Вскрытие и Downstream Анализ Zebra Finch эмбрионов на ранних стадиях развития

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Zebra Finch (Taeniopygia Guttata) становится все более важным модельным организмом во многих областях исследований, включая токсикологии 1, 2, 3, поведения и памяти и обучения 4,5,6. Как единственный певчих птиц с геномом, последовательность, Zebra Finch имеет большой потенциал для использования в исследованиях развития; Однако на ранних этапах развития Zebra Finch не были хорошо изучены. Отсутствие исследований в развитии Zebra Finch можно отнести к сложности рассекает небольшой яйцо и эмбрион. Следующий метод рассечения минимизирует эмбриональных повреждения тканей, что позволяет для исследования морфологии и экспрессии генов на всех этапах эмбрионального развития. Это позволяет как яркий поле и качество флуоресцентных изображений эмбрионов, использовать в молекулярных процедур, таких как в гибридизация (МОГ), пролиферации клеток анализов и экстракции РНК для количественного анализа, таких как количественного Рил-тайм ПЦР (qtRT-ПЦР). Эта техника позволяет исследователям изучать ранние этапы развития, которые ранее были труднодоступными.

Introduction

Общая цель этой техники является получение Zebra Finch (Taeniopygia Guttata) эмбрионы из самых ранних стадиях эмбриогенеза для использования в широком диапазоне исследований развития. Zebra Finch стали преобладающим певчая птица модель организма и широко используются в различных областях, в том числе токсикологии 1,2, поведение 3, памяти и обучения 4,5,6, сравнительный нейроанатомию 7,8 и развития языка 9,10 . Как единственный певчих птиц с геномом, последовательность, Zebra Finch позволяет молекулярной и генетической изучение порядка Passeriformes, которая представляет более 50% известных видов птиц 11, 12,13.

Несмотря на использование взрослых и несовершеннолетних Zebra Finch в разнообразных областях, несколько исследования были проведены на эмбрионах Zebra Finch, особенно на ранних стадиях развития. Это может быть связано с небольшим размером их яиц вй эмбрионы, и их новое положение в качестве модельного организма 14,15,16 для исследований, в которых курица (Gallus Gallus Domesticus) ранее используемых в качестве преобладающей модели системы 17,18,19,20,21. Однако, как не-голосовых учащихся, куры не является подходящим модельной системой для изучения генетической основы вокального обучения, развития вокального обучения, наследственности, поведения, и ганглиев схемы корковой-базальной, участвующих в автомобильных обучения 10.

Важно отметить, что эмбрионы Zebra Finch гораздо более тонкий и более легко повредить, чем куриных эмбрионов во время вскрытия и молекулярной процедур. В частности, большая осторожность требуется при выполнении действия пермеабилизации на эмбрионах зяблик зебры. Сильные моющие средства и ферменты, которые не будут вредить куриного эмбриона может привести к повреждению эмбрионов Финч зебры. С точки зрения общего ухода, необходимо поставить Zebra Finch яйца в маленьких чашках перед размещением в инкубаторечтобы предотвратить их от разрушения при прокатке в процессе инкубации.

Zebra Finch поддаются поведенческих исследований, легко и плодотворно размножаться круглый год в плену, и вокальные учащиеся. Эти характеристики позволяют использовать Zebra Finch, чтобы удовлетворить потребность в качестве модельного организма, которая интегрирует развитие, генетику, и поведенческие аспекты языка. Методы вскрытия подробно изложено ниже, в сочетании с недавно разработанной промежуточной руководства, характерные для Zebra Finch 22, сделать Zebra Finch более полезными стандартизированная модель развития организм. Однако получение эмбрионов на ранних стадиях может быть сложной. Этот протокол позволяет исследователям легко получить эмбрионов ранних стадий. Исследования следственные скорейшей разработке и молекулярную основу с развитием сложных поведения в Zebra Finch, или токсикологических последствий для развития в других малых, воробьиных птиц найдете эта методология рассечение полезно.

Protocol

Заявление по этике: Методы были проведены с одомашненных зебры зябликов от гнездовой колонии в Колледже Уильяма и Мэри. Все процедуры с последующим RSPCA руководящие принципы 23 и были утверждены Колледже Уильяма и Мэри OLAW (Канцелярия лабораторных животных благосостояния) Animal Welfare Assurance (# A3713-01) и имел Уходу за животными и использование комитет (IACUC) одобрение (# 2013-06 -02-8721-Dacris).

1. Яйцо Сбор и Инкубационный

  1. Установите зебра пар Финч на 14:10 свете: темно-цикла. Поставка продуктов питания, воды, сено, и гнездо коробки без ограничений. Примечание: Регулярный уход и разведение для зебры зябликов была хорошо описана 23.
  2. Подготовьте стандартный цыплят инкубатор с наклона полок. Примечание: Поддержание искусственного инкубатор на 37,5 (+ / - 1) ° С с 80 - 95% влажности путем добавления воды к нижней части инкубатора на ежедневной основе. Разрешить инкубатор для уравновешивания в течение двух днейперед использованием.
    1. Выберите маленькие чашки поток (5 х 7,6 см) не менее 2,5 см в глубину, чтобы держать яйца в инкубаторе. Линия нижней и нижние края чаши с двумя слоями бумажного полотенца так, что чаша заполняется, хотя и предоставляет яйца легко свернуть. Поместите эти чашки на наклонных полках инкубатора. Примечание: Слишком много обивка может ингибировать прокат, который позволит предотвратить успешной инкубации из-за эмбрионального адгезией к оболочке интерьера.
  3. Сбор яиц на два часа после начала светового цикла. Примечание: Это минимизирует расхождения в стадии развития для данной инкубационного времени из-за родительского инкубации.
    1. Возьмите яйца осторожно большим и указательным пальцами на кончике и базы по длине яйца. Используйте тупой, мягкий 4B графитового карандаша для обозначения даты, установленной и время полученная от гнезда. Примечание: Чем мягче 4В карандаш снижает риск карандаша нарушения хрупкую скорлупу.
    2. 1.3.2) 1 место - 5 меченые яйца в каждой св инкубаторе, так что яйца могут свободно катиться, чтобы предотвратить эмбриональных адгезию к внутренней части корпуса. Примечание: Размещение более 5 яиц в чашке может предотвратить сворачивание отдельных яиц и уменьшить жизнеспособность эмбрионов.

2. Удаление эмбрионов от яйца

  1. Для подготовки к рассечения, собрать следующие материалы: чистый скальпеля, тонкой наконечником щипцы, и два дополнительных тонкой наконечником щипцы. Наведите 10 х 10 см весят документ по базе рассекает сферу, чтобы обеспечить чистую, не впитывающих поверхность для вскрытия. Примечание: весят бумага имеет решающее значение, поскольку она позволяет легко манипулировать желтка и является лучшим поверхность для резки тонких мембран с помощью скальпеля.
  2. Подготовка аликвоту фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS 1X) в 50 мл полипропиленовую трубку, и получить по меньшей мере три пипетки передачи и небольшое ведро отходов. Если фиксирующий эмбрионов, готовят аликвоту 4% параформальдегида (PFA). Внимание: пары PFA являются токсичными,д все шаги, связанные с PFA должно быть сделано внутри вытяжной шкаф для минимизации воздействия. Если флэш-замораживание эмбрионов, получить жидкий азот и держать его рядом с рассекает сферу. Стерильность не является проблемой для этого протокола вскрытия, но убедитесь, что все материалы были чистыми.
  3. Удалить яйцо из инкубатора в момент времени, необходимого для желательной стадии, как описано в руководстве Zebra Finch 22 промежуточной. Примечание: Удалить яйца после 36 ч инкубации рассекать этап 6 эмбрионов (рис. 4, а) 22 и снимите яйца после 56 часов инкубации рассекать этап 12 эмбрионов (рис. 3А) 22.
  4. Использование волоконно-оптического осветителя лампы, свечи яйцо, держа ее вдоль его вертикальной оси и блеск света через яйцо, чтобы осветить интерьер. Поместите кончик свете за яйца и найдите желток и развивающийся эмбрион.
    1. Расположите скальпель на стороне, противоположной желтка и разрезать вдоль яйца с головы добаза со слабым давлением.
  5. Удалить содержимое яйца, тщательно применяя давление на кончике и базы яйца с большим и указательным пальцами, или осторожно разведя яичной скорлупы вдоль разреза щипцами. Откройте яйцо прямо над взвешивания бумаги так, чтобы желток аккуратно выкатывается.
  6. Изучите желток для белого зоне сочленения, которая видна как слабый белый кольца, охватывающего эмбрионального развития и ориентироваться желток использования дополнительной тонкой наконечником щипцы так, что эмбрион находится в центре.
    Примечание: Если слабый белый круг на поверхности желтка не наблюдается, принять тонкий пинцет и аккуратно свернуть желток снова, пока эмбрион находится на вершине желтка. Примечание: Для ступеней 1 - 9 22, эмбриональный диск меньше 6 мм в диаметре и виден как слабый, слегка непрозрачной диска на поверхности желтка - см. рисунок 1 для справки. Для этапах 10 и старше 22, луж крови позволит улучшить Visibility эмбриона, но будьте осторожны, чтобы избежать прокалывания желточный мешок, так как это делает поиск эмбрион трудно.

3. Разделение эмбрионов от Экстра-эмбриональной ткани

  1. Прокол края желтком, чтобы сбросить давление (рис. 1В), и сделать одиночные сокращения по всей длине диаметром желтка рядом с эмбрионального диска. Повторите делает эти диагональные линии, пока часть желтка, содержащего эмбрион не будет успешно разделены (фиг.1В). Примечание: Этот шаг позволяет масса желток осталась невредимой, но пониженное давление на поверхности желтка позволяет более точно при резке вокруг зародыша, предотвращая повреждение эмбриональных структур.
  2. Удалить края желтка с пипетки. Примечание: Удалить столько желток, насколько это возможно, но оставить небольшое количество так, что эмбрион не прилипает к сухой поверхности взвешивания бумаги и слезы.
  3. Вымойте эмбриональных диск, dispensING 1X PBS под углом 45 ° по отношению к нижней части эмбриона. Поместите кончик пипетки рядом-не выше-эмбрионального диска. Если дополнительные потребности желток должен быть удален, отделить любой желток с скальпель на взвешивании бумаги перед передачей эмбриона в чашке Петри. Примечание: Этот метод удаляет зародыш с поверхности взвешивания бумаги.
  4. Передача эмбриона с помощью пипетки передачи вместе с минимальным объемом 1X PBS к небольшой, пластиковой чашке Петри. Вымойте эмбрион, добавив больше 1X PBS в чашку Петри и капает 1X PBS рядом, но не непосредственно на, эмбриона. Вихревой чашку Петри, чтобы вымыть и удалить остаточного желтка, наклонить чашку Петри, и удаления отходов 1X PBS с помощью пипетки для переноса.
    Примечание: Когда 1X PBS удаляется, эмбрион, как правило, не прилипает к нижней части чашки Петри, так как пластик поверхность скользкая с остаточным 1X PBS. Тем не менее, более 1X PBS может быть добавлен, если эмбрион прилипает к тарелке.
    Если фиксация тон эмбрион, выполните шаги 3,5 и 3,6. Если флэш-замораживание эмбриона, пропустите немедленно шаг 3,8.
  5. Если крепления эмбрион для в гибридизация, сразу добавить 4% PFA в чашке Петри, чтобы погрузить эмбрион. Капельное 4% PFA непосредственно на верхней части эмбриона, с тем, чтобы сгладить ее; это предотвращает эмбрион скручивания. Fix эмбрион в 4% PFA при 4 ° С в течение 12 часов.
    1. После фиксации обезвоживают эмбрионов в градуированной метанола (метанол) решений и хранить при температуре -20 ° С в 100% метаноле.
  6. Если эмбрион между стадиями 1 - 8 22, удалить желточной оболочки придерживался эмбриона. Примечание: Этот шаг может быть сделано во время или после фиксации. Эмбрионы моложе этапе 8 22 не легко визуализировать, потому что они придерживаются желточной оболочки, скрывая ключевые структуры, как показано на рисунке 2А.
    1. Возьмитесь за край мембраны, которая простирается за пределы зоны сочленения с дополнительными тонких щипцов. CarefUlly флип эмбрион в течение нескольких раз, чтобы смыть гранулы остаточного желтка и, чтобы ослабить приверженность эмбрионального диска к желточной оболочки. Примечание: Не прикасайтесь к центру эмбриона, так как это может привести к повреждению эмбриональных структур.
    2. Если разрыв не появляется между зоне сочленения и желточной оболочки, мягко поцарапать зоне сочленения с дополнительным штрафом наконечником щипцы, чтобы ослабить его от желточной оболочки. Возьмитесь за желточной оболочки с дополнительным штрафом наконечником щипцы и аккуратно выньте ее от эмбриона. При необходимости осторожно потяните эмбрион от желточной оболочки, ухватившись за периферийного края зародышевого диска в зоне сочленения.
    3. Откажитесь желточной оболочки в биологической 1 отходов (уровень биобезопасности 1) после удаления.
  7. При проведении ISH анализа на молодых эмбриональных стадиях, следовать стандартным целые протоколы монтирования ISH для куриных эмбрионов 24, 25, но рассмотреть следующие предложения. Чтобы уменьшить ущерб эмбрионов во время процедуры ISH, использовать один стеклянный пузырек 5 мл с завинчивающейся крышкой для каждого эмбриона. Только заполнения флаконов с 2 - 3 мл раствора, гарантируя, что эмбрионы полностью погружен в воду. Колебаться флаконы вертикально путем размещения флаконах по 5 мл в пенополистирола стойку (или любой стойке, которая будет держать флаконы безопасности), который крепится к nutator. Примечание: Эта мера предосторожности предотвращает эмбрион от разрывается, которые могут возникать, когда он вступает в контакт с крышкой флакона в течение горизонтальной нутации.
  8. Для эмбрионов на стадии 0 - 6 22, лечить с 5 мкг / мл протеиназы К в 1X PTW в течение 5 мин при комнатной температуре. Treat эмбрионы постановке 7 - 12 22 с 10 мкг / мл протеиназы К в 1X PTW в течение 10 мин при 37 ° С, чтобы уменьшить фоновое окрашивание.
  9. Чтобы производить достаточное цветной реакции для обнаружения низких уровней экспрессии генов в этапах 1 - 10 22, инкубировать с концентрацией 10 мкг / мл зонда в течение 12 часов. Для старших этапах, инкубировать с 1 & #Концентрация зонда г / мл при 60 ° С; 956
  • Если флэш-замораживание эмбриона, быстро добавить 2 - 3 мл 1X PBS в чашке Петри следующие вскрытия и наклоните чашку Петри для разделения эмбриона из гранул желтка. Удалить жидкость и повторите 2 - 3 раза, чтобы удалить все желток. Использование тонкой наконечником щипцы, перенос эмбрионов в предварительно меченных микроцентрифужных трубки и флэш-замораживание в жидком азоте перед хранением при -80 ° С
  • 4. EDU сотовый Анализ пролиферации. Включение и Обнаружение EDU в Zebra Finch эмбрионов.

    1. Свеча яйцо с использованием волоконно-оптического осветителя лампы, чтобы найти эмбриона или желток.
    2. Отметьте сторону яиц, противоположной расположению эмбриона или желтка в яйце чтобы гарантировать, что эмбрион не повреждены в процессе микроинъекции.
    3. Линия 60 мм пластиковый блюдо с пластилином и формировать ее в форме чаши для хранения яйцо в требуемой ориентации. Заметное место должно бытьориентированы на можно было вставить микроинъекции иглы с помощью микроманипулятора. Примечание: глина стабилизирует яйцо во микроинъекции и в течение инкубации в шаге 4.11.
    4. Потяните два стекла капиллярные микроинъекции иглы. Блант одной иглы, чтобы сделать дырку в яйцеклетку в отмеченных месте. Подготовьте второй микроинъекции иглы для инъекций по обратной загрузкой его с минеральным маслом и вставить его в microinjector.
    5. Установите объем раствора выпущен на инъекцию до 59,8 нл на microinjector.
    6. Загрузите микроинъекции иглу с 10 мМ раствора складе EDU.
    7. Создайте отверстие в оболочке на отмеченных месте с затупленной стеклянного капилляра, заботясь, чтобы не разрушить оболочку или падение кусков оболочки в полость яйца. Ориентируйте яйцо так, что отверстие под углом 45 °, что позволяет микроинъекции иглы должен быть вставлен непосредственно через полость в желтке или эмбриона.
    8. Использование микроманипулятора, вставьтезагружены иглу примерно 1,0 см в полость.
    9. Введите требуемое количество раствора ОБР непосредственно на развивающегося эмбриона или желтка. Примечание: не более 478 л оксида EDU может быть введен не приводя к эмбриональной смерти.
    10. Сразу обернуть яйцо и держатель глины с несколькими слоями полиэтиленовой пленкой, чтобы покрыть яйцо и блюдо, чтобы предотвратить высыхание эмбриона в процессе инкубации. Ленточные края полиэтиленовой пленкой на дне чашки, чтобы предотвратить пластик от разворачивания во время инкубации. Примечание: пластиковая обертка должна быть удалена только непосредственно перед вскрытия.
    11. Разрешить пролиферирующие клетки вновь включить ОБР путем инкубации яйцо при 37 ° С, пока желаемый этап не будет достигнута. После инъекции, не возвращаются яйцо наклона полки в инкубаторе. Поместите глины выстроились блюдо пластиковую обернутый на устойчивой поверхности внутри инкубатора.
    12. Удалите пластиковую обертку и препарировать эмбрион после вышеупомянутого протокола.Закрепить эмбриона в 4% PFA и инкубировать 12 ч при 4 ° С, как описано выше. После фиксации не мыть со 100% этанола (EtOH) в течение 5 мин и хранить в пресной 100% EtOH при -20 ° С до дальнейшего анализа.

    5. EDU "Click" Протокол реагирования

    Следующие шаги все выполняется в стеклянных флаконах.

    1. Увлажняет эмбрионов с последовательными 5 мин моет следующее:
    2. EtOH, 75% EtOH и 25% стерильной деионизированной дистиллированной (SDD) воды, 50% этанола и 50% воды SDD, 25% EtOH и 75% 1X PTW, 100% 1X PTW
    3. Вымойте три раза в 100% 1X PTW в течение 10 мин каждый.
    4. Развести буфера добавку реакции (комплект компонентов F) путем объединения 1 часть фондового буферного раствора 10X (10 мкл) в 9 частей SDD воду (90 мкл).
    5. Подготовка реакционной смеси в отдельную пробирку путем смешивания следующих действий: 875 мкл 1X PBS, 20 мкл CuSO 4, 5 мкл азид, 100 мкл реакционного буфера разводили добавки.Примечание: Объем реакционной смеси может быть уменьшено. Реакционную будет работать, если эмбрион полностью покрыты в реакционной смеси. Добавить разбавленный реакционного буфера добавку (этап 5.3) непосредственно перед использованием. Все последующие этапы выполняются в темноте. Покройте эмбрионов с фольгой для защиты от света.
    6. Обложка флаконы с алюминиевой фольгой, и инкубировать их вертикально при комнатной температуре в течение двух часов, помещая их в пенополистирола стойке, прикрепленной к nutator.
    7. Вымойте эмбрионов 3 раза в пресной 1X PBS в течение 10 мин каждый.
    8. Выдержите эмбрионов в пресной 4% PFA в течение ночи при 4 ° С.
    9. Промыть 3 раза в 1X PBS в течение 10 мин каждый и магазинов в пресной 1X PBS при 4 ° С. Накройте эмбрионов с фольгой до дальнейшего анализа.

    Representative Results

    Шаги схематически на рисунке 1 показывают внешний вид эмбриона в то время как прикреплен к желточной оболочки (А) и демонстрируют правильный метод для разделения эмбриона от желтка (B). Эмбрион можно определить по зоне сочленения, который намного легче, чем желточной оболочки. Сам эмбрион часто бывает трудно различить, пока желток не срезан. После того, как эмбрион расчлененный из яйца, он может быть фиксированной или быстро замораживали для дальнейшего использования. Если в гибридизация запланировано на рассеченной эмбриона, необходимо удалить желточной оболочки, которая приклеена к эмбриону через зону перехода. Рисунок 2 иллюстрирует улучшенную видимость эмбриона, как только это мембрану удаляют (С), и правильный способ очистить желточной оболочки (А, В). После вскрытия и фиксации, вся гора в гибридизация проводили, как показано на рисунке 3 (А, А ', В, В') И фиг.4 (A, A', B, B ') и фиг.5 (A, B, C) ​​для определения различий в orthodenticle гомеобоксом 2 (Otx2) экспрессии у эмбрионов с развитием подверженных воздействию низких доз метилртути. 5 показан Результаты смысл зонд, демонстрируя отсутствие фоне. На рисунке 4, несмотря на то, расчлененный из яйца в тот же момент времени, эмбрион умственно подвергаются воздействию метилртути (MeHg) продвинулись к стадии 5 22 (В, В '), в то время как контроль эмбрион разработан на сцене 6 22 (А, А »). Группа эмбрионов рассекали и показано на рисунке 4 были собраны из гнезда и взяты из инкубатора в то же время. Хотя некоторые естественные вариации присутствует в развитии, на основе предыдущих данных рассечение, то маловероятно, что колебания температуры в инкубаторе может вызвать только промилле эмбрионы метилртути 2,4 быть развитpmentally задерживается. Различия в стадиях указывают на изменения в клеточной пролиферации в эмбрионах с развитием, подверженных метилртути.

    Перед вскрытия, EDU вводили в день 2 яйца и инкубировали в течение ночи. После вскрытия и фиксации сцене 16 22 эмбрионов, EDU визуализировали с использованием "нажмите" химию, позволяя обнаруживать размножающихся клеток, как показано на рисунке 6 (А, В, С). Важно внимательно следить за временные точки при размещении яйца в инкубаторе и во время вскрытия, как воздействие метилртути или выполнением анализа EDU может нарушить развитие развития. Самый ранний впрыск проводили на день 0, который был в день сбора, указанный в действии 1.3. Это эмбрион рассекали около 38 часов спустя (этап 7 22). Выживаемость было установлено, что примерно 90% (такой же скоростью, как контрольных эмбрионов) тех пор, пока количество впрыска находилась под 478 нл.

    22 эмбрионов, Выделение РНК проводили в соответствии с протоколом производителя, без оптимизации необходимой, как показано на рисунке 7. Удаление желточной оболочки не было необходимости для экстракции РНК и более поздних приложений Qrt-PCR.

    Примечание: Все цифры эмбрионов ориентированы так, что передние и задние участки расположены в верхней и нижней части изображения, соответственно.

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Порядок размещения и рассекает эмбрионов Zebra Finch, этапы 1-10 22. Найдите эмбрион на покатых желток, пока слабый белый диск не видно (А). Послеэмбрион расположен в центре желтка, желток рассекают ступенчато (B), где первый разрез снимает давление желточной оболочки (1) и последующие сокращений (2) граничат с зоной перехода (Zj), который придерживался желточной оболочки. Масштабные полоски представляют 1 мм.

    Рисунок 2
    Рисунок 2. Удаление желточной оболочки и видимости эмбриональных структур. После удаления зародыша от желтка, место эмбриона в чашку Петри, содержащую 4% PFA. Если в гибридизация должна быть выполнена, видимость из эмбриональных структур имеет важное значение и может быть достигнуто путем удаления желточной оболочки (A). Возьмитесь за желточной мембрана с дополнительной тонкой наконечником щипцы и аккуратно очистить его от эмбриона путем обработки эмбрион непосредственно на внешней кромке, в случае необходимости(B). Желточный удаление мембраны увеличивает четкость эмбриональных структур, а также позволяет эмбрионов быть отображены или обработаны в гибридизация (С). Масштабные полоски представляют 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Вся гора в гибридизация осуществляется на эмбрионах зяблик зебры развитием, подверженных метилртути. Паттерны экспрессии orthodenticle гомеобоксом 2 (Otx2) характеризовались в эмбрионах, подверженных 0,0 промилле метилртути (А, А ') и 2,4 промилле метилртути (B, B ') через родителей диеты. Сделайrsal (А) и вентральной (') выражение Otx2 видна на протяжении среднего мозга и глазных пузырей во время этапа 12 22. Эмбрионы группе лечения были вскрыты в тот же момент времени, но были отстающих в развитии, как показано на спинной (В) и вентральной (В ') вид головных структур, которые характерны для стадии 11 22 Сокращения:. мб, среднего мозга; оп, глазной пузырь. Масштабные полоски представляют 1 мм.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. Вся гора   на месте   гибридизации выполняется на эмбрионах Zebra Finch развитием, подверженных метилртути. паттерны экспрессии orthodenticle гомеобоксом 2 (Otx2) характеризовались в стадии 6 22 Эмбри ОС подвергается 0,0 промилле метилртути (А, А ') и стадии 5 22 эмбрионов, контактирующие с 2,4 промилле метилртути (В, В') через родителей диеты. Сокращения: утра, передний край мезодермы; нет, хорда, хорда мезодерма; Ро, proamnion, передняя бластопор; пс, первичная полоска 22. Масштабные полоски представляют 1 мм.

    Рисунок 5
    Рисунок 5. Всего смонтировать на месте   гибридизации выполняется на эмбрионах зяблик зебры использованием смысл зонд. (А) Стадия 5 22 эмбрионов. (В) Ранняя стадия 6 22 эмбрионов. (С) Стадия 11 22 эмбрионов. Масштабные полоски представляют 1 мм.

    6 "Первоначально" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
    Рисунок 6. EDU включение и де СРЕДЫ в эмбрионах зяблик зебры. EDU "нажмите" химия была использована для обнаружения пролиферирующих клеток в стадии 16 22 эмбрионов (А, В, С). ОБР включена в ДНК в месте тимидина 26, 27 и обнаруживается с помощью щелчка химии 27. Пролиферация отчетливо видна в боковых краев сомитов, а также хвостовой почки. Группа показывает пролиферацию, происходящих исключительно в задней части эмбриона, а также показаны отдельные пролиферативные клетки. Панель В показывает пролиферативные места в целом эмбриона. Панель C показывает переднюю область, и показывает весьма пролиферативный конечного мозга (TE) более подробно. Сокращения: AF, амниотической раза; FLB, передних конечностей бутон; HLB, задних конечностей бутон; ле, объектив пузырек; мс, средний мозг; Монтана, Задний мозг; OPC, глазной бокал; годовых, глотки арки; см, сомит мезодерма; ложки, хвостовой почки; Те, конечный мозг. Масштабные полоски представляют 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 7
    На рисунке 7. Качество РНК, выделенной из вскрытых эмбрионов Zebra Finch. Управления (0.0 м.д.) и 1,2 м.д. эмбрионов метилртути рассекали и быстро замораживали как описано в шаге 3.8. Каждая дорожка показывает РНК, выделенной из двух гомогенизированных эмбрионов из каждой группы обработки.

    Discussion

    Последние разработки в эмбрионального руководства промежуточной 22 и генома аннотации сделать Zebra Finch желательно модельный организм для исследований развития. Тем не менее, небольшой размер и хрупкость эмбрионов Zebra Finch, которые варьируются от 3 ​​до 7 мм в несколько этапов 1 - 10 22, может сделать вскрытия трудно 11, 14. Обнаружение и чисто удаления эмбрионов от поверхности желтка может оказаться непростой задачей. Этот протокол обеспечивает достаточно подробную информацию для выполнения процедуры с легкостью. Этот протокол демонстрирует важные шаги, которые не правило, известны, но которые необходимы для обеспечения успешного вскрытия. Например, важно, чтобы оставить небольшой слой желтка между эмбриона и листа вес бумаги, чтобы предотвратить прилипание.

    Оба также выявление и удаление эмбриона может быть затруднено. Для устранения идентификации эмбрион на поверхности желтка, пролить свет непосредственно над желтка после егобыли удалены из яйца, и посмотреть на желтке под углом 45 °, чтобы найти эмбрион. После того, как эмбрион находится, вырезать желток на вес бумаги заботиться, чтобы не оторвать эмбрион.

    Если дальнейшие приложения включают изображений для анатомических различий, в гибридизация, или пролиферации клеток анализов, важно, чтобы удалить желточной оболочки на стадии 1 - 8 22 для лучшей визуализации структур. Если возникли трудности при удалении желток или желточной оболочки на ранних стадиях, исправить эмбрион в 4% PFA до мытья его в 1X PBS, чтобы уменьшить эмбриональных хрупкость. По предварительного удаления желточной оболочки во время вскрытия, как описано, структуры четко видны и сохранности в эмбрионах зяблик зебры после выполнения в гибридизация.

    Ограничение EDU является то, что администрация объемов лекарственных над 478 нл приводит к эмбриональной смертности. Однако подавляющее диапазон доз позволяет varyinУровни г пролиферативной пометки клеток.

    "Щелчок" реакция используется в этом наборе является меди (I), катализируемой-Алкины-азид-циклоприсоединения (Cu (I) AAC). В данном конкретном реакции, алкин содержащих аналог тимидина молекула (EDU) включен в активно делящихся клеток. Группа алкина в ОБР выступает из спиральной структуры ДНК, и обнаруживается под воздействием молекулы азида, конъюгированного с зеленым флуоресцентным, молекулы, которые связываются с свободного алкина группы. Зеленая флуоресценция показывает недавно пролиферирующих клеток в эмбрионе. Био-ортогональность азида и алкиновые группы предотвращает неспецифическую окрашивание, потому что эти активные формы не естественным образом присутствуют в организме. Кроме того, поскольку ДНК не должны быть денатурированный для того, чтобы протекания реакции, далее ДНК-зависимой анализ может быть легко выполнена 27.

    Естественное ограничение этого метода является небольшой размер и фрагментСОСТОЯНИЯ эмбрионов зяблик зебры. Удаление желточной оболочки эмбрионов стадии 1 - 15 22 может привести к повреждению эмбриональных структур, если не выполняется с осторожностью. Тем не менее, этот протокол упрощает метод вскрытия, что позволяет исследователям использовать ранние эмбриональные стадии изучить структурные аномалии и экспрессию генов, которые не были ранее изучены в глубину. Этот протокол открывает путь для множества сотовых молекулярной анализов, которые позволят исследователям определить происхождение развития взрослых фенотипов. Например, можно будет изучить экспрессию генов вовлечены в вокальной обучения в различных условиях окружающей среды или после фармакологическое лечение на самых ранних стадиях развития 28 29,30,31. Хотя это и не показано в этой работе, этот метод позволяет потенциально для других процедур, таких как радиоактивные в гибридизация Zebra Finch на срезах тканей и электропорацию / в OVо хирургии 32, 33,34. Учитывая, что Zebra Finch был создан в качестве важного модельного организма в пределах огромного объема литературы, такие исследования дают неиспользованные возможности связать механизмы развития со взрослой физиологии и поведения, в частности, развития языка 7, 9.

    Disclosures

    Авторы не имеют ничего раскрывать.

    Acknowledgments

    Авторы благодарят своих источников финансирования, программу в колледже Уильяма и Мэри Медицинского института Говарда Хьюза Бакалавриат Научное образование; Спонсор Грант: NIH (MSS); Число Грант: R15NS067566. Они также признают, поддержку со стороны колледжа Уильяма и Мэри, биологический факультет и колледж искусств и наук об оказании помощи в уходе за животными.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chicken egg incubator We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model   
    Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    Dissection microscope  We use Olympus SZ61
    7'' Drummond capillary for Nanoject II injector Drummond 3-00-203-G/X
    Drummond Nanoject II microinjector Drummond
    Dumont Tweezers #55 World Precision Instruments 14099
    Ethanol (EtOH)
    50 ml Falcon tube (polypropylene) Fisher Scientific 06-443-18 
    FastPrep Lysis Matrix H tubes MP biomedicals 6917-100 Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) Dolan-Jenner Industries  Fiber-Lite MI-150 
    Glass vials with screw cap (DEPC treated) Fisher Scientific 03-338A
    Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) Fisher Scientific 05-408-129
    Mineral oil Sigma-Aldrich M-8410
    Modeling Clay Any brand
    Narshige PB-7 needle puller Narshige
    Omni Bead Ruptor Homogenizer OMNI International 19-010 Used for RNA extraction
    4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. 
    Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4
    Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5
    Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20
    35 ml Plastic Petri dish  Fisher Scientific 08-757-100A
    plastic wrap Any brand
    Prepease RNA Spin Kit PrepEase, Affymetrix 78766 1 KT Used for RNA extraction, used to homogenize embryos
    Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) Invitrogen C10337 Detection of cell proliferation. 
    sdd H2O
    Seed cup  We use it as a container when incubating eggs
    Stainless steel scalpel 
    Standard nest box We use Abba Plastic Finch Nestboxes
    4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials Fisher Scientific 02-912-352
    Transfer pipettes (polyethylene) Fisher Scientific 13-711-7M 
    4 x 4 weigh paper Fisher Scientific 09-898-12B

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
    2. Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
    3. Maney, D. L., Goodson, J. L. Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds. Adv Genet. 75, 83-119 (2011).
    4. Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
    5. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
    6. Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
    7. Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
    8. Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
    9. Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
    10. Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
    11. Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. (2012).
    12. Warren, W. C., et al. The genome of a songbird. Nature. 464, 757-762 (2010).
    13. Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
    14. Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
    15. Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
    16. Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
    17. Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
    18. Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
    19. Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
    20. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
    21. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
    22. Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. (2013).
    23. Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. (2001).
    24. Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
    25. Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
    26. Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
    27. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
    28. Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
    29. Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
    30. Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
    31. Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
    32. Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. (2012).
    33. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
    34. Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics