van heem in de cellen aanwezig. Er zijn diverse colorimetrische werkwijzen en kits voor de totale hoeveelheid haem in de cellen te meten. Bijvoorbeeld kan heem worden geëxtraheerd uit cellen en mitochondria in een mengsel van aceton en HCl en gemengd met 50% (v / v) acetonitril. Waarna het mengsel kan worden toegepasteen 3,9 x 300 mm C18-kolom Bondclone gevolgd door elutie van heem in een gradiënt van acetonitril dat 0,05% (v / v) trifluorazijnzuur en identificeren heme verbindingen bij 400 nm 44,45.

Eerder, de niveaus van heem biosynthese meten zoogdierweefsels en celextracten [14 C] glycine en [14 C] 5- ALA gebruikt 46,47. Alhoewel gemerkte glycine komt het heem biosyntheseroute in de eerste stap maar wordt afgevoerd door andere metabole routes resulteert in de beperkte opname in heem. Glycine is geen specifieke metaboliet van heem biosyntheseweg 48. Anderzijds, gemerkt 5-ALA is specifiek voor heem biosyntheseweg. Deze functie kent een kwantitatieve voordeel van het gebruik van 5-ALA dan glycine 46,48,49. Derhalve gebruik van radioactieve 5-ALA is specifieker en nauwkeurige methode voor het meten en vergelijken van de niveaus van heem biosynthese.

De meest critical stappen om consistente resultaten te krijgen zijn: 1) Zorg ervoor dat de cel confluentie niet hoger gaan dan 100% en niet minder dan 70% in verschillende omstandigheden; 2) de hoeveelheid radioactiviteit toegevoegd per plaat moet identiek zijn omdat deze methode is zeer gevoelig; 3) heem extractie buffer moet niet oud zijn, is het raadzaam om verse elke keer te maken. De hoeveelheid radioactiviteit vereist per plaat is zeer klein en het is moeilijk de identieke bedragen over de monsters te handhaven. Daarom wordt aanbevolen een werkvoorraadoplossing in het kweekmedium te maken bij gebruik van dezelfde medium voor alle monsters, kan anders PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) worden gebruikt. Werkvoorraadoplossing kunnen worden bereid op zodanige wijze dat de hoeveelheid afgegeven per plaat onder 10 pl. Ook, om precies te zijn, het medium van de analysemonsters voor één voorwaarde kan worden uitgevoerd in een 50 ml buis genomen en de geschikte hoeveelheden radioactiviteit kan worden toegevoegd uit de werkvoorraadoplossing vervolgens afzien back equal hoeveelheden van medium aan de platen. Als het aantal cellen beperkt, zoals in primaire kweken, kan 12-well of 24-well platen worden gebruikt om de cellen te kweken en de hoeveelheid radioactiviteit per putje toegevoegd proportioneel verlagen.

Dit protocol is eenvoudig, simpel en levert nauwkeurige metingen van de niveaus van de synthese van heem. Soms kan het moeilijk zijn om de celpellet in het heem extractiebuffer (stap 2,8) volledig resuspenderen. Om te voorkomen dat dit wees er snel bij stap 2.8, voeg heem extractiebuffer tot 1-2 monsters tegelijk, vortex en leg ze op ijs. Zorg ervoor dat de heem extractie buffer is niet te oud. Indien de standaardafwijking onder de identieke monsters te hoog is, let dan op de volgende stappen: 1) PBS werd verwijderd volledig in stap 2,7; 2) voorkomen morsen het monster als in diethylether fase, volgt u de tip in stap 2,9; 3) Zorg ervoor dat de radioactiviteit toegevoegd per plaat en de samenvloeiing van de herhaalde monsters waren hetzelfde.

28 in normale nonmalignant (HBEC) vs. kanker (HCC) cellen, ontwikkeld uit dezelfde patiënt. De beschreven techniek vereist het gebruik van [14 C] 5-ALA, een precursor in heem biosyntheseweg (figuur 1), en meet de radioactiviteit ingebouwd in heem. In deze techniek, porfyrinen, zoals heem, werden geëxtraheerd uit de cellen in een mengsel van aceton, water en geconcentreerde HCl 50,51. Heme werd verder gescheiden van porfyrines door extractie in diethyl ether en wassen van de etherfase met 2 N HCl 50,51. Vervolgens werd de radioactiviteit ingebouwd in heem werd bepaald onder toepassing van een scintillatieteller. De resultaten worden genormaliseerd door de totale hoeveelheid eiwit of celaantal. Heemsynthese in HeLa-cellen werd geremd door succinyl aceton (SA) en een afname van het niveau van de synthese van heem waargenomen zoals previously 26 (figuur 3).

Deze methode is zeer bruikbaar voor het vergelijken van de niveaus van de synthese van heem onder verschillende omstandigheden of tussen cellijnen (Figuur 4). Het vereist een klein aantal cellen en levert specifieke meten en vergelijken van de niveaus van heem synthese in verschillende cellen. Het is niet bedoeld voor de nauwkeurige meting van absolute heem niveaus in de cellen. Dit wordt het best gebruikt om de niveaus van heemsynthese vergelijken in cellen met verschillende eigenschappen, zoals verschillende kankercellen. Omdat kobalt, in plaats van ijzer, is in heem in de laatste stap van heemsynthese opgenomen en geëxtraheerd 51 deze methode niet op correcte vergelijking van heem synthese, indien de groeimedia bevatten verschillende kobalt of andere metaalionen. Toch is de heem syntheseroute van 5-aminolevulinezuur voor porfyrine en heem is zeer specifiek, het meten van de flux niveaus van het gehele pathway waarschijnlijk meer weerspiegelt metabolische activiteiten heem relevant, ongeacht de metaalionen. In tegenstelling, de werkwijze gebruik 59 Fe detecteert alleen het gedeelte van het traject waarin Fe heem 52 te vormen. Hoewel dit meer specifiek, in de aanwezigheid van significante niveaus van metaalionen, kan de gedetecteerde heemsynthese niveaus niet de metabolische vermogen van bepaalde cellen, zoals kankercellen. Bovendien kan Fe worden afgezonderd in andere cellulaire locaties naast mitochondriën om heem te maken. Over het algemeen, zijn wij van mening dat het gebruik van [4- 14 C] 5-ALA is een praktische methode voor het meten van heem niveaus bij het ​​vergelijken van verschillende cellen met verschillende eigenschappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De HCC4017 en HBEC30KT cellijnen werden vriendelijk verschaft door Dr John Minna's lab. Dit werk werd ondersteund door de Cecil H. en Ida Green fondsen om Dr. Li Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)
Acetone
Concentrated HCl
Water
25 ml
1.3 ml
5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Comments

1 Comment

  1. Could you please share where did you get the 14C-ALA?
    thanks a lot

    Reply
    Posted by: abel g.
    February 24, 2018 - 5:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics