Omfattende analyse av transkripsjon Dynamics fra Brain Samples Etter Behavioral Experience

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kodingen av opplevelser i hjernen og konsolideringen av langsiktige minner avhenge gentranskripsjon. Identifisere funksjon av spesifikke gener i koding erfaring er en av de viktigste målene for molekylær nevrovitenskap. Videre funksjonell sammenslutning av definerte gener med spesiell oppførsel har implikasjoner for å forstå grunnlaget for nevropsykiatriske lidelser. Induksjon av robuste transkripsjonsprogrammer har blitt observert i hjernen hos mus etter ulike atferds manipulasjoner. Mens noen genetiske elementer benyttes gjentatte følgende forskjellige adferdsmessige manipulasjoner og i forskjellige hjernekjerner, transkripsjonelle programmer er samlet unike for induserende stimuli og strukturen i hvilket de er studert 1,2.

I denne publikasjonen er en protokoll som er beskrevet for robust og omfattende transcriptional profilering fra hjerne kjerner av mus i respons til adferds manipulasjon. DenProtokollen er vist i sammenheng med analyse av genekspresjon dynamikk i nucleus accumbens etter akutt kokain erfaring. Etter en definert in vivo erfaring, målet neural vev dissekeres; etterfulgt av RNA-rensing, revers transkripsjon og utnyttelse av microfluidic arrays for omfattende qPCR analyse av flere mål gener. Denne protokollen er rettet mot omfattende analyse (adressering 50-500 gener) av begrensende mengder av utgangsmaterialet, slik som små hjerneprøver eller enkeltceller.

Protokollen er mest fordelaktig for parallell analyse av flere prøver (f.eks enkeltceller, dynamisk analyse følgende farmasøytiske, viral eller adferdsmessige forstyrrelser). Imidlertid kan protokollen også tjene for karakterisering og kvalitetssikring av prøvene før hel-genom studier av mikromatriser eller RNAseq, samt kontroll av data innhentet fra hel-genom studier.

Introduction

Hjernens dynamisk organisasjon muliggjør kognitive og atferdsmessige fleksibilitet. Erfaringer er kodet gjennom modifikasjoner av strukturen og styrke forbindelsene mellom nevroner i hjernen tre. Denne "erfaring avhengig plastisitet" er et resultat av induksjon av spesifikke mønstre av genekspresjon som gir de nødvendige proteiner for modifisering av synaptiske struktur og styrke 4. Identifiseringen av genet regulatoriske nettverk medier dannelsen av langtidshukommelse er en grunnstein i molekylær nevrovitenskap, med forventning om at identifiseringen av de dominerende elementene av transkripsjonsprogrammer vil gi innsikt i de grunnleggende prinsippene som regulerer minne formasjon, samt mål for behandling av neurodegenerative og nevropsykiatriske lidelser. Transkripsjonelle programmer utfolde seg i timelig definerte bølger, hvor hver av disse koder gener som er av forskjellig karakter, som er viktige for different stadier i gjennomføringen av utfallet av signaleringshendelse 1,2. Det er derfor viktig å ta transkripsjons dynamikk på en detaljert timetidsskala, slik som å identifisere full bemanning av gener indusert, og få innsikt i deres potensial funksjon i henhold til dynamikken i sin induksjon.

Narkotikaavhengighet er en robust form for erfaring avhengig plastisitet forårsaket av den langvarige effekten av narkotika av misbruk på nevrale kretser i hjernen 5,6. Initial, akutt eksponering for stoffene kan føre til utvikling av avhengighet og overgang til kronisk bruk. Kontekstuell informasjon er et viktig element i utviklingen av avhengighet. Narkotika forbundet miljømessige signaler er tildelt vesentlig betydning i hodet av rusmisbrukere. Kontekstuell informasjon minner en narkotikamisbruker av tidligere narkotika erfaring kan indusere tilbakefall til narkotika ute selv etter lange perioder med avholdenhet fra narkotika 7,8.Derav stor klinisk utfordring i avhengighet - tilbøyelighet til narkomane til tilbakefall selv lenge etter at abstinenssymptomer har sunket ni.

Behavioral overfølsomhet mot kokain er en enkel modell av kokain erfaring nyttig i studiet av mekanismer for narkotikamisbruk. I dette stadig studert modell for langvarig allergi indusert av kronisk eksponering for narkotika av misbruk, er gnagere først vent seg til saltvann injeksjoner (ip; IP) i en roman miljø (et åpent felt kammer der deres bevegelsesaktiviteten overvåkes) ; da får de daglige injeksjoner av kokain i det åpne feltet kamrene mens deres aktivitet er overvåket 10 (figur 1). Denne atferds paradigme vanligvis resulterer i en robust sensibilisering av lokomotorisk atferd (8-12 ganger over utgangsaktivitet) 11, som blir opprettholdt for en periode på måneder etter opphør av kokain injeksjoner, noe som viser dannelsen av en grisasive minne spor av narkotika opplevelse.

Den nevrale kretser av belønning, naturligvis involvert i forsterkende atferd avgjørende for å lykkes med en art (for eksempel fôring, sex), blir utnyttet av narkotika av misbruk å forsterke narkotika assosiert atferd 12,13. De molekylære og cellulære mekanismer som opplevelsen av narkotika av misbruk er forbedret synes å være lik de mekanismene bak dannelsen av deklarative eller semantiske minner i andre strukturer i hjernen 14. Derfor robustheten av atferds allergi modellen gjør det til et attraktivt modellsystem for å studere mekanismer erfaring avhengig plastisitet.

Nucleus accumbens (NAC) er en sentral integrator av hjernens belønningskretser, og har blitt grundig assosiert med utvikling av avhengighet 5,6. Dannelsen av avhengighet avhengig transkripsjon av nye proteiner i nucleus accumbens, og robustduksjon av klart strukturerte transkripsjonsprogrammer er observert i NAC følgende kokain erfaring 15-19. Den akutte transcriptional respons på kokain eksponering forventes å fungere på flere nivåer for å tilpasse seg den sterke induksjon stimulans og for å lede produksjonen av nye proteiner som er ansvarlige for de strukturelle og elektrofysiologiske endringer indusert ved eksponering for medikamentet 6,19-22.

For å fremme studiet av molekylære mekanismer erfaring avhengig plastisitet i hjernen, er en fremgangsmåte beskrevet for omfattende analyse av transkripsjons dynamikken i hjernen vevsprøver følgende atferds manipulasjon. Protokollen er illustrert i sammenheng med atferds erfaring studert i Citri lab - behavioral overfølsomhet mot kokain, utnytte microfluidic dynamiske arrays for transcriptional analyse. Protokollen er beskrevet er selvsagt ikke begrenset til å studere than nucleus accumbens i sammenheng med atferds allergi, men kan brukes til et stort antall atferds paradigmer og hjerneregioner. Faktisk kan denne protokoll anvendes på kroppsvev utenfor hjernen, og en rekke erfaringer eller manipulasjoner av organismen undersøkt.

Protokollen er grovt sett deles inn i fire trinn. I det første trinnet, blir dyret utsatt for den atferds paradigme; i det andre trinnet i vevet er microdissected; i det tredje trinn - mRNA renset, revers-transkribert og analysert, og i det siste trinnet dataene blir analysert.

I sammenheng med å studere transkripsjons dynamikk, presis timing og definisjon av opplevelsen er trolig de viktigste eksperimentelle parametere for å kontrollere. Av denne grunn er det av atferds sensibilisering til kokain, et system som gir høy grad av experimenter kontroll over parametere til erfarin vår adferdsmodell av valgetce. Andre atferds paradigmer som muliggjør presis timing og adresse forskjellige modeller av erfaring avhengig plastisitet eller minnedannelse er tilgjengelig. Disse modellene inkluderer frykt conditioning 23, akutt miljøberikelse 24,25, roman objekt leting 26 og visuell opplevelse følgende mørk oppdragelse 27. Likevel, atferds overfølsomhet mot kokain er et gjennomgående robust atferds manipulasjon, og skaper en svært gjennomgripende minne spor som varer i måneder etter kokain erfaring 28.

Hjernen er seksjonert, etterfulgt av manuell microdissection av nucleus accumbens. Det har vært vår erfaring at manuell microdissection fra raskt forberedt hjernen skiver gir den mest pålitelige og rask metode for å utvinne vevet relevant for atferds paradigme, og med erfaring, er grensene for vevet bli tydelig og lett gjenkjent. Alternativt kunne fine skiver være prepared, etterfulgt av laser-fangst microdissection. Selv om denne metoden muliggjør svært definert avgrensning av regionen av interesse, er det sakte (og dermed risikere tap av labilt mRNA), kjedelig og krever kostbare dedikerte utstyr (et mikroskop utstyrt med en laser-fangst setup). Protokollen som definert heri kan også tilpasses encellede transcriptional analyse, ved manuell aspirasjon av cytoplasma visuelt identifiserte cellene ved hjelp av påsydde pipetter 29. Det er viktig å merke seg at den protokoll som er beskrevet gir en populasjon gjennomsnitt, mens det er meget sannsynlig at i de fleste tilfeller, bare en subpopulasjon av celler i vev faktisk er involvert i å svare på erfaring. Det er av interesse å profilere transkripsjon på en selektiv måte innenfra spesifikke cellepopulasjoner som svarer til opplevelsen, men diskusjon av disse metodene er utover dagens omfang.

For mRNA rensing, reverse-transkripsjon og qPCR spørring, vevetavbrytes ved å føre det gjennom fine nåler, etterfulgt av bruk av kommersielt tilgjengelige kits (for mer informasjon, se tabell 8). Valget er informert av erfaring med disse metodene, som sikrer pålitelig utvinning av høy kvalitet RNA og robuste resultater fra nedstrømsapplikasjoner.

Mens protokollen er beskrevet for høy gjennomstrømming qPCR utnytte dynamiske arrays, kan prøvene analysert for genuttrykk ved hjelp endepunkt PCR, lav gjennomstrømming qPCR, genekspresjon mikromatriser eller dyp-sekvensering. Preferansen for high-throughput qPCR utnytte dynamiske matriser er på grunn av det faktum at mRNA erholdt fra hjernekjerner følgende atferds paradigmer ofte er av begrensende mengder. Dynamiske matriser tilveiebringe en plattform som muliggjør effektiv omfattende analyse av transkripter fra et stort antall av parallelle prøver i et enkelt eksperiment. Etter den første oppkjøpet av mikrofluidsystem (vanligvis en institusjonell purchase), eksperimenter er relativt billig å løpe. Etter denne analysen, kan ytterligere spørring av prøvene utføres med mer kostbare plattformer for å søke etter nye transkripsjoner (ved mikromatriser eller RNAseq) med de dynamiske arrays gir en omfattende referanse for kvalitetssikring. Til slutt, for dataanalyse, er standard tilnærminger utnyttet. Konkrete tips om problemer som kan oppstå vil bli diskutert i teksten i protokollen.

Denne protokollen er mest hensiktsmessig for etterforskerne er interessert i en grundig undersøkelse av deres system av interesse, studere flere forhold og gjentak. Protokollen er også mest egnet for etterforskere som allerede har finslipt i (gjennom microarray eller RNAseq eksperimenter) på en undergruppe av 50-500 gener av interesse, som de er interessert i å spørre flere ganger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Protokollen følger retningslinjene til The Hebrew University of Jerusalem dyr omsorg.

1. Utarbeidelse av ACSF Solution

  1. Forbered ACSF løsning som beskrevet i tabell 1. Lag 1 L i DDH 2 O (> 18 mÊ renhet), og bringer osmolariteten til ~ 300 mOsm / L med passende tilsetning av vann eller NaCl.

2. Utstyr og rommet satt opp

Utstyr for overvåking av kokain-indusert muskel atferd består av atferds kamre (50 x 45 cm) kablet med en indre lyskilde, vifte og kamera (eller infrarøde sensorer), og utstyrt med en indre pleksiglass boks (30 x 30 cm) i hvor musene får lov til å bevege seg fritt, mens deres bevegelse overvåkes. Den atferds testing bør utføres mellom 1 time etter lysene på til 1 time før lysene av, på en vanlig lys / mørke syklus. Dyr skal være trent konsekvent på samme tid hver dag.

  1. Rens kamrene etter hvert forsøk med desinfiseringsmiddel levert av mus-anlegget og / eller fjerning av lukt-reagens, for å hindre lukt cue forspenning og for å sikre riktig desinfeksjon.

VIKTIG: Når du håndterer musene være stille, rolig og forsiktig.

3. Animal Forberedelse

  1. Hus 5 C57BL6 hannmus (6-12 uker gamle; ~ 25-35 g vekt) per bur, i et rom med en 12 timers lys / mørke syklus og fri tilgang til mat og vann, i henhold til standarder og krav til lokale Animal Care Committee veiledning og protokoller. Før initiering av eksperimentet, veie musene og logge data. Kokain senere administreres i henhold til vekten av musene.
  2. Overfør alle merder med mus inn i atferds rom 30 min før du starter den første rettssaken.
  3. Tilvenne allemus brukes i forsøket til forsøket, håndtering, injeksjoner og overvåking i oppførselen oppsettet. Dette oppnås ved tre påfølgende daglige intraperitoneale injeksjoner av 250 pl saltløsning som beskrevet nedenfor.
  4. Administrer en intraperitoneal injeksjon av 250 ul saltvann. Umiddelbart etter injeksjonen, plasseres musen i et kammer for å overvåke virkemåten lokomotorisk aktivitet etter 15 min. Gjenta denne handlingen for tre påfølgende dager, til samme tid hver dag.
  5. På den fjerde dagen, dele musene i to grupper. Forbered en stamløsning av kokain på 2 mg / ml i saltvann. Administrere en enkelt injeksjon av kokain-løsning (slutt 20 mg / kg) til forsøksgruppen i forhold til vekten av musen (for eksempel for en 25 g mus - injisere 250 ul, mens en 30 g mus får 300 ul). Administrer saltvann til kontrollgruppen. Umiddelbart etter injeksjonen, plasserer du muse for 20 min i en atferd kammer for overvåking av bevegelsesaktiviteten (typicalliert, er de første 15 min overvåket).
  6. Etter kokain injeksjon, ofre musene ved forskjellige tidspunkter (0, 1, 2, 4, 8 og 24 timers etter injeksjon). Viktigere, sørg for at referanse mus (0 tidspunkt) ikke vil motta noen injeksjon på denne dagen. På grunn av sin betydning, er det viktig å inkludere replikater av referansegruppen.

4. Disseksjon av nucleus accumbens

  1. Anesthetize mus med isofluran på riktig tidspunkt etter kokain / saltvann injeksjon. Den isofluran må være direkte ventilert ut av rommet. Derfor bør fremgangsmåten utføres i et avtrekksskap.
  2. Overvåke anestesidybden ved å teste den bakre foten refleks. Klem labben å lokke fram en tilbaketrekking respons av dyret. Et dyr som viser en refleks er ikke i en kirurgisk nivå av anestesi og ikke i en tilstand til å avlive.
  3. Utvinning av hjernen:
    1. Avlive musen ved halshogging.
    2. <li> Fjern skinnet ovenfor sentrum av skallen og kutte skallen med skarp saks.
    3. Sett saksen på det punktet der ryggmargen går inn i hjernen (foramen magnum) og lage to laterale kutt.
    4. Fra samme tidspunkt, gjøre en lang sagittal kutt langs sagittal sutur. Ved å nå luktelappen, klippet til venstre og til høyre.
    5. Med en tang, fjerne skallen nøye, gripe hver halvdel av skallen fast og trekke til side, tar seg ikke å trykke på eller skade hjernen.
    6. Fjern hjernen mens kutte kranienerver ved hjelp av et invertert mikro skjeen spatel.
  4. Sett hjernen i en iskald ACSF løsning for 1-2 min til chill og herde.
  5. Fjern hjernen fra ACSF, Wick overflødig væske med et papirhåndkle, skape en koronale kutt mellom lillehjernen og resten av hjernen og lim hjernen, med rostral del vendt opp, på vibratome scenen.
  6. Kutte NAc: Oppretthold ACSF løsninger til iskalde temperaturer i slicing kammeret i vibratome. Seksjon 200 mikrometer til nucleus accumbens (NAC) er tydelig identifisert i henhold til Paxinos and Franklin Mouse Brain Atlas (ca. 1.8 mm anterior til Bregma; ta hensyn til formen på corpus callosum, beliggenheten og formen av fremre og commissure ventriklene, så vel som den totale morfologi av hjernen seksjonen). På dette punktet, opprette to 400 pm seksjoner, hvorfra NAc vil bli dissekert.
  7. Under et stereoskop, bruker du en kniv for å dissekere NAC området ut fra skivene. Definisjonen av NAC er i henhold til Paxinos og Franklin mus hjerneatlas, og kan enkelt bli dissekert i aktuelle delene av fire raske pasninger av bladet på vevet. (Figur 2).
  8. Plasser Nac seksjoner umiddelbart i 900 mL Trizol lysereagensen i en mikro rør og oppbevar ved -80 ° C inntil RNA extrhandling.

5. RNA Utvinning og cDNA Reverse Transcription

  1. Tines de rør som inneholder nucleus accumbens seksjoner i Trizol reagens lyse ved romtemperatur og homogenisere lysatet med en 1 ml sprøyte som er koblet til 25 G nål inntil vevet er fullstendig homogenisert (minst 15-20 ganger). De første få runder er vanskelig, og krever skyve vevet mot veggen av røret for å bryte det til små biter som kan gå inn i spissen av nålen.
  2. For å sikre homogenisering, pipettér lysatet til en QIAshredder minispinnkolonne og sentrifuger ved 12 000 x g i 1 min.
  3. Pipet lysatet inn nye mikrorøret og trekke ut RNA i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar RNA ved -80 ° C inntil bruk.
  4. Mål RNA konsentrasjon, analysere integritet og kvalitet ved hjelp av en Bioanalyzer eller tilsvarende utstyr. Bruk 100-500 ng RNA for hver runde av cDNA forberedelse med random hexamer primere.

6. Primer Design og Primer Testing

  1. Velge gode primere: For en optimal primer par for qPCR av mRNA transkripsjoner, følger disse kravene (figur 3):
    1. Design primere inneholder ikke lenger enn 17-28 baser. Unngå nucleotide gjentar som de fremmer mispriming.
    2. Design primere med smeltetemperaturen (T m) mellom 56 til 68 ° C (optimalt 60 til 64 ° C). Den T m innenfor primerpar bør være innen 1 ° C fra hverandre.
    3. Vær oppmerksom på at den størrelsen bør ideelt sett være mellom 80 og 150bp.
    4. Sørge for at minst en av primerne omfatter et exon-ekson krysset, eller fragment inneholder et stort intron (intron-spenner), for å unngå amplifikasjon av genomisk DNA-forurensning.
    5. Bruk en pålitelig programvare basert på Primer3 (for eksempler se tabell 2) for å forbedre primer utforming.
  2. Teste primers: For å sikre at spesifisiteten og effektiviteten av primerne, en styre qPCR reaksjon bør utføres:
    1. Bruk en positiv prøve (inneholdende cDNA som mal for alle relevante primerpar) og titrere cDNA (for eksempel åtte tre-gangers fortynning fra en initial konsentrasjon på ~ 10 ng) i duplikat parallelle reaksjoner. Ved en ikke-templat-kontroll, som styrer for kontaminering innenfor de løsninger som brukes for reaksjonen.
    2. Beregn primer effektivitet ved hjelp av formelen: (10 (- 1 / helling) -1) x 100, slik at kurven for den optimale helling er - 3,333 (dvs. 10 (- 1 / 3,333) = 2) (figur 4).
    3. Bestemme spesifisiteten av forsterkning. Spesifikk forsterkning er vist ved en enkelt fremtredende topp som er felles for alle smelte kurver av de amplifiserte produkter, mens off-target forsterkning ville se ut som en tydelig avvik frOM den eneste stor peak.

7. qPCR analyse

  1. Pre-forsterkning:
    1. Omfattende qPCR analysen er basert på parallellspørring av begrensende mengder av RNA med et stort antall av primerpar. Derfor er essensielt et trinn med pre-forsterker. I dette trinn gjennomgår cDNA 14-18 sykluser av pre-forsterkning med en blanding av alle de primere som vil bli benyttet for spørring prøven i fremtiden (opp til 800 primerpar).
    2. Fortynne alle primere i TE (lav EDTA) til 50 mikrometer for Spesifikk Target Amplification (STA).
    3. Pool sammen en pl aliquoter av alle de 50 uM primer setter å bli inkludert i den STA reaksjonen, opp til 800 assays.
    4. Forbered forblanding og prøver for STA som beskrevet i Tabell 3. Tillat for feil ved fremstilling av blandingen for 110% av antallet prøver som skal forsterkes.
    5. Delmengde 3,75 mL STA pre-mix for hver prøve. Legg 1,25 mLav cDNA til hver.
    6. Vortex-bland i reaksjonene og sentrifuger i 10 sek.
    7. Plasser STA reaksjoner i en termosykler og sykle som angitt på Tabell 4.
  2. Exonuclease I (ExoI) behandling:
    1. Fortynn Exo I som angitt i tabell 5.
    2. Tilsett 2 mL av fortynnet ExoI (4 U / mL) til hver 5 ul STA reaksjon, vortex, spinne ned (> 6000 xg) og plasser i en termosykler ved 37 ° C i 30 min og deretter ved 80 ° C i 15 min.
    3. Fortynn de endelige produktene til en passende konsentrasjon for testing. Bruk TE-buffer (tilsett 43 ul TE-buffer til 7 ul TSA prøve).
    4. Oppbevar utvannet STA produkter ved -20 ° C eller bruk umiddelbart.
  3. Primer og prøveoppsett for qPCR:
    1. Forbered prøvene som vist i tabell 6. Klargjør blanding i henhold til chip valgt for eksperimentet, og legge prøvene etter behov.
    2. Agitate prøven Bland løsninger for et minimum av 20 sekunder, og sentrifuge (> 6000 xg) i minst 30 sek. Tilberedte reaksjoner kan lagres i korte lengder ved 4 ° C frem til brikken er klar for lasting.
    3. Klargjør assays som beskrevet i tabell 7.
    4. Bland analyseblanding i minst 20 sek og sentrifuge (> 6000 xg) i minst 30 sekunder for å spinne ned alle komponenter.
      VIKTIG: Vortex grundig og sentrifuger alle prøve og analyseløsninger før pipettering i brikken viker. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i en reduksjon i datakvalitet.
      NB: Den endelige konsentrasjon av hver primer er: 5 uM i innløpet og 500 nM i det endelige reaksjon.
  4. Grunning og Legge Dynamic Array IFC (integrert fluidic krets) chip. IFC brikken har innløp for prøver og analyser, så vel som angitt innløp (akkumulatorer) for styreledning fluid (mineralolje) som brukes til å trykksette de microfluidic kamre (Figure 4A).
    1. Injiser styreledning fluid inn i hver akkumulator på brikken.
    2. Fjern og kast den blå beskyttelsesfilmen fra bunnen av chip.
    3. Plasser chip inn i riktig IFC-kontrolleren (controller MX for 48.48 Dynamisk Array IFC eller IFC kontrolleren HX for 96,96 Dynamisk Array IFC), og deretter kjøre Prime (113x) manus til 48.48 Dynamisk Array IFC eller Prime (136x) manus til 96.96 Dynamisk Array IFC for å prime brikken.
    4. Når skriptet er ferdig, fjerner du det grunnede chip fra IFC-kontrolleren.
    5. Pipetter 5 mL av hver analyse Mix og 5 mL av hver Sample Mix i sine viker.
    6. Returnere brikken til IFC-kontrolleren.
    7. Ved hjelp av IFC-kontrolleren programvare, kjøre Load Mix (113x) manus til 48.48 Dynamic Array IFC) eller Load Mix (136x) manus til 96.96 Dynamisk Array IFC å laste prøver og analyser inn i brikken. Når lasten Mix skriptet er ferdig, fjerner du belastningened chip fra IFC-kontrolleren.
    8. Laste chip på termosykler, opprette en ny chip kjøre (i henhold til produsentens retningslinjer), inkludert smeltekurve analyse. Ved hjelp av den termosykler programvare, sørge for at reaksjonskamrene er anerkjent på riktig måte, og tillate reaksjonen å foregå til fullførelse.

8. Data Analysis

  1. Kvalitetskontroll: For å sikre datakvalitet, verifisere kvaliteten av primere ved å ta fortynning kurver (som beskrevet ovenfor). Overvåke det spesielle ved forsterkning ved å vise smelte kurver av amplikonene, toppene som bør optimalt være tett på linje 29.
  2. Visualisering: For visualisering av store mengder data innhentet av høy gjennomstrømming qPCR, bruke programvare generert heatmaps, der uttrykket er fargekodet etter intensitet. I tillegg viser de transkripsjons dynamikken i enkeltgener som foret spredningsplott.
  3. Publikasjon: I publiseringgenuttrykket resultater, er det anbefalt å følge MIQE Retningslinjer for publisering av kvantitativ real-time PCR-eksperimenter, detaljering minimumsinformasjon som må rapporteres for en qPCR eksperiment for å sikre sin relevans, nøyaktighet, riktig tolkning, og reproduserbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvaliteten av resultatene oppnådd ved anvendelse av denne protokollen i avgjørende grad er avhengig av en rekke parametere. Riktig forsøksplanlegging vil resultere i minimal forstyrrelse for de eksperimentelle mus, slik at erfaringen testet (i dette eksempelet, at for eksponering for kokain) vil være den mest dominerende erfaring i sin nyere tid, og derfor vil resultere i en robust og spesifikk transkripsjons program. Figur 1 beskriver den eksperimentelle plan for adferds sensibilisering til kokain, som avgrenser de tidspunkter etter kokain erfaring på hvilken nucleus accumbens dissekeres fra mus og analysert. Den neste viktige punkt er at for å definere de nøyaktige grenser for ekstirpasjon av riktig vev for analyse. Figur 2 beskriver grensene for nucleus accumbens i koronale og sagittale seksjoner. Fortrinn disseksjon bør utføres slik at en tynn margin NAc vev er utelukket fra regionen takno for profilering. Dette sikrer konsistent profilering bare av NAC, redusere variabilitet og potensialet for gjenstander som oppstår inkludering av omkringliggende vev.

Ved å forsterke begrensende mengder av RNA, som i disseksjon av små hjernekjerner, mange sykluser med amplifikasjon er nødvendig for riktig deteksjon av signalet. Derfor er et viktig punkt i noen kvantitativ PCR-eksperimentet, forsterkes ytterligere når man arbeider med små mengder av utgangsmaterialet, er karakteriseringen av primerne anvendt for amplifikasjon. Figur 3 beskriver viktige funksjoner i å definere optimale primere, og Figur 4 viser forsterkningskurver for primere dirigert mot c-Fos og FosB, viser at disse primerpar forsterke sine mål karakterutskrift med ~ 100% effektivitet i hver syklus. Etter primer validering og etablering av riktig eksperimentelle paradigmet å aktivere klar vurdering av transkripsjon fra målet tissue, kan omfattende analyse utføres på Fluidigm Biomark plattformen, slik at opp til 9216 parallelle qPCR reaksjoner (i 96.96-format, figur 5). Denne high-throughput plattformen muliggjør parallell analyse av flere eksperimentelle forsøk, ved bruk av identiske eksperimentelle betingelser på en eneste brikke. Data for firemannsrom eksperimentelle repetisjoner, adressering transkripsjons induksjon av c-Fos og FosB etter akutte kokain erfaring, er vist i figur 6.

Figur 1
Figur 1. Eksperimentell paradigme for dynamisk transcriptional analyse etter kokain opplevelse. (A) Eksperimentell protokoll - mus blir vant til håndtering og injeksjon i 3 dager, mens overvåking lokomotorisk aktivitet ved video-sporing i et lyddempende oppførsel kammeret. Muser da underlagt kokain erfaring; en enkelt eksponering = akutt kokain erfaring; 5 påfølgende injeksjoner kalles kronisk eksponering. En enkelt injeksjon følgende ≥16 dager med avholdenhet fra kokain kalles en kokain utfordring. Transcriptional dynamikk er adressert til forskjellige eksperimentelle tidspunkter følgende kokain erfaring (1, 2, 4, 8, 24 hr.) (B) Plot av sporet innenfor musa oppførselen kammeret etter 3 dager med saltvann injeksjon eller 3 dager med saltoppløsning + a enkelt akutt kokain eksponering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Plassering av nucleus accumbens i musen hjernen. Tykke hvite linjer markere plasseringen av kutt definere b oundaries av NAC (A) Koronal delen;. (B) sagittal delen. (Bilder tilpasset fra Allen Brain Atlas Reference Atlas Images:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100 883 869 ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Planlegging qPCR primere. Retningslinjer for planlegging qPCR primere, med definisjoner for spesifisitet, stabilitet og kompatibilitet. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Vurdering av primer effektivitet. (A) Resultater av forsterkning kurver av Fos og FosB bruker Fluidigm IFC arrays. En standardkurve ble generert ved hjelp av syv serielle 3-fold fortynninger av total RNA ekstrahert fra muse NAc og analysert for ekspresjon av Fos og FosB (B). Effektiviteten av primerpar for Fos og FosB ble evaluert ved å plotte syklus terskelverdi ( Ct) ved hver fortynning mot logaritmen av gangers fortynning av prøven. Effektiviteten av de primere som er beregnet fra helningen av standardkurven, som definert i teksten. Forsterkningen kurver og punkter på fortynning kurve er i matchende farge.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Omfattende qPCR profilering påfører Fluidigm plattformen. (A) 96.96 Dynamisk Array IFC for Real-Time Kvantitativ PCR. Primerne legges i viker som ligger på høyre side, og prøvene legges i viker som ligger i venstre side av brikken. Dette tallet har blitt modifisert med tillatelse fra Fluidigm Real Time PCR-analyse Brukerhåndbok. (B) Heat kart over qPCR resultatene, som representerer Ct-verdiene for hver brønn på brikken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Eksempel resultatene av uttrykk dynamikk etter akutt kokain eksponering. Kokain-indusert ekspresjon av c-Fos og FosB er vist som en funksjon av tiden. , Gjennomsnitt av firemannsrom eksperimentelle repetisjoner, utført i henhold til protokollen definert her vises, sammen med feilfelt portretterer standard feil av gjennomsnittet.

Reagens MW mM g / L
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376) 58.44 119 6.95
NaHCO3 (Sigma-Aldrich, S6014) 84.01 26 2.18
Glukose (Sigma-Aldrich, G8270) 180,16 10 1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d> 74.55 2.5 0.186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638) 137,99 1 0.138
MgSO 4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880) 246,5 4 0.99
CaCl 2 (Sigma-Aldrich, C3011) 147 4 0,59

Tabell 1. ACSF løsning.

Programvare navn Søknad web plassering
Roche Probefinder primere utforming http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI primer-blast primere utforming http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> Tabell 2. liste Software.

Reagens Volum / Reaction (il) Volum for 48 Reaksjoner + 10% overskudd (mL) Volum for 96 Reaksjoner + 10% overskudd (mL)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) 2.5 132 264
500 nM (10X) samlet primer blanding 1 52.8 105.6
Vann 0,25 13.2 26.4
cDNA 1.25
Total Volume 5

Tabell 3. STA reaksjonsløsning.

Tilstand Hold 10-14 Cycles Hold
Temperatur 95 º C 95 º C 60 º C 4 º C
Tid 10 min 15 sek 4 min

Tabell 4. Thermal sykkelforhold for pre-forsterkning.

komponent Per 5 mL Prøve (ul) 48 Prøver med Overage (ul) 96 Prøver med Overage (ul)
Vann 1.4 84 168
Exonuklease I reaksjonsbuffer 0.2 12 24
Exonuclease jeg på 20 enheter / mL 0.4 24 48 </ Td>
Total Volume 2.0 120 240

Tabell 5. ExoI reaksjonsløsning.

</ Tr>
PRØVE MIX Component Volum pr Inlet (ul) Volum per Inlet med Overage (ul) Volum for 48.48 Dynamisk Array IFC (ul) (120 prøver) Volum for 96,96 Dynamisk Array IFC (ul) (120 prøver)
2X SsoFast EvaGreen Supermix med lav ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211) 2.5 3 180 360
20X DNA Binding Dye Sample Loading Reagens (Fluidigm, PN 100- 3738) grønn cap 0,25 0.3 18 36
STA og ExoI behandlet prøve 2.25 2.7
Total 5 6

Tabell 6. Prøve Pre-Mix løsning.

Tabell 7. Assay Mix løsning.

Komponent Volum per Inlet (ul) Volum per Inlet med Overage (ul) Volum for 48.48 Dynamisk Array IFC (ul) Volum for 96,96 Dynamisk Array IFC (ul)
2X analysen Laster Reagens 2.5 3 180 360
1X DNA Suspension Buffer (TE lav EDTA) 2 2.4 144 288
50 mikrometer hvert blandet forover og bakover Grunning 0.5 0.6
Total Volume 5 6
Navn på Reagens / Material Selskapet Katalognummer
Virusol Oriek Medical J29D
Isofluran, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy pluss Universal Mini Kit QIAGENE 73404
QIAshredder QIAGENE 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Invitrogene AB-4368814
TE-buffer Invitrogene 1355656

Tabell 8. Liste over kjemikalier / reagenser.

Navn på utstyr Selskapet Katalognummer
Adferd Chamber (MDF, 50 x 45 cm) Selv montert
Indre pleksiglass boks (30 x 30 cm) Selv montert
Kamera og videokamera Campden Inst CMD-80051
Media Recorder programvare Noldus NDS-NMR3-00M
Iris saks FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies Agilent 2100 Bioanalyzer
Termosykler Bio-Rad 1852048
Inverterte microspun slikkepott Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD ReAder Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamisk utvalg Chip for 96,96 genuttrykk Fluidigm BMK-M-96.96

Tabell 9. Utstyrsliste.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vellykket karakterisering av genuttrykk fra hjernevev følgende atferds paradigmer avhengig av: 1) forsiktig håndtering av mus i løpet av atferds paradigmet; 2) Rask og presis disseksjon av vev av interesse; 3) RNA-sikker tiltak for å sikre integriteten av RNA; og 4) Nøye planlegging av primere og eksperimentelle oppsettet samt presisjon og oppmerksomhet på detaljer i forberedelse til qPCR analyse.

Hensikten med den fremgangsmåte som er beskrevet, er å karakterisere dynamikken i transkripsjonelle hendelser indusert av en adferds erfaring; derfor er nødvendig for forsiktig oppmerksomhet for å sikre at atferds paradigmet oppleves av musen faktisk representerer erfaring tiltenkt av forskeren. For eksempel, selv i et så enkelt paradigme som atferds overfølsomhet mot kokain, opplevelsen av musen kan bli påvirket av mange konfunderende faktorer: tidligere erfaring med musen i hjemme-buret før exForsøket; metoden for overføring til den eksperimentelle rommet; lys, lyd og lukt eksponering i forsøksrommet; opplevelsen av håndtering av eksperimentator; smerte / ubehag forårsaket av IP-injeksjon; eksponering for en ny eksperiment, og erfaringen følge den angitte virkemåten opp til punktet for eutanasi. Hver og en av disse erfaringene kan isolert sett fremme induksjon av transkripsjonsprogrammer i forskjellige områder av hjernen til mus. Derfor må man sørge for å sikre at transkripsjonsprogrammet måler ønsket paradigme, og ikke epiphenomena forbundet med paradigmet. I tilfelle av kokain erfaring, er dette lett oppnås ved omhyggelig eksperimentering og oppmerksomhet på detaljer, så vel som en enkel kontrolleksperiment, hvor alle parametre blir holdt konstant, men kjøretøyet (saltvann) injiseres i mus heller enn kokain. I vår erfaring, saltvann injeksjon induserer en transcriptional program av svært begrenset omfang i forhold tilkokain eksponering, noe som viser at paradigmet gjør overveldende undersøkelse av fenomener av interesse.

Ytterste forsiktighet bør tas for å begrense omfanget av erfaringer med musen mens det fortsatt er aktiv, nødvendig rolig og forsiktig håndtering av musene. I kontrast, etter anestesi, er rask og nøyaktig arbeid vesentlig på grunn av potensialet for hurtige forandringer i fremstillingen av RNA (for tidsskalaen minutter) og den iboende labilitet av RNA, som kan bli nedbrutt hurtig når cellene blir forstyrret, potensielt forstyrre transkripsjons profilen indusert av erfaring. Det er derfor viktig å fjerne hjernen fra skallen raskt til en kjølt miljø (innen 1-2 min) og raskt dissekere NAC i iskalde forhold. Når hjernen har blitt kjølt, blir potensialet for transkripsjonelle endringer eller RNA-degradering betydelig redusert, men bare når de relevante delene er plassert i Trizol reagens og frosset, is integriteten av vevet og representasjon av den transkripsjonelle profilen er sikret.

I denne sammenheng er det verdt å nevne at transkripsjonelle dynamikken i umiddelbar-tidlig genekspresjon skjer på en rask tidsskala, ofte med en topp før 1 time etter stimulering. I sammenheng med den eksperimentelle paradigmet som er beskrevet, er avlesningen av transkripsjonelle dynamikk begrenset til omfanget av timene for å redusere variabiliteten mellom prøvene. For tider kortere enn 1 time, kan små variasjoner i timing resultere i store variasjoner i størrelsen av transkripsjonelle forandringer observert. Derfor er den 1 t tidspunkt har blitt valgt for analysen, siden dette tidspunkt er eksperimentelt lettere å utføre med presisjon, og er mindre utsatt for variasjoner i nivået av et par minutter forskjell i forsøket.

Tradisjonelt har en vev micropunch blitt brukt av mange laboratorier for disseksjon av vevsprøver. Deter en rekke grunner til å foretrekke manuell microdissection av vevet. Den effekt er vanligvis laget av rustfritt stål, og er ikke gjennomsiktig. Derfor posisjonerer punch i et presist og konsistent plassering kan være vanskelig. Videre gjør punsj ikke tillate noen korrigering skal gjøres hvis det var en feil i den innledende posisjonering. Endelig kan utvinning av vev fra i slag noen ganger vise seg vanskelig, og det er potensial for å miste vev, eller bære-over mellom prøvene. Microdissection av vev ved bruk av et fint skalpell muliggjør experimenter mer nøyaktig kontroll og gir sikkerhet med hensyn til renheten av prøvene.

Under RNA ekstraksjon og frem til cDNA syntese, må arbeidsmiljøet skal holdes fri fra kilder RNase forurensninger, og arbeidet skal utføres ved hjelp av RNase gratis verktøy, forbruksmateriell og reagenser. På dette stadiet, den minste forurensning kan lett ødelegge hardt opptjente RNA prøver. Holde prøvene Ice kulde er viktig for å minimalisere nevral aktivitet som kunne modifisere den transkripsjonelle avlesning, så vel som for å minimalisere enzymatisk aktivitet som kan påvirke prøven integritet. Ytterligere farmakologiske inhibitorer er ofte tilsatt for å redusere nevrale eksitabilitet, men ofte er dette ikke avgjørende.

Etter revers-transkripsjon til cDNA, slår vekt på å sikre gyldigheten av resultatene oppnådd fra omfattende profilering av vitnemål. Det første trinnet er å sikre at passende qPCR primere er utnyttet, som det er sterkt anbefalt å teste primer effektivitet og spesifisitet på utvannings kurver av en definert kilde til RNA. Optimale PCR primere gir spesifikk og effektiv amplifikasjon av målet. Spesifikk amplifikasjon innebærer at forsterkningen er kun for target-sekvensen, åpenbart som en enkelt diskret topp i smeltekurve analyse, mens effektiv forsterkning innebærer at i hver syklus er mengden av target-sekvensenduplisert, med en virkningsgrad tilnærmet 100%. På grunn av den høye gjennomstrømningen arten av de microfluidic qPCR chips, disse eksperimentene krever nøye planlegging for å sikre at inkludering av et betydelig antall av positive og negative kontroller. Det er å foretrekke å inkludere konsistente kontroller i alle chip løp, muliggjør direkte sammenligning av resultatene fra kontroll og eksperimentelle forhold. Under oppsettet av eksperimentet, er det avgjørende å ikke krysse-forurense brønner. Siden liten mengde primere i feil vel kunne føre til forsterkning av uønsket målet, bør det utvises ekstra forsiktighet når pipettering primere.

For de fleste vevsprøver fra hjernen er det vanskelig å være sikker på at under disseksjonen kun vevet av interesse ble ekstrahert, med ingen forurensning av irrelevante hjerneregioner, som kunne forvirre analysen av resultatene. For å oppnå dette, er en viktig kontroll sondering for gener som uttrykk forventes å bli ekskludert fravevet av interesse. Et nyttig verktøy for å identifisere romlige mønstre av genuttrykk er Allen Brain Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Mens en grundig diskusjon av dataanalyse er utenfor omfanget av denne publikasjonen, bør det bemerkes at forsiktig eksperimentering garanterer grundig analyse. Det er viktig å sikre at en rekke relevante referansegener er inkludert i hver runde av qPCR. Disse gener vil tjene for normalisering for å sikre at tilsvarende mengder av RNA blir analysert. Normalisering utføres først til referansegener i prøven, og deretter til referanse mus for eksperimentet ("tid 0"), påføring av "ΔΔCt metoden".

Den protokoll som er beskrevet i dette manuskriptet er rettet mot å studere transkripsjon dynamikk følgende kokain erfaring i nucleus accumbens hos mus. Imidlertid er det meget lett ADAPTEd for studiet av noen annen opplevelse av mus, så lenge riktig kontroller blir gjennomført, og timingen av opplevelsen er godt definert. Selvfølgelig kan denne protokollen også implementeres for studiet av dynamikken i transkripsjon i vev utenfor nervesystemet også.

Det bør understrekes at omfattende transcriptional profilering ved hjelp av mikrofluid-baserte qPCR er en kostnadseffektiv metode for profilering transkripsjons hendelser, men er avhengig av forutgående kunnskap om mål gener av interesse. Disse er vanligvis oppnås gjennom objektive profilering metoder, for eksempel mikromatriser og dyp-sekvensering. Derfor, i arbeidsflyten av et stort prosjekt, kunne omfattende qPCR profilering utgjør brorparten av dataene, men fortrinnsvis bør følge en tidligere objektiv karakterisering av systemet.

Det er også verdt å si at prosessen som er beskrevet heri for å oppnå vevsprøver kan også implementeres mot studieing en rekke andre cellulære hendelser - proteomikk og protein modifikasjoner, metabolomics, lipidomics og epigenetiske merker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
  2. Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).
  3. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  4. Kleim, J. A., Jones, T. A. Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage. Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).
  5. Kauer, J. A., Malenka, R. C. Synaptic plasticity and addiction. Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).
  6. Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction. Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).
  7. Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
  8. Koob, G. F., et al. Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence. Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).
  9. Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).
  10. Beurrier, C., Malenka, R. C. Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine. The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).
  11. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view. Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).
  12. Boening, J. A. Neurobiology of an addiction memory. Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).
  13. Everitt, B. J., Robbins, T. W. Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion. Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).
  14. Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. The addicted human brain: insights from imaging studies. The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).
  15. Carlezon, W. A. Jr, et al. Regulation of cocaine reward by CREB. Science. 282, 2272-2275 (1998).
  16. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).
  17. Hope, B. T., et al. Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments. Neuron. 13, 1235-1244 (1994).
  18. Pulipparacharuvil, S., et al. Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity. Neuron. 59, 621-633 (2008).
  19. Robison, A. J., Nestler, E. J. Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction. Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).
  20. Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence. Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).
  21. Nestler, E. J. The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the. National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).
  22. Robbins, T. W., Everitt, B. J. Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation. Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).
  23. Kaplan, G. B., Moore, K. A. The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).
  24. Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).
  25. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
  26. Silingardi, D., et al. ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex. Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).
  27. Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex. The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).
  28. Steketee, J. D., Kalivas, P. W. Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior. Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).
  29. Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nature protocols. 7, 118-127 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics