زرع الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع في نموذج الفأر

1Tissue Engineering Program and Surgical Research, Nationwide Children's Hospital, 2Department of Cardiothoracic Surgery, Nationwide Children's Hospital, 3Pediatric Surgery, Nationwide Children's Hospital
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

لتحسين معرفتنا تشكيل neotissue الخلوية والجزيئية، تم تطوير نموذج الفئران من TEVG مؤخرا. تم زرع الطعوم كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. هذا النموذج يحقق نتائج مماثلة لتلك التي تحققت في التحقيق السريرية لدينا، ولكن على مدى تقصير حتى الوقت بالطبع.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, Y. U., Yi, T., Tara, S., Lee, A. Y., Hibino, N., Shinoka, T., et al. Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model. J. Vis. Exp. (88), e51632, doi:10.3791/51632 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وغالبا ما تستخدم السقالات المصنفة قابلة للتحلل مع خلايا نخاع العظام وحيدات النوى (خلايا نخاع العظم) لجراحة لعلاج التشوهات الخلقية في القلب. أظهرت النتائج السريرية طويلة المدى في أسعار المباح ممتازة، ولكن، مع انتشار كبير لتضيق. للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية ومنع التنمية تضيق في الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs)، قمنا بتطوير نموذج الفأر من الكسب غير المشروع مع ما يقرب من 1 مم القطر الداخلي. الأولى، تم تجميعها TEVGs من السقالات الأنبوبية القابلة للتحلل ملفقة من محبوكة حمض polyglycolic شعرت شبكة المغلفة مع ε-caprolactone وL-lactide من البوليمرات. والسقالات ثم توضع في مجفاد، بالمكنسة الكهربائية لمدة 24 ساعة، وتخزينها في مجفف حتى بذر الخلية. الثانية، وقد تم جمع نخاع العظم من فئران المانحة وتم عزل الخلايا وحيدات النوى من قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي. الثالث، كان ما يقرب من مليون خليةالمصنفة على السقالة وحضنت O / N. أخيرا، تم السقالات المصنف ثم زرعها كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. أظهرت ترقيع مزروع المباح ممتاز (> 90٪) دون وجود أدلة حدوث مضاعفات الانسداد التجلطي أو تشكيل أمدمي. وهذا نموذج الفئران تساعدنا في فهم وقياس الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue في TEVG.

Introduction

عيوب القلب الخلقية هي الظروف الخطيرة التي تؤثر على ما يقرب من 8٪ من الولادات الحية في الولايات المتحدة. ما يقرب من 25٪ من الرضع الذين يعانون من عيوب خلقية في القلب أو 2.4 لكل 1،000 ولادة حية، تتطلب العلاج الغازية في السنة الأولى من حياتهم 1. العلاج الأكثر فعالية لأمراض القلب الخلقية هو الجراحة الترميمية. للأسف، والمضاعفات الناجمة عن استخدام القنوات المتاحة حاليا الأوعية الدموية هي السبب الأكثر أهمية للمراضة والوفيات بعد الجراحة.

لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير أول الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs) للاستخدام السريري 2. شيدت TEVGs من أنابيب البوليستر القابلة للتحلل المصنف مع نخاع العظم ذاتي الخلايا المستمدة من وحيدات النوى (BM-الشركات المتعددة الجنسيات) وزرع كقنوات الوريدي لجراحة القلب الخلقية. أظهرت النتائج معدلات ممتازة في المباح 1-3 سنوات من المتابعة، ولكن مع انتشار كبير من تضيق 5،6. في هذا النموذج، وTEVGs تحولت بنجاح في السفن الذين يعيشون وكانت مشابهة في كل من التشكل وظيفة الأوردة الأصلية. كان هذا الاستخدام نموذج الحيوانات الكبيرة خطوة أولى جيدة في توفير معلومات ما قبل السريرية الهامة التي ساعدت الاستخدام السريري للTEVGs. ومع ذلك، فهم كامل من الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية في TEVGs باستخدام نماذج حيوانية كبيرة محدودة بسبب القيود في التوصيف الجزيئي للخلية الظواهر الأوعية الدموية بسبب نقص أنواع الأدوات الجزيئية محددة. للتغلب على أوجه القصور هذه، تم تطوير نموذج الفئران من TEVGs بسبب التقدم السريع في علم الوراثة والبيولوجيا الماوس الخاصة بهم واسعةص توصيف مع ميزة إضافية تتمثل في مقياس زمني تقصير.

في الفئران IVC نموذج مداخلة لخص بإخلاص عملية neovessel التشكيلة التي تحدث في الحيوانات الكبيرة والبشر، ولكن مع مرور دورة زمنية أقصر بكثير 6-9. هنا، بروتوكول مفصلة لتصنيع الكسب غير المشروع على نطاق ضيق باستخدام السقالات القابلة للتحلل، وصفت حصاد BM-MNC والعزلة، BM-MNC البذر على السقالة، وزرع الفساد في نموذج الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة مستشفى المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام البلاد للطفولة.

1. الكسب غير المشروع تصنيع

  1. جعل الحل ε-caprolactone وL-lactide كوبوليمر P (LA / CL) وذلك بإضافة 100MG P (LA / CL) في 2 مل ديوكسان تحت غطاء الدخان. وضع الحل على دوامة وخلط مستمر لمدة 1-1.5 ساعة لتذوب تماما.
  2. في هذه الأثناء، وإزالة ورقة من حمض polyglycolic (PGA) ورأى من الفريزر وقطع العديد 5 × 8 أقسام ملم. أيضا بقطع غيض من ماصة ميكرولتر ،1-10 فقط فوق تصفية.
  3. إدراج 19 G إبرة (1.5 طول) في نهاية البعيدة من طرف الماصة والتفاف شعر PGA حول إبرة باستخدام ملقط الجزئي.
  4. دفع بعناية اللباد إلى نهاية البعيدة للطرف الماصة، حيث التجويف هو استقامة من الجزء القريب، وذلك باستخدام إبرة حادة 18 G، في حين يتم إدخال إبرة G 19 في ذلك.
  5. ماصة40 ميكرولتر P (CL / LA) حل في تلميح ماصة من أعلى. تشبع PGA شعرت مع الحل. ثم دفع فقاعات الهواء خارج باستخدام موزع ماصة. تكرار هذه العملية إذا لزم الأمر.
  6. المكان الطعوم في أنبوب 50 مل ووضعه في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تأكد من أن رئيس الإبر مواجهة الهبوط.
  7. نقل أنبوب إلى مجفاد وفراغ لمدة 24 ساعة. تأكد من فتح غطاء أنبوب أن يكون تدفق الهواء.
  8. اخراج الطعوم وإزالتها من الإبر. قطع طرفي الكسب غير المشروع ترك ملم القسم ~ 5 ووضعها مرة أخرى على الإبر للحفاظ على شكلها. إبقاء الطعوم في مجفف.
  9. وضع السقالة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجال السلامة الأحيائية هود O / N قبل البذر الخلية.

2. نخاع العظم وحيدات النوى حصاد الخليوي والعزلة

  1. الموت ببطء الفئران مع جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين (الكيتامين، 200 ملغ / كغ وزيلازين، 20 ملغ / كلغ).
  2. إزالة العظام (عظام الفخذ ود tibias) من 3 الفئران لمدة 10 زرع الكسب غير المشروع ووضعه في طبق بتري مع 10 سم مكعب RPMI. قطع طرفي العظام ونخاع العظام دافق باستخدام حقنة مع إبرة G 25 في طبق بتري جديدة مع 3 سم مكعب RPMI. جمع نخاع العظام وحل RPMI في 15 سم مكعب وأنبوب غسل طبق بتري مع إضافية RPMI 2 سم مكعب لجمع ما تبقى من BM.
  3. تأخذ عينة (5-10 ميكرولتر) وعدد الخلايا باستخدام خلية مكافحة الآلي أو عدادة الكريات. سجل النتيجة.
  4. وضع 5 سم مكعب Ficoll في أنبوب الطرد المركزي 15 سم مكعب وإضافة نخاع العظم وحل RPMI. إضافة الحل بلطف شديد لمنعها من الاختلاط مع Ficoll.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 528 x ج لمدة 30 دقيقة مع "NO الفرامل" في 24 درجة مئوية.
  6. إزالة الطبقة العليا وردي. جمع الوسط واضحة طبقة الشكل 1، والتي هي طبقة MNC، وتمييع مع PBS 1:1.
  7. أجهزة الطرد المركزي في محلول مخفف MNC في 528 x ج لمدة 10 دقيقة في 24 درجة مئوية.
  8. إزالة طاف وديالعود بيليه مع 5 مل PBS.
  9. أجهزة الطرد المركزي في حل بيليه في 528 x ج لمدة 10 دقيقة في 24 درجة مئوية.
  10. إزالة طاف. تمييع بيليه مع حجم مناسب من RPMI (~ 200 ميكرولتر).
  11. أخذ عينة ميكرولتر 5-10 وتعول الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي أو عدادة الكريات. سجل النتيجة. تكرار الخلية عد واحد مزيد من الوقت وحساب متوسط ​​عدد الخلايا.
  12. تمييع تركيز الخلية إلى 1،000،000 cells/10 ميكرولتر باستخدام RPMI.

3. البذر الخليوي

  1. سقالة Prewet بإضافة 5 ميكرولتر RPMI luminally لمدة 5 دقائق، ثم إزالة RPMI.
  2. إضافة 10 ميكرولتر نخاع العظام المستمدة الخلايا أحادية النووية في RPMI من الخطوة 2.12 إلى التجويف السقالة والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على السقالة.
  3. خفض إبرة 19 G إلى 1 سم طول ووضع الإبرة في التجويف من السقالة للحفاظ على شكل السقالة. وضع العينة في 24 لوحة جيدا. </ لى>
  4. إضافة ميكرولتر 1،000 RPMI إلى كل بئر واحتضان O / N في حاضنة.

4. زرع الكسب غير المشروع

  1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة: 1x أخرى مقص غرامة، وملقط الدقيقة 3X، والمشابك الأوعية الدموية الصغيرة 2X، 1X المشبك ملقط تطبيق، 1x أداة حامل الإبرة الصغيرة، مقص الربيع 1X، 1X ضام.
  2. 6-8 أسابيع من العمر الإناث تستخدم C57BL / 6 كما الأنسجة المهندسة المتلقين الكسب غير المشروع الأوعية الدموية. إزالة الماوس من قفصه وتزن عليه، ثم تخدير عن طريق حقن داخل الصفاق في الربع السفلي الأيمن من البطن مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين (الكيتامين، 100 ملغ / كغ وزيلازين، 10 ملغ / كلغ). يستخدم كيتوبروفين (5 ملغ / كغ، IP) كمسكن ما قبل التخدير.
  3. فحص مستوى التخدير بواسطة معسر حكاية، ثم مقطع الشعر في البطن. تليين العينين مع مرهم للعين معقمة، ووضع الماوس في وضع رقود ظهري على وسادة. تطهير البطن مع بتدين والكحول منصات. شاركVER الماوس مع ثنى العقيمة وفضح منطقة شق فقط.
  4. جعل خط الوسط شق البطن من تحت سيفي الشكل إلى منطقة فوق العانة، وإدراج ضام الذاتي الاحتفاظ. التفاف الأمعاء في المياه المالحة الشاش المبلل. تحدد بصراحة الشريان الأورطي infrarenal والوريد الأجوف.
  5. وضع اثنين من المشابك الأوعية الدموية الصغيرة على حد سواء القريبة والبعيدة الجانبين من الشريان الأبهر والوريد الأجوف ثم فصل بصراحة الشريان الأورطي من الوريد الأجوف إقطع الوريد الأجوف. إذا لزم الأمر، ligate فروع الأبهر البطني مع 10-0 الغرز حيدة على الإبر مدبب.
  6. زرع على الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع مع نهاية الداني القاصي وإنهاء anastomoses باستخدام العقيمة 10-0 خياطة. تقليم الكسب غير المشروع، عادة 1-2 مم، يعتمد على التشريح من الفأرة. تأمين الكسب غير المشروع مع غرزة واحدة على كلا طرفي القاصي والداني والبدء في خياطة باستمرار مع 4-5 غرز من الجانب الآخر من الكسب غير المشروع. بعد الانتهاء من الجانب الأمامي، والوجه المشابك والطعومإلى الجانب الآخر وخياطة الجانب الخلفي من الكسب غير المشروع. خلال زرع، تدفق الكسب غير المشروع مع الحل الهيبارين في كثير من الأحيان لمنع تجلط الدم الحاد.
  7. إزالة المشبك الداني والسيطرة على النزيف من خلال تطبيق موضعي للامتصاص وكيل مرقئ العقيمة. عندما يتوقف النزيف تماما، وإزالة المشبك القاصي والسيطرة على النزيف بنفس الطريقة. جعل تدفقات الدم تأكد من خلال الكسب غير المشروع.
  8. إغلاق عضلات البطن والجلد في طبقتين باستخدام مادة البولي أميد 6-0 سوداء خياطة حيدة مع إبرة شملت مترابطة.
  9. حقن 0.5 مل تحت الجلد المالحة ووضع الماوس في قفص الانتعاش على وسادة الاحترار حتى الماوس النقالة بشكل كامل. بعد شفائهم، والعودة الماوس لقفص جديد مع الفراش ورقة. إعطاء مسكنات للألم (ايبوبروفين، 30 مغ / كغ، ومياه الشرب) لمدة 48 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد التخطيطي TEVG غرس في الشكل 1. كان حصادها نخاع العظم من الماوس المانحة وتم عزل الخلايا أحادية النووي باستخدام كثافة الطرد المركزي ثم المصنف على سقالة قابلة للتحلل. حضنت السقالات المصنفة O / N وزرعها لماوس المتلقي باعتبارها الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع.

ويوضح الشكل (2) والمجهر الإلكتروني من PGA-P (CL / LA) السقالة. كان القطر الداخلي حوالي 1 ملم وكان سمك الجدار حوالي 0.17 مم. كان المسامية الكلية 78.5٪ ويعني كانت أحجام المسام 45.4 ± 17.6 ميكرون.

يتم عرض الصورة الإجمالية لTEVG موسط في IVC من C57BL / 6 الفئران في الشكل 3. مباشرة بعد الزرع (A) و2 أسابيع بعد الزرع (B). (C) يوضح الصورة الإجمالية لIVC الأصلي في المقارنة. فمن الواضح أنوقد شغل الكسب غير المشروع مع neotissue، ومع ذلك، فإنه لا يزال يحتفظ بها على شكل الكسب غير المشروع الأصلي. وأظهرت لدينا النتيجة السابقة أن إجمالي تدهور الكسب غير المشروع يستغرق فترة تصل إلى 12 أسبوعا 10.

الموجات فوق الصوتية B-وضع صورة ولون دوبلر من 2 أسابيع مزروع TEVG أرقام 4A-B لإظهار المباح من الطعوم مزروع. تمت إضافة صورة IVC الأصلي للمقارنة (الشكل 4، C). بذر الخلية تحسين المباح من الكسب غير المشروع بشكل ملحوظ، patencies في 2 أسابيع لترقيع غير المصنف والمصنف هي 65٪ و 91٪ على التوالي (ع <0.05، واختبار فيشر الدقيق).

ويبين الشكل 5 تسلل الخلية وترسب مصفوفة خارج الخلية في TEVG بعد 2 أسابيع من الزرع. أظهرت ترقيع Explanted ملطخة H & E تلطيخ تشكيل neotissue في جميع أنحاء الكسب غير المشروع والباقي من المواد سقالة (A). أظهرت الوعول وصمة عار ثلاثي الألوان ماسون في ترسب الإيلاستين في في طبقة timal (B) والكولاجين في طبقة وسطي (C). ولوحظ بطانة الخلايا البطانية في جميع أنحاء طبقة باطنة (D) وكانت متكدسة خلايا العضلات الملساء موجودة في جميع أنحاء TEVG، وخاصة تحت EC بطانة (E) كما هو موضح من قبل CD31 وتلطيخ αSMA، على التوالي. بحلول الأسبوع الثاني بعد الزرع، وكان تسلل واضح البلاعم، كما هو مبين مع F4/80 تلطيخ (F).

الشكل 1
تم حصادها الشكل 1. تخطيطي TEVG زرع. خلايا نخاع العظام النووية أحادية من الماوس المانحة، المصنفة على سقالة قابلة للتحلل، ومن ثم زرعها بوصفها مداخلة الكسب غير المشروع IVC إلى ماوس المتلقي.

رقيقة الصفحة = "دائما"> الرقم 2
صور الشكل 2. الضوئي المجهر الإلكتروني من السقالة. وكان متوسط ​​القطر الخارجي 1.45 ملم، وكان قطرها 1.1 مم اللمعية، وكان طول 3 مم.

الرقم 3
الرقم 3. مزروع TEVG بعد 2 أسابيع وIVC الأصلية. أ) مباشرة بعد الزرع، B) بعد 2 أسابيع الزرع، وC) الأم IVC للمقارنة.

fig4.jpg "/>
الشكل 4. صور الموجات فوق الصوتية 2 أسابيع والأم IVC. أ) صورة B-Mode و B) لون دوبلر TEVG بعد 2 أسابيع. C) اللغة الأم IVC للمقارنة.

الرقم 5
الرقم 5. الصور ممثل أسابيع 2 إضافة TEVG المنطوق. أ) H & E (التجويف الداخلي)، B) الوعول (الوردي = الإيلاستين)، ثلاثي الألوان C) Massion في (أزرق = الكولاجين)، D) CD31 (البني = الخلايا البطانية)، E) αSMA (البني = الخلية العضلات الملساء)، وجمعة ) F4/80 (البني = بلعم).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نموذج الفأر من TEVG هو أداة قيمة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue وتطوير تضيق. وقد أظهرت المصنف BM-MNC في كل من الصور النسيجية ووزارة شؤون المرأة من الخلايا المصنفة على الكسب غير المشروع 11. وقد أظهرت كفاءة البذر الخلية أيضا باستخدام فحص الحمض النووي 7. باستخدام هذا النظام النموذج الذي أظهر أن البذر الخلية يقلل من حدوث تطور TEVG تضيق، والتي كانت الوسيلة الأساسية للفشل في تجربة سريرية لدينا الإنسان 3. الخلايا المصنفة اختفى بسرعة من TEVG، مما يوحي بأنها تمارس تأثيرها من خلال آلية 8،12 نظير الصماوي. وقد تبين أيضا أن تشكيل neovessel هو عملية التجدد مناعية، والتي دعت neovessel من نشوب الخلايا الوعائية (EC وSMC) من جدار الوعاء الدموي المجاورة على طول السطح اللمعية من السقالة. علاوة على ذلك، تسلل بلعم العادي هو ضروري لتشكيل neotissue الأوعية الدموية،ولكن عندما هذه العملية هو المفرط يؤدي إلى تطوير TEVG تضيق 7،8. تظهر هذه النتائج مدى أهمية هذا النموذج الماوس إلى الأمراض التي تصيب البشر. التقنيات المجهرية يمكن تكييفها لتطبيقات الأوعية الدموية الأخرى بما في ذلك ترقيع الشرايين 13 والشريان الوريدي إلى ناسور.

نعمل أكثر من 1،000 IVC مداخلة زرع الكسب غير المشروع كل عام ومعدل وفيات أقل من 1٪. الكسب غير المشروع لزرع ناجحة، وهناك العديد من النقاط الهامة لذكرها.

الأولى، ويفضل التخدير عن طريق الحقن لهذه العملية لأنه من الضروري لتحويل الماوس حول عدة مرات خلال مفاغرة. تأثير التخدير يستمر عادة حوالي ساعة ووقت الجراحة بأكمله للجراح الصغيرة المهرة حوالي 30-45 دقيقة، والتي توفر ما يكفي من الوقت لاستكمال الجراحة. إذا كان الحيوان يستيقظ أثناء الجراحة، 0.05-0.1 مل من كوكتيل التخدير يمكن حقن intramuscularly.

الثانية، ومعظم فروع الأبهر الصغيرة تحتاج إلى ligated لمنع فقدان الدم الزائد في حين فصل IVC والشريان الأورطي من منطقة البطن. كما نضع في اعتبارنا أن لا تجرح IVC عندما يتم فصلها من الشريان الأورطي.

الثالث، عندما تم خياطة الكسب غير المشروع، وأول اثنين من الغرز على كلا الجانبين هي أهم الخطوات في العملية كلها. عندما لا يتم وضعها بعناية، فإنه من الصعب فصل طبقات الأمامي والخلفي من IVC. إذا لم يتم التعرف على طبقات بوضوح، هناك فرصة أكبر لخياطة بطريق الخطأ معا. بينما خياطة IVC إلى الكسب غير المشروع، فمن المهم أن لا تمتد أكثر من IVC، الذي يمكن أن يسبب تمزق. أيضا التأكد من عدم قطع الكثير IVC لتحل محل نفس طول الكسب غير المشروع. عادة ما تمت إزالة ما يقرب من 1-2 ملم من IVC ليحل محل 3 إلى 5 ملم الكسب غير المشروع بسبب التوتر الطولي للIVC. إذا تمت إزالة نفس طول IVC، فإنه يجعل anastoMOSIS صعبة للغاية.

الرابعة، وهناك سلالة كبيرة ترهق الاختلافات فيما يتعلق بتشكيل TEVG والتنمية تضيق. على سبيل المثال، أظهرت غير المصنف C57BL / 6 الفئران (النوع البري) وهو معدل أعلى بكثير من تضيق من SCID / BG الفئران (الفئران العوز المناعي) 8،12. بالإضافة إلى ذلك، من تجربتنا، SCID / الفئران BG هي أسهل بكثير للعمل بالمقارنة مع C57BL / 6 الفئران، نظرا لصلابة جدار IVC 14. أن تبقي في الاعتبار عندما تعمل على سلالة جديدة من الفئران.

تصنيع الكسب غير المشروع والحصاد BM-MNC، وعمليات البذر الخلية هي على التوالي إلى الأمام، لا يوجد سوى اثنين من العمليات أن ندرك. أولا، لتصنيع الكسب غير المشروع، فمن المهم جدا عدم "حفنة" من شعر حين دفعها باستخدام إبرة حادة G 18. لقد حاولت وسائل مختلفة لدفع اللباد وصولا الى نهاية البعيدة للنصائح الماصة. دفع الكسب غير المشروع مع إبرة حادة أظهرت نتائج أفضل، حتى الآن. والداخليةقطر إبرة حادة هي أكبر قليلا من القطر الخارجي للإبرة أن يتم التفاف شعر حولها. وبالتالي، لا يمكن للإبرة أصغر الشريحة بشكل مريح في إبرة حادة أكبر ويمكن بعد ذلك أن دفعت شعر أسفل مع كميات متساوية من القوة في جميع أنحاء محيط شعر، والذي يمنع bunching للشعر. لاحظنا سابقا أن الطعوم تتزاحم أظهرت انخفاض المباح في 2 أسابيع. أيضا، من المهم جدا لإزالة جميع فقاعات بسبب الفقاعات التي سوف تسبب سوف ثقوب على سطح السقالة والدم يتسرب من خلال ثقب بعد الزرع. الثانية، عندما يتم فصل العظام للحصاد BM-MNC، تأكد لتنظيف العظام قدر الإمكان بحيث لا تشمل الكثير من العضلات أو الشعر. إذا لزم الأمر، فمن المستحسن استخدام مصفاة الأنسجة قبل عملية الطرد المركزي الكثافة.

هذا النموذج من TEVG عملت بشكل جيد على الدورة الدموية الوريدية، وهو الضغط المنخفض ونظام تدفق عالية. ومع ذلك، في الدورة الدموية في الشرايين، وارتفاع الضغط ونظام تدفق عالية، لاحظنا ارتفاع معدلات تمزق مع ترقيع PGA بسبب تدهور سريع مميزة لها. مما يعني أن الكسب غير المشروع يفقد قوة الهيكلية قبل يكسب neotissue ما يكفي من القوة لمقاومة الضغط الشرياني. وقد استخدمنا عديد حمض اللبنيك (جيش التحرير الشعبى الصينى) ترقيع سابقا، ولكن أظهرت ارتفاع معدل انتشار تشكيل تمدد الأوعية الدموية. كما أنه يحتاج إلى أكثر من 2 سنة لتتحلل تماما جيش التحرير الشعبى الصينى في الجسم الحي، والتي هي أكثر من العمر الافتراضي للالفئران. لتطبيق تقنيات المستقبل في الدورة الدموية في الشرايين تصنيع الكسب غير المشروع، على سبيل المثال، الكسب غير المشروع electrospun هو حاليا قيد التطوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء منها عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (RO1 HL098228) لCKB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt Biomedical Structures Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl  Fisher Sientific 02-707-456
Lyophilizer  Labconco 7070020
RPMI medium 1604 Gibco 11875-093
Petri dish BD 353003
24-well plate Corning 3526
15 cc tube  BD 352096
Ficoll Sigma 10831-100ml Also called 'Histopaque'
DPBS Gibco 14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight Roboz RS-8480 For BM harvesting
Forceps 4.5" Roboz RS-8120 For BM harvesting
Scissors 4.5" Roboz RS-5912 For BM harvesting
Microscope Leica M80
C57BL/6J (H-2b), Female Jackson Laboratories 664 8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution Akorn Inc. NADA# 139-236
Ketoprofen Fort Dodge Animal Health NDC 0856-4396-01
Ibuprofen PrecisionDose NDC 68094-494-59
Heparin sodium Sagent Pharmaceticals NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) Hospira Inc. NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection Hospira Inc. NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products NDC 17033-211-38
Iodine prep pads Triad Disposables, Inc. NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads McKesson Corp. NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators Fisher Scientific 23-400-118
Fine scissor FST 14028-10
Micro-adson forcep FST 11018-12
Clamp applying forcep FST 00072-14
S&T Vascular clamp FST 00396-01
Spring scissors FST 15008-08
Colibri retractors FST 17000-04
Dumont #5 forcep FST 11251-20
Dumont #7 - fine forceps FST 11274-20
Dumont #5/45 forceps FST 11251-35
Tish needle holder/forceps Micrins MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0 AROSurgical Instruments Corporation TI638402 For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0 AROSurgical Instruments SN-1956 For musculature and skin closure
Non-woven sponges McKesson Corp. 94442000
Absorbable hemostat Ethicon 1961
1 ml Syringe BD 309659
3 ml Syringe BD 309657
10 ml Syringe BD 309604
18 G 1.5 in, Needle BD 305190
25 G 1 in, Needle BD 305125
30 G 1 in, Needle BD 305106
Warm water recirculator Gaymar TP-700
Warming pad Gaymar TP-22G
Trimmer Wahl 9854-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heart Association, A. merican Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
  2. Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
  3. Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
  4. Shin'oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
  5. Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
  6. Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
  7. Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
  8. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
  9. Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
  10. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
  11. Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
  12. Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
  13. Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
  14. Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics