행동 경험에 따라 뇌 샘플에서 전사 역학의 종합 분석

Behavior

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Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

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Abstract

뇌와 장기 기억의 통합 경험의 인코딩은 유전자 전사에 따라 달라집니다. 인코딩 환경에서 특정 유전자의 기능을 확인하는 것은 분자 신경의 주요 목적 중 하나이다. 또한, 고유의 동작으로 정의 유전자의 기능적 연관 신경 정신 질환의 기초를 이해하는 의미를 갖는다. 강력한 전사 프로그램의 유도는 다양한 행동 조작을 다음 쥐의 뇌에서 관찰되었다. 어떤 유전 요소가 다른 행동 다음 조작과 다른 뇌 핵에서 반복되는 사용되는 반면, 전사 프로그램은 전체적으로 자극 유도하고 그들이 1,2 연구되는 구조에 고유하다.

이 책에서, 프로토콜은 행동 조작에 대한 응답으로 쥐의 뇌 핵에서 강력하고 포괄적 인 전사 프로파일에 대해 설명한다.프로토콜은 급성 코카인 경험을 다음 중격 의지 핵에서 유전자 발현의 역학 분석의 맥락에서 설명된다. 생체 내 환경에서 정의 된 이후, 타겟 신경 조직은 해부; RNA를 정제 한 후, 다수의 표적 유전자의 광범위한 분석을 qPCR에 전사와 미세 유체 어레이의 이용을 역방향. 이 프로토콜은 이러한 작은 뇌 샘플 또는 하나의 세포로 종합적인 분석 출발 물질의 양을 제한하는 (50 ~ 500 유전자를 주소)에 맞도록한다.

프로토콜은 복수의 평행 한 샘플 분석 (예를 들어 단일 세포, 약학 다음 동적 분석, 바이러스 또는 행동 섭동)에 가장 유리하다. 그러나, 프로토콜은 또한 마이크로 어레이 또는 RNAseq하여 전체 게놈 연구에 앞서 샘플의 특성 및 품질 보증을 위해 제공뿐만 아니라, 전체 게놈 연구로부터 얻어진 데이터를 검증 할 수있다.

Introduction

뇌의 역동적 인 조직은인지 적, 행동 적 유연성을 제공합니다. 경험은 뇌 3 뉴런 간의 연결의 구조 및 강도의 변형을 통해 인코딩된다. 이러한 "경험에 의존하는 가소성"시냅스 구조와 강도 (4)의 수정을 위해 필요한 단백질을 제공하는 유전자 발현의 특정 패턴의 유도의 결과이다. 장기 기억의 형성을 매개 유전자 조절 네트워크의 식별은 전사 프로그램의 지배적 인 요소의 식별을위한 기억 형성뿐만 아니라, 타겟을 조절하는 근본적인 원리에 대한 통찰력을 제공 할 것으로 기대 분자 신경의 중앙 신조 신경 및 신경 정신 질환의 치료. 전사 프로그램 개발에 중요한 다른 캐릭터의 유전자를 인코딩하는 각각의 시간적 정의 파도 펼쳐시그널링 이벤트 1,2의 결과의 구현 ifferent 단계. 이 유도 된 유전자의 전체 보완을 식별하고, 그들의 유도의 역학에 따라 잠재적 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록, 자세한 시간 척도에 전사 역학을 해결하는 것이 중요하다.

마약 중독은 뇌 5,6의 신경 회로에 약물 남용의 긴 지속 효과에 의한 경험에 의존하는 가소성의 강력한 형태입니다. 약물에 초기, 급성 노출은 중독의 개발과 만성 사용으로의 전환으로 이어질 수 있습니다. 콘텍스트 정보는 중독의 개발에 중요한 요소이다. 의약품 관련 환경 단서 약물 남용자의 마음에 큰 중요성을 부여하고 있습니다. 약물 갈망에 재발을 유도 할 수있다 과거 마약 경험의 약물 남용을 상기 콘텐츠 정보도 약물 노출 7,8에서 금욕 오랜 기간을 다음과 같습니다.따라서 중독에서 좋은 임상 도전 - 금단 증상이 구를 가라 앉 후 중독자의 성향도 긴 재발합니다.

코카인에 행동 과민 반응은 약물 중독의 메커니즘의 연구에 유용 코카인 경험의 간단한 모델이다. 약물 남용에 만성 노출에 의해 유도 된 오래 지속되는 감작이 널리 연구 된 모델에서는 설치류는 첫째 식염수 주사 (복강; IP)에 순응하는 새로운 환경에서 (자신의 운동 활성을 모니터하는 오픈 필드 챔버) ; 자신의 활동이 10 (그림 1)를 모니터링하는 동안 다음, 그들은 열기 필드 챔버에서 코카인의 매일 주사를받을 수 있습니다. 행동이 패러다임은 일반적으로 변태의 형성을 보여주는, 코카인 주사 정지 다음 달의 기간 동안 유지된다 (8-12 배의 기준선 위의 활동) 전위 거동 (11)의 강력한 감작 초래마약 경험 asive 메모리 추적.

자연적으로 종의 성공 (예 : 공급, 성별)에 필수적인 행동을 강화에 관련된 보상의 신경 회로는, 약물 관련 행동 (12, 13)을 강화하는 약물 남용에 의해 이용된다. 남용 약물 경험이 향상되는 분자 및 세포 메커니즘은 다른 뇌 구조 (14) 또는 의미 선언적 기억의 형성을 기본 메커니즘과 유사한 것으로 보인다. 따라서, 행동 감작 모델의 견고성은 그것을 경험에 의존하는 가소성의 메커니즘을 연구하는 매력적인 모델 시스템을 만든다.

중격 의지 핵 (NAC)은 뇌의 보상 회로의 중앙 적분기이며, 광범위하게 5,6 중독의 발달과 관련이있다. 중독의 형성은 핵 중격 의지 소설 단백질의 전사에 의존하고있는 강력한명확하게 구조화 전사 프로그램 duction 코카인 경험 15-19 다음 NAC에서 관찰된다. 코카인 노출 급성 전사 응답이 강한 유도 자극에 적응하는 새로운 단백질의 생산을 유도하기 위하여 여러 레벨에서 기능 할 가능성이 6,19-22 약물에 대한 노출에 의해 유도 된 구조적 변화 및 전기 생리 책임이있다.

뇌에서의 경험에 의존하는 가소성의 분자 메커니즘의 연구를 촉진하기 위해, 프로토콜은 다음의 행동 조작 뇌 조직 샘플에 전사 역학의 포괄적 인 분석에 대한 설명한다. 전사 분석을 위해 마이크로 유체 동적 배열을 이용하여, 코카인으로 행동 감작 - 프로토콜 Citri 실험실 연구 행동 경험의 맥락에서 설명된다. 설명 된 프로토콜은 분명히 t 공부에 한정되지 않는다그 행동 감작의 컨텍스트에서 중격 의지 핵을하지만 행동 패러다임 및 뇌 영역의 다수의 적용 할 수있다. 실제로,이 프로토콜은 뇌 밖의 신체 조직에 적용 할 수 있고, 경험 또는 유기체의 조작의 다양한 연구.

이 프로토콜은 크게 네 단계로 구분된다. 첫 번째 단계에서, 동물은 행동 패러다임을 받는다; 두번째 단계에서 조직 microdissected이고; 세번째 단계에서 -는 mRNA를 정제하고 역전사-프로빙, 최종 단계에서 데이터를 분석한다.

전사 역학 연구의 맥락에서, 경험의 정밀한 타이밍 및 정의를 제어하는​​ 가장 중요한 파라미터는 아마도 실험이다. 이러한 이유로, 우리가 선택한 행동 모델은 코카인으로 행동 감작, experien의 파라미터를 통해 제어 실험자의 높은 수준을 가능하게하는 시스템이다CE. 경험에 의존 소성 또는 기억 형성의 서로 다른 모델을 정확한 타이밍을 활성화하고 해결 추가 행동 패러다임을 사용할 수 있습니다. 이러한 모델은 두려움 컨디셔닝 (23), 미세 환경 농축 24, 25, 새로운 객체 탐사 (26)과 어두운 양육 27 다음 시각적 경험을 포함한다. 그러나 코카인에 행동 감작은 지속적으로 강력한 행동 조작 코카인 경험 (28) 다음 개월 동안 지속 매우 널리 보급 메모리 추적을 생성합니다.

뇌는 핵 중격 의지를 수동으로 미세 절제 한 후, 절단된다. 그것은 빠르게 준비 뇌 조각에서 수동 미세 절제가 행동 패러다임에 관련된 조직을 추출하는 가장 안전하고 빠른 방법을 제공하는 것이 우리의 경험이었고, 경험, 조직의 경계가 인식 쉽게 분명하게합니다. 또한, 미세 조각 위해 준비 될 수있다레이저 캡처 미세 절제 다음 에디션. 이 방법은 높은 관심 영역의 묘사를 정의 가능하게 있지만, (따라서 불안정한의 mRNA를 유실) 지루한 느리고 비용이 많이 드는 전용 장비 (레이저 캡처 설치가 장착 된 현미경)가 필요합니다. 본원에서 정의 된 프로토콜은 또한 패치 피펫 (29)를 사용하여 시각적으로 식별 된 세포의 세포질 수동 흡인에 의해, 단일 셀 전사 분석에 적용 할 수있다. 그것은 대부분의 경우, 조직 내 세포의 하위 집단 만이 실제로 경험에 대한 응답에 포함되어있을 가능성이 높은, 기재된 프로토콜 인구 평균을 제공한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 그것은 경험에 응답 특정 세포 집단 내에서 선택적 방식으로 전사를 프로파일 관심이지만, 이러한 방식의 논의는 현재의 범위를 벗어납니다.

mRNA의 정화를 들어, 역 전사 및 qPCR에의 질의, 조직을시중에서 판매하는 키트의 활용 다음 미세 바늘을 통해 전달하여 중단됩니다 (자세한 내용은 표 8 참조). 선택은 높은 품질의 RNA 및 다운 스트림 응용 프로그램에서 강력한 결과의 신뢰성 추출을 위해 이러한 방법론, 경험에 의해 통보된다.

프로토콜이 동적 배열을 이용하는 높은 처리량 qPCR에 대해 설명되지만, 샘플 종점 PCR 낮은 처리량 qPCR에, 유전자 발현 마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱을 이용하여 유전자 발현을위한 프로브 할 수있다. 높은 처리량 qPCR의 동적 배열을 이용하기위한 기본의 mRNA는이 행동 패러다임을 다음은 종종 제한적인 양의 인 뇌 핵으로부터 수득된다는 사실에 기인한다. 동적 배열 한 번의 실험에서 병렬 샘플로부터 다수의 효율적인 종합 성적 분석을 가능하게하는 플랫폼을 제공한다. 마이크로 유체 시스템의 초기 획득 (통상적 기관 PU 후에rchase) 실험을 실행하는 데 상대적으로 저렴하다. 이 분석에 따라, 샘플의 추가 쿼리는 동적 배열은 품질 보증을위한 포괄적 인 참조를 제공과 함께 (마이크로 어레이 또는 RNAseq에 의해) 새로운 성적표를 검색하기 위해 더 많은 비용이 많이 드는 플랫폼을 사용하여 수행 할 수있다. 마지막으로, 데이터 분석을위한 표준 방법이 이용된다. 발생할 수있는 문제점에 대해 특정 포인터 프로토콜의 텍스트 설명 될 것이다.

이 프로토콜은 여러 조건과 반복 실험을 공부하고 관심을 자신의 시스템의 철저한 조사에 관심이있는 연구자를위한 가장 적합합니다. 이 프로토콜은 이미 그들이 반복 쿼리에 관심이 관심의 50 ~ 500 유전자의 부분 집합에 (마이크로 어레이 또는 RNAseq 실험을 통해)에서 연마 한 연구자에 가장 적합합니다.

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Protocol

참고 :이 프로토콜은 예루살렘의 히브리 대학의 동물 관리 지침을 따른다.

ACSF 솔루션의 1 준비

  1. 물 또는 염화나트륨의 적절한 첨가 ~ 300 mOsm / L에 삼투압을 가져, 표 1에 설명 된대로. ACSF 솔루션을 준비 DDH 2 O 1 L (> 18 MΩ 순도)를 확인합니다.

2 장비와 룸 설정

코카인 - 유도 된 운동 동작의 모니터링 장치는 내부 광원, 팬과 카메라 (또는 적외선 센서)와 유선 행동 챔버 (50 X 45cm)로 구성하고, 내측 스펙스 상자 (30 × 30 ㎝)에 장착 어떤 쥐들은 운동을 모니터하는 동안 자유롭게 이동할 수있다. 행동 테스트는 일반 명 / 암주기, 조명 전에 1 시간에 불이 들어오고 나서 1 시간 사이에 떨어져 수행해야합니다. 동물은 매일 같은 시간에 지속적으로 훈련되어야한다.

  1. 후각 큐 편향을 방지하기 위해 적절한 소독을 보장하기 위해, 마우스 기능 및 / 또는 냄새를 제거하는 시약에 의해 제공되는 살균제로 각 시험 후 챔버를 청소.

중요 : 처리하는 동안 마우스는 조용 조용하고주의해야합니다.

3 동물 준비

  1. 하우스 5 C57BL6 수컷 마우스, 표준 및 지역 동물의 요구 사항에 따라 12 시간 명 / 암주기 및 음식과 물을 무료로 이용할 수있는 방에서 케이지 당 (6~12주 된 무게 ~ 25-35g), 위원회의 지침과 프로토콜을 케어. 실험을 시작하기 전에, 쥐의 무게 데이터를 기록. 코카인은 이후 마우스의 체중에 따라 투여된다.
  2. 첫 번째 시험을 시작하기 전에 행동 방 30 분에 쥐를 포함하는 모든 새장을 전송합니다.
  3. 모든 길들실험에 사용 된 마우스는 주사를 처리 및 동작 설정에서 모니터링을 실험한다. 아래에 설명 된대로이 250 ㎕의 생리 식염수의 3 연속 매일 복강 주사에 의해 달성된다.
  4. 250 ㎕의 생리 식염수를 복강 내 주사를 관리. 즉시 주사에 이어 15 분 동안 운동 활성을 모니터링하는 동작 챔버에서 마우스를 배치했다. 매일 같은 시간에, 3 일 연속이 작업을 반복합니다.
  5. 넷째 날에, 두 그룹으로 나누어 쥐. 식염수에 2 ㎎ / ㎖에서 코카인의 재고 솔루션을 준비합니다. (- 30g의 마우스를 300 μl를받을 수있는 반면, 250 μl를 주입 25g 마우스에 대한 예) 마우스의 무게에 따라 실험 그룹에 코카인 용액 (최종 20 ㎎ / ㎏)의 단일 주사를 관리. 대조군에는 생리 식염수를 투여. 즉시 주사를 따라 운동 활성을 모니터링 (typic위한 행동 챔버에서 20 분 동안 마우스를 배치동맹, 처음 15 분) 모니터링됩니다.
  6. 코카인 주입 후, 상이한 시점 (분사 다음 0, 1, 2, 4, 8 및 24 시간)에 마우스를 희생. 중요한 것은, 참조 마우스 (0 시점)이이 일에 어떤 주사를받을 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 중요성으로 인해, 그것은 참조 그룹의 복제물을 포함하는 것이 필수적이다.

핵 중격 의지의 4 해부

  1. 코카인 / 식염수 주입 후 적절한 시간에 이소 플루 란과 함께 쥐를 마취. 이소 플루 란 직접 방에서 배출해야합니다. 그러므로, 절차는 화학 퓸 후드에서 수행되어야한다.
  2. 후면 발 반사를 테스트하여 마취의 깊이를 모니터링합니다. 동물에 의한 금단 반응을 유도하기 위해 발을 꼬집어. 반사를 보여줍니다 동물은 마취의 수술 수준이 아닌 상태가 안락사에 없습니다.
  3. 뇌의 추출 :
    1. 잘린 마우스를 안락사.
    2. <리>는 두개골의 중심 위의 피부를 제거하고 날카로운 가위로 두개골을 잘라.
    3. 척수는 뇌 (난원 매그넘)를 입력하는 시점에서 가위를 삽입하고 두 측면 인하를합니다.
    4. 같은 지점에서 시상 봉합을 따라 긴 시상을 잘라주십시오. 왼쪽과 오른쪽에 후각 망울, 클립에 도달시.
    5. 집게로,에 누르거나 뇌 손상되지 않도록주의하면서 단단히 두개골의 각 반을 잡고 옆으로 당겨 조심스럽게 두개골을 제거합니다.
    6. 거꾸로 마이크로 스푼 주걱을 사용하여 두개골 신경을 절단하는 동안 뇌를 제거합니다.
  4. 진정 및 강화 1-2 분 동안 얼음처럼 차가운 ACSF 솔루션에 뇌를 놓습니다.
  5. 주동이의 부분이 vibratome 무대에, 위를 향하도록, ACSF에서 뇌를 제거 종이 타월로 여분의 액체를 심지, 소뇌 및 뇌의 나머지 부분 사이에 관상 컷을 생성하고 뇌를 붙입니다.
  6. NAC를 절단 : vibratome의 슬라이스 챔버에서 얼음처럼 차가운 온도에서 ACSF 솔루션을 유지한다. 핵 중격 의지 (NAC)까지 200 μm의 섹션에 명확하게 Paxinos 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 (브레 그마 약 1.8 mm 전방에 따라 식별, 뇌량, 전방 접합면의 위치와 모양의 모양에주의를 기울이고 심실뿐만 아니라 뇌 구역의 전체적인 형태). 이 시점에서, NAC 해부 될로부터이 400 μm의 부분을 생성한다.
  7. 입체경에서 조각에서 NAC 영역을 해부 좋은 블레이드를 사용합니다. NAC의 정의는 Paxinos 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스에 따라, 그리고 편리 조직에 블레이드의 네 빠른 패스에 의해 해당 섹션에 해부 할 수있다. (그림 2).
  8. 즉시 NAC 섹션 microcentrifuge 관 및 저장소에 900 ㎕의 트리 졸 용해 시약에서 -80 ° C에서 RNA의 extr까지 배치액션.

5 RNA 추출 및 cDNA를 역전사

  1. 핵을 함유하는 튜브를 실온에서 TRIZOL 용해 시약에 섹션 중격 의지 해동 및 조직이 완전히 균질 (적어도 15-20 배) 될 때까지 25 G 바늘에 연결된 1 ㎖의 주사기와 파쇄물을 균질화. 처음 몇 라운드 어렵고, 바늘의 선단을 입력 할 수있는 작은 조각으로 분해하기 위해서는 관의 벽에 조직을 밀어 요구한다.
  2. 균질화을 보장하기 위해 1 분 동안 12,000 XG에 QIAshredder 미니 스핀 열 원심 분리기에 용해 액을 피펫.
  3. 피펫은 새로운 microcentrifuge 관에 해물과는 제조업체의 지시에 따라 RNA를 추출합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 RNA를 저장합니다.
  4. , RNA 농도를 측정 Bioanalyzer 또는 이와 동등한 장비를 사용하여 무결성과 품질을 분석 할 수 있습니다. 연구와 cDNA를 준비의 각 라운드에 대한 100 ~ 500 NG의 RNA를 사용하여andom의 헥사 프라이머.

6 프라이머 설계 및 프라이머 테스트

  1. 좋은 프라이머를 선택 : mRNA의 성적 증명서의 qPCR에 대한 최적의 프라이머 쌍의 경우, 이러한 요구 사항 (그림 3) 수행
    1. 17-28 기지보다 더 이상 포함 된 디자인 프라이머. 그들은 mispriming을 촉진으로 염기 반복을 피하십시오.
    2. 56-68 ° C (최적 60 ~ 64 ° C에서) 사이의 용융 온도 (T의 m)와 디자인 프라이머. 프라이머 쌍 내의 T의 m은 서로 1 ° C 이내 일 것.
    3. 제품의 크기가 이상적으로 80 150bp 사이 여야합니다주의하십시오.
    4. 게놈 DNA의 오염 물질의 증폭을 방지하기 위해, 프라이머 중 적어도 하나는 엑손 - 엑​​손 접합부를 커버 또는 앰플 리콘은 (인트론 스패닝) 큰 인트론이 포함되어 있는지 확인.
    5. 프라이머 디자인을 개선하기 위해 (예를 표 2를 참조)에 기초 Primer3 신뢰할 수있는 소프트웨어를 사용한다.
  2. 홍보 테스트imers는 : 프라이머의 특이성 및 효율을 보장하기 위해, 제어 qPCR의 반응을 수행해야
    1. (모든 관련 프라이머 쌍에 대한 cDNA를 템플릿을 포함) 양의 시료를 사용하여 cDNA를 적정한다 (예 : 10 NG ~의 초기 농도에서 팔 3 배 희석) 중복 평행하게 반응한다. 반응에 사용되는 솔루션 내의 오염 제어하는​​ 노 템플릿 컨트롤을 포함합니다.
    2. (- 1 / 기울기) -1 10 () × 100, 최적의 기울기의 곡선은입니다 - 3.333 (예 : 10 (- 1 / 3.333) = 2) (그림 4) : 수식을 사용하여 프라이머 효율을 계산합니다.
    3. 증폭의 특이성을 결정합니다. 특정 증폭 반면 오프 대상 증폭 명백한 편차 FR과 같이 나타납니다, 증폭 된 모든 제품의 용융 곡선에 공통으로 하나의 눈에 띄는 피크에 의해 입증된다하나의 큰 피크 옴.

7 qPCR의 분석

  1. 사전 증폭 :
    1. 종합 qPCR을 분석 프라이머 쌍 다수로 RNA의 양을 제한 병렬 질의에 기초한다. 따라서, 사전 증폭 단계는 필수적이다. 이 단계에서, cDNA를 (800 프라이머 쌍까지) 미래 샘플 질의에 이용 될 모든 프라이머의 혼합물을 미리 14 ~ 18 사이클의 증폭을 겪는다.
    2. 특정 표적 증폭 (STA) 50 μM에 TE (낮은 EDTA)의 모든 프라이머를 희석.
    3. 풀 함께 50 μM 프라이머 모두 1 μL 분취 800 분석법까지 STA 반응에 포함되는 것으로 설정한다.
    4. 표 3에 기재된 바와 같이. STA위한 사전 혼합하고 샘플을 준비 할 필요가 증폭 될 샘플의 수가 110 %를 혼합하여 제조함으로써 오류 허용한다.
    5. 각 샘플에 대한 나누어지는 3.75 μL의 STA 미리 혼합. 1.25 μl를 추가각각의 cDNA.
    6. 소용돌이는 10 초 동안 반응과 원심 분리기를 혼합합니다.
    7. 표 4에 나타낸 바와 같이 열 자전거 타는 사이클에서 STA 반응을 놓습니다.
  2. 엑소 뉴 클레아 제 I (ExoI) 처리 :
    1. 표 5에 나타낸 바와 같이, 엑소 I 희석.
    2. 각 5 μL의 STA 반응을 희석 ExoI (4 U / μL)의 2 μl를 추가, 소용돌이, 37 열 순환기 (6000 XG>)의 회전 속도 및 장소 ° C에서 30 분 동안 다음 15 분 동안 80 ° C에서.
    3. 테스트에 대한 적절한 농도로 희석하여 최종 제품. 사용 TE 버퍼 (7 μL의 TSA 샘플 43 ㎕의 TE 버퍼를 추가).
    4. -20 ° C에서 희석 된 STA 제품을 보관하거나 즉시 사용합니다.
  3. qPCR에 대한 프라이머 및 샘플 설정 :
    1. 표 6과 같이. 샘플을 준비 실험을 위해 선택된 칩에 따라 믹스를 준비하고 필요한 샘플을 추가합니다.
    2. 서울 = 연합 뉴스20 초간의 최소 샘플 믹스 솔루션 테이트 및 원심 분리기 (> 6000 XG) 적어도 30 초. 칩이 로딩을위한 준비가 될 때까지 준비된 반응은 4 ° C에서 짧은 기간 저장할 수 있습니다.
    3. 표 7에 설명 된대로 분석을 준비합니다.
    4. 모든 구성 요소를 스핀 다운 적어도 30 초 동안 20 초 원심 분리 (> 6000 XG)의 최소 분석 믹스를 선동.
      중요 : 철저하게 소용돌이와 원심 분리기 칩 입구에 피펫 팅하기 전에 모든 샘플 및 분석 솔루션은. 이렇게하지 ​​않으면 데이터 품질 저하의 원인이 될 수 있습니다.
      NOTE : 각 프라이머의 최종 농도는 5 μM의 입구 및 최종 반응 500 ㎚이다.
  4. 프라이밍 및 동적 배열 IFC (통합 유체 회로) 칩을 넣기. IFC 칩 (Figu을 미세 유체 챔버를 가압하는 데 사용되는 제어 선 오일 (광물유)에 대한 분석을위한 샘플 유입구뿐만 아니라 지정된 유입구 (축전지)를 가지고) 4A 재.
    1. 칩의 각 어큐뮬레이터로 제어 선 유체를 주입한다.
    2. 분리 칩의 하부로부터 푸른 보호막 버린다.
    3. 적절한 IFC 컨트롤러에 칩을 놓습니다 (컨트롤러 MX 48.48 동적 배열 IFC 또는 96.96 동적 배열 IFC에 대한 IFC 컨트롤러 HX 용), 다음 48.48 동적 배열 IFC 또는 국무 (136x)에 대한 총리 (113x) 스크립트를 실행 주요 칩하기 위해 96.96 동적 배열 IFC를위한 스크립트.
    4. 스크립트가 완료되면, IFC 컨트롤러에서 끝났다 칩을 제거합니다.
    5. 피펫 각 분석 믹스 5 ㎕를 자신의 입구에 각 샘플 믹스의 5 μL.
    6. IFC 컨트롤러 칩을 돌려줍니다.
    7. IFC 컨트롤러 소프트웨어를 사용하여 48.48 동적 배열 IFC에 대한 부하 믹스 (113x) 스크립트를 실행) 또는 96.96 동적 배열 IFC가 칩에 샘플 및 분석을로드하는 믹스 (136x) 스크립트를로드합니다. 부하 믹스 스크립트가 완료되면, 하중을 제거IFC 컨트롤러에서 에드 칩.
    8. 융해 곡선 분석을 포함하여, (제조업체의 지침에 따라) 새로운 칩의 실행을 작성, 열 자전거 타는 사람에 칩을 넣습니다. 서열 증폭기 소프트웨어를 사용하여, 반응 챔버가 올바르게 인식되었는지 확인하고, 반응이 완료 될 때까지 실행하도록 허용한다.

제 데이터 분석

  1. 품질 보증 : 데이터 품질을 보장​​하기 (전술 한 바와 같이) 희석 곡선을 해결함으로써 프라이머의 품질을 확인하기 위해. 증폭 산물의 융해 곡선을 보면 증폭의 특이성을 모니터의 최적 피크 (29)를 긴밀하게 정렬되어야한다.
  2. 시각화 : 높은 처리량 qPCR에 의해 얻어진 대량의 데이터의 시각화를 들어, 사용하는 소프트웨어는 어떤 식 색으로 구분 강도입니다, 히트 맵을 생성합니다. 또한, 줄 지어 산포도와 같은 단일 유전자의 전사 역 동성을 표시합니다.
  3. 출판 : 출판유전자 발현 결과, 그것은과의 관련성, 정확성, 올바른 해석과 재현성을 보장하기 위해 qPCR에 실험에 대해보고해야하는 최소한의 정보를 상세하게 정량적 실시간 PCR 실험의 게시를 위해 MIQE 지침을 따르도록 권장합니다.

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Representative Results

이 프로토콜을 적용하여 얻어진 결과의 결정적 품질은 다수의 파라미터에 의존한다. 적절한 실험 계획 실험 쥐에 최소한의 외란이 발생할 것 같은 테스트 경험 (이 예제는 코카인에 노출의)는 자신의 최근 역사에서 가장 지배적 인 경험이 될 것입니다, 따라서 강력하고 특정 전사 될 것 프로그램.도 1은 핵 쥐 해부 및 분석 중격 의지되는 코카인 경험 다음 시점을 정의하고, 코카인에 대한 행동 감작 실험 계획을 설명한다. 다음 중요한 점은 분석을위한 적절한 조직 절제에 대해 정확한 경계를 정의하는 것이다. 2 관상 및 시상 섹션에서 중격 의지 핵의 경계를 설명도. NAC 조직의 얇은 여백 영역 탁에서 제외되어 바람직 절개는 수행되어야프로파일 링 갖추고 있습니다. 이것은 일관된 NAC 프로파일, 환원 변동과 주변 조직의 포함으로 인한 아티팩트에 대한 가능성을 보장한다.

작은 뇌 핵의 해부와 같이 RNA의 양을 제한 증폭하면, 증폭 많은주기 신호의 적절한 검출이 필요하다. 따라서 출발 물질의 소량 작업을 할 때 더욱 증폭 정량적 PCR 실험에서 중요한 점은, 증폭에 사용되는 프라이머의 특성이다. 3 최적의 프라이머를 정의하는 주요 기능을 설명하고, 그림 4는 프라이머의 증폭 곡선이 연출을 보여줍니다 그림 C-에 Fos 및 FOSB에 대해,이 프라이머 쌍은 매 사이클마다 ~ 100 % 효율로 자신의 목표 성적을 보여 증폭있다. 프라이머 검증 및 적절한 실험 패러다임의 설립에 이어 대상, 담배 마는 종이에서 전사의 명확한 평가를 가능하게UE, 종합 분석 (; 그림 5 96.96 형식) 9216 병렬 qPCR에 반응까지 가능 플루 바이오 마크 플랫폼에서 수행 할 수 있습니다. 이러한 높은 처리 플랫폼은 하나의 칩 상에 동일한 실험 조건을 이용하여, 여러 번 반복 실험의 병렬 분석을 가능하게한다. C-에 Fos 및 FOSB 급성 코카인 경험을 다음의 전사 유도를 해결 배 반복 실험의 데이터는 그림 6에서 설명하고 있습니다.

그림 1
코카인의 경험을 다음과 같은 동적 전사 분석을 위해 그림 1 실험 패러다임. (A) 실험 프로토콜 - 음향 감쇠 동작 실에 비디오 추적하여 전위의 활동을 모니터링하면서 마우스, 삼일에 대한 처리 및 사출에 길들여있다. 마우스코카인 경험을 다음 될 수 있습니다; 회 노출 = 급성 코카인 경험; 5 연속 주사는 만성 노출라고합니다. 코카인 절제 ≥16 일을 다음과 같은 단일 주입 코카인 도전이라고한다. 식염수를 주입 후 3 일 또는 식염수 + 3 일 다음 행동 챔버 내의 마우스 트랙의 전사 동역학 코카인 경력 (1, 2, 4, 8, 24 시간) 다음 다른 실험 시점에서 다루어진다. (B) 플롯 하나의 급성 코카인 노출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림이
마우스의 뇌에서 핵 중격 의지의 2 위치를 그림. 두꺼운 흰색 라인 B를 정의하는 컷 위치를 표시 . (B) 시상 부; NAC (A)의 관상 부 oundaries. (사진은 앨런 뇌 아틀라스 참조 아틀라스에서 적응 이미지 :. HTTP : //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 , HTTP : //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100883869 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
3 계획 qPCR에 프라이머를줍니다. 특이성, 안정성 및 호환성에 대한 정의와 함께, qPCR에 프라이머 계획을위한 지침. 2fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
프라이머 효율성의 그림 4 평가. 플루 IFC 배열을 FOS를하고 FOSB의 증폭 곡선 (A) 결과. 표준 곡선은 마우스 NAC에서 추출에 Fos 및 FOSB의 발현을 위해 프로빙 전체 RNA의 일곱 직렬 3 배 희석액을 사용하여 생성 하였다. (B)에 Fos 및 FOSB 용 프라이머 쌍의 효율 (사이클 임계 값을 플롯함으로써 평가 하였다 시료의 배 희석액의 대수에 대하여 각 희석 CT). 본문에 정의 된 프라이머의 효율은 표준 곡선의 기울기로부터 계산된다. 희석 곡선의 증폭 곡선과 포인트 컬러 매칭이다.51642 / 51642fig4highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
플루 플랫폼을 적용 그림 5 종합 qPCR에 프로파일 링. (A) 실시간 정량 PCR을위한 96.96 동적 배열 IFC. 프라이머는 우측에 위치한 입구에서 적재되고, 샘플은 칩의 왼쪽에 위치한 유입구에로드된다. 이 수치는 플루 실시간 PCR 분석 사용 설명서의 허가가 수정되었습니다. 아니라 칩의 각에 대한 코네티컷 값을 나타내는 qPCR에 결과 (B) 열지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 급성 코카인 노출 다음 식 역학의 6 샘플 결과. C-에 Fos 및 FOSB의 코카인에 의한 표현은 시간의 함수로 표시됩니다. 여기에 정의 된 프로토콜에 따라 수행 쿼드 러플 실험 반복의 평균은 평균의 표준 오차를 묘사 오​​차 막대와 함께 표시됩니다.

시약 MW mM의 g / L
염화나트륨 (시그마 - 알드리치, 71376) 58.44 119 6.95
탄산 수소 나트륨 (시그마 - 알드리치, S6014) 84.01 26 2.18
포도당 (시그마 - 알드리치, G8270) 180.16 10 1.8
의 KCl (시그마 - 알드리치, P9541) D> 74.55 2.5 0.186
의 NaH 2 PO 4 (시그마 - 알드리치, S9638) 137.99 1 0.138
황산 ⋅7H이 O (시그마 - 알드리치, M1880) 246.5 4 0.99
염화칼슘이 (시그마 - 알드리치, C3011) 147 4 0.59

표 1 ACSF 솔루션입니다.

프로그램 이름 응용 프로그램 웹 위치
로슈 Probefin​​der 프라이머 디자인 http://qpcr.probefin​​der.com/organism.jsp
NCBI의 뇌관 폭발 프라이머 디자인 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tool​​s/primer-blast/
ve_content "> 표 2 소프트웨어 목록.

시약 볼륨 / 반응 (μL) + 10 % 없더군요 48 반응 (μL)을위한 양 + 10 % 없더군요 96 반응 (μL)을위한 양
배 TaqMan을 프리 앰프 마스터 믹스 (응용 바이오 시스템) 2.5 132 264
500 nm의 (10 배) 풀 프라이머 혼합물 1 52.8 105.6
0.25 13.2 26.4
cDNA를 1.25
총 양 5

표 3 STA 반응 솔루션입니다.

조건 홀드 10 ~ 14 회 홀드
온도 95 ºC 95 ºC 60 ºC 4 ºC
시간 10 분 15 초 4 분

표 사전 증폭을위한 4 열 사이클 조건.

구성 요소 5 μL 샘플 당 (μL) 1 시간당 48 샘플 (μL) 1 시간당 96 샘플 (μL)
1.4 84 168
엑소 뉴 클레아 제 I 반응 버퍼 0.2 12 24
20 대에서 엑소 뉴 클레아 제 I / μL 0.4 24 48 </ TD>
총 양 2.0 120 240

표 5 ExoI 반응 솔루션입니다.

</ TR>
샘플 MIX 입구 당 구성 요소의 양 (μL) 1 시간당와 입구 별 거래량 (μL) 48.48 동적 배열 IFC (μL)를위한 대량 (120 샘플) 96.96 동적 배열 IFC (μL)를위한 대량 (120 샘플)
배 SsoFast 낮은 ROX와 EvaGreen Supermix (바이오 - 래드 (Bio-Rad), 5211 PN 172-) 2.5 3 180 360
20X DNA 바인딩 염료 샘플로드 시약 (플루, 3738 PN 100 -) 녹색 모자 0.25 0.3 18 36
STA와 ExoI 처리 샘플 2.25 2.7
전체 5 6

표 6 샘플 사전 믹스 솔루션입니다.

표 7 분석 믹스 솔루션입니다.

구성 요소 입구 별 거래량 (μL) 1 시간당와 입구 별 거래량 (μL) 48.48 동적 배열 IFC (μL)을위한 양 96.96 동적 배열 IFC (μL)을위한 양
2X 분석로드 시약 2.5 3 180 360
1X DNA 서스펜션 버퍼 (TE 낮은 EDTA) 2.4 144 288
50 μM 각 혼합 순방향 및 역방향 프라이머 0.5 0.6
총 양 5 6
시약 / 재료의 이름 회사 카탈로그 번호
Virusol Oriek 의료 J29D
이소 플루 란, USP 100 % MINRAD INC NDC 60307-110-25
분리하고, RNeasy 플러스 유니버설 미니 키트 QIAGENE 73404
QIAshredder QIAGENE 79654
고용량 cDNA를 역전사 키트 Invitrogene AB-4368814
TE 버퍼 Invitrogene 1355656

화학 / 시약의 표 8 목록.

장비 명 회사 카탈로그 번호
행동 상공 회의소 (MDF; 50 X 45cm) 자기 조립
내부 방풍 상자 (30 X 30cm) 자기 조립
카메라 및 비디오 레코더 캠든 인스 CMD-80051
미디어 레코더 소프트웨어 Noldus NDS-NMR3-00M
아이리스 가위 FST FST-14062-09
Vibratome 캠든 인스. 7000SMZ-2
Bioanalyzer 애질런트 테크놀로지스 애질런트 2100 Bioanalyzer
열 자전거 타는 사람 바이오 라드 1852048
반전 microspun 주걱 Bochem 악기 GmbH의 3213
바이오 마크 HD 다시ADER 플루 BMHD-BMKHD
96.96 유전자 발현에 대한 동적 배열 칩 플루 BMK-M-96.96

표 9 장비 목록.

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Discussion

행동 패러다임 아래의 뇌 조직에서 유전자 발현의 성공적인 특성화에 따라 달라집니다 : 행동 패러다임 동안 마우스의 1) 취급에주의; 관심의 조직 2) 신속하고 정확한 해부; 3) RNA 안전 조치 RNA의 무결성을 보장하기 위해; 4)주의 프라이머 및 실험 레이아웃의 계획뿐만 아니라 qPCR에 분석을위한 준비 세부 사항에 대한 정밀도와 관심.

기재된 절차의 목적은 환경에 의해 유도 된 행동 전사 이벤트 동력학을 특성화하는 것이다; 따라서,주의 깊은 관심이 마우스에 의해 경험 행동 패러다임 실제로 연구자가 의도 한 환경을 나타낸다는 것을 보장하기 위해 필요하다. 예를 들어, 심지어 코카인으로 행동 감작 같은 간단한 패러다임에서, 마우스의 경험이 많은 교란 요인에 의해 영향을받을 수있다 : EX 이전 홈 케이지 마우스의 사전 경험periment; 실험 방에 전사하는 방법; 실험 실내에서 빛, 소리와 냄새 노출; 실험자에 의해 처리 경험; IP 주입으로 인한 통증 / 불편; 신규 한 실험에 노출하고, 안락사 시점까지 지정된 동작 다음 경험. 이러한 경험의 각각은 독립적으로, 마우스의 다양한 뇌 영역에서 전사 프로그램의 유도를 촉진 할 수 있습니다. 따라서주의 전사 프로그램이 원하는 패러다임을 측정 않도록주의해야하며, epiphenomena 패러다임과 관련이없는. 코카인 환경의 경우, 이는 용이하게 마우스보다는 코카인에 주입주의 실험과 주목 디테일뿐만 아니라, 모든 파라미터가 일정하게 유지되는 간단한 제어 실험하지만 비히클 (식염수)에 의해 달성된다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 식염수 주사에 비해 매우 제한적인 규모의 전사 프로그램을 유도코카인 노출, 패러다임이 압도적으로 관심의 현상을 조사 할 수 있음을 입증.

이 마우스의 조용하고 취급에주의를 필요로 여전히 활성화되어있는 동안 최대한의주의가 마우스의 경험의 범위를 제한하기 위해주의를 기울여야한다. 대조적으로, 마취 다음, 신속하고 정확한 작업을 잠재적으로 인해 세포가 파괴되고 나면 급격히 저하 될 수있다 (분의 시간 틀에서) RNA의 표현의 급격한 변화 및 ​​RNA의 본질적인 불안정성을위한 잠재적으로 중요 경험에 의한 전사 프로파일을 방해. 그것은 (1 ~ 2 분 이내) 냉장 환경에 신속하게 두개골에서 뇌를 제거하고 빠르게 얼음처럼 차가운 조건에서 NAC를 해부하는 것이 중요하다. 뇌가 차가워지면, 전사 변화 나 RNA 분해에 대한 전위는 현저하게 감소되지만, 관련 부분은 TRIZOL 시약에 배치 될 때만 및 냉동 난S 조직의 무결성 및 전사 프로파일의 표현이 보장.

이러한 맥락에서, 그것은 자극 다음 이전에 1 시간 피킹 종종 즉시 - 초기 유전자 발현의 전사 역학 빠른 시간 규모에서 발생 언급 할 가치가있다. 설명한 실험 패러다임의 관점에서, 전사 역학 심문 샘플 간의 변동을 감소시키기 위해 시간의 비율로 제한된다. 시간보다 짧은 1 시간, 타이밍에 작은 변화가 관찰 전사 변화의 크기에 큰 차이가 발생할 수 있습니다. 이 시점을 정밀하게 수행하기 쉽게 실험적이며, 실험에서 몇 분 차의 레벨 변동에 덜 민감하기 때문에, 따라서, 1 시간 시점은 분석을 위해 선택되었다.

전통적으로, 티슈 micropunch은 조직 샘플의 박리 많은 연구소에서 사용되고있다. 이조직의 미세 절제 매뉴얼을 선호하는 이유가있다. 펀치는 일반적으로 스테인레스 스틸로 만들어진 투명하지 않다. 따라서 정확하고 일관된 위치에 펀치를 배치하는 것은 까다로운 일이 될 수 있습니다. 또한, 펀치는 초기 위치에 실수가 있다면 모든 보정이 이루어질 수 없습니다. 마지막으로, 펀치 내에서 조직의 추출 때로는 까다로운 증명하고, 조직의 손실에 대한 가능성이있는, 또는 이월 샘플 사이에 할 수 있습니다. 미세 메스를 사용하여 조직의 미세 절제는 실험자에게보다 정확한 제어가 가능하고, 샘플의 순도에 대한 보안을 제공합니다.

RNA 추출 중 최대 cDNA 합성은, 작업 환경의 RNase가 오염 물질의 출처 자유 유지해야하고, 작업의 RNase에게 무료 도구, 일회용 및 시약을 사용하여 수행되어야 할 때까지. 이 단계에서, 최소 오염 RNA 샘플을 쉽게 손상 힘들게 있었다. 샘플 내가 유지CE 차가운 전사 판독을 수정할 수있는뿐 아니라 시료의 무결성에 영향을 미칠 수있는 효소 활성을 최소화하기 위해 신경 활동을 최소화하는 데 중요하다. 추가 약리 억제제는 때때로 신경 흥분을 감소시키기 위해 첨가되지만, 종종이 필수적 없습니다.

cDNA를 역전사에 이어, 강조 성적 광범위한 프로파일로부터 얻어진 결과의 유효성을 보장하는 변. 첫 번째 단계는 그것을 적극 RNA의 정의 소스의 희석 곡선에 프라이머 효율성과 특이성을 테스트하는 것이 좋습니다 적절한 qPCR에 프라이머를 사용하고 있는지 확인하는 것입니다. 최적의 PCR 프라이머는 특정 대상의 효율적인 증폭을 제공한다. 특정 증폭은 효율적인 증폭이 각 사이클에서, 표적 서열의 양임을 의미하면서 증폭 명백 융해 곡선 분석에서 단일 피크로서 이산만을 표적 서열임을 의미100 %에 근접하는 효율, 중복. 이 때문에 마이크로 유체 칩의 qPCR에 높은 처리량 특성, 이들 실험은 양성 및 음성 대조군의 상당수의 포함을 보장하기 위해 세심한 계획이 필요하다. 이는 제어 및 실험 조건에서 결과의 직접적인 비교를 가능 칩마다 실행에서 일관된 제어를 포함하는 것이 바람직하다. 실험을 설정하는 동안, 그렇지 교차 오염 우물에 매우 중요합니다. 잘못된 잘 프라이머의 작은 양이 원하지 않는 대상의 증폭을 야기 할 수 있기 때문에 프라이머를 피펫 팅 할 때 좀 더주의를 기울여야합니다.

뇌로부터 조직 샘플 대부분의 경우에는 박리시에만 관심 조직의 분석 결과를 혼란시킬 수 부적합 뇌 영역의 혼입과, 추출 된 것을 확신하기 어렵다. 이를 위하여, 제어는 중요한식이에서 제외 될 것으로 예상되어 유전자 프로빙관심있는 조직. 유전자 발현의 공간 패턴을 식별하기위한 유용한 도구가 알렌 뇌 아틀라스 (인 http://www.brain-map.org/ ).

데이터 분석에 대한 철저한 논의는이 책의 범위를 벗어나지 만, 그주의 실험 영장주의 깊은 분석을 주목해야한다. 그것은 관련 참조 유전자의 수는 qPCR에 모든 라운드에 포함되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자는 RNA의 유사한 양이 정량되고 있는지 확인하기 위해 정상화 될 것입니다. 정규화는 "ΔΔCt 방법"인가, 실험 ( "시간 0")에 대한 기준 생쥐 다음 샘플 내의 기준 유전자 먼저 수행하고있다.

이 논문에서 설명하는 프로토콜은 마우스의 핵 중격 의지에서 코카인 경험을 다음과 같은 전사 역학을 연구 대상으로합니다. 그러나, 매우 용이하다 adapte마우스의 다른 경험 연구는 D만큼 적절한 제어로 구현 한 경험 타이밍은 잘 정의된다. 물론,이 프로토콜은 또한뿐만 아니라 신경계 외부 조직에서 전사의 역학 연구를 위해 구현 될 수있다.

이것은 마이크로 유체 qPCR에 기반을 사용하여 광범위한 전사 프로파일 링이 전사 이벤트 프로파일의 비용 효율적인 방법이지만, 관심 대상의 유전자에 대한 사전 지식에 의존하는 것이 강조되어야한다. 이들은 일반적으로 같은 마이크로 어레이과 깊은 시퀀싱 같은 편견 프로파일 링 방법을 통해 얻을 수있다. 따라서, 큰 프로젝트의 흐름에서 광범위한 qPCR의 프로파일 링은 대량의 데이터를 제공 할 수 있지만, 우선적으로 시스템의 종래 공평 특성화를 수행한다.

또한 조직 샘플을 얻기 위해 본 명세서에 설명 된 프로세스가 또한 연구으로 구현 될 수 없다는 또한 가치단백질 체학, 단백질 수정, 대사 체학, lipidomics와 후생 유전 학적 마르크 - 다른 세포 다양한 이벤트를 보내고.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

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References

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