Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Biology

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Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

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Abstract

Cardiomiócitos primários de rato neonatal são úteis na investigação básica em cardiovascular in vitro, porque eles podem ser facilmente isolados em grande número em um único procedimento. Devido aos avanços na tecnologia de microscópio é relativamente fácil para capturar imagens de células vivas com a finalidade de investigar eventos celulares, em tempo real, com preocupação mínima sobre fototoxicidade para as células. Este protocolo descreve como tirar imagens timelapse células vivas de ratos primário cardiomiócitos neonatais usando um microscópio confocal disco giratório seguinte transdução lentiviral e adenovírus para modular as propriedades da célula. A aplicação de dois tipos diferentes de vírus facilita a alcançar um nível de taxas de transdução e de expressão apropriados para dois genes diferentes. Imagens de células vivas bem focado pode ser obtido usando o sistema de focagem automática do microscópio, que mantém o foco estável por longos períodos de tempo. Aplicando este método, as funções de engenheiro exogenamenteed proteínas expressas em células primárias de cultura pode ser analisado. Além disso, este sistema pode ser usado para examinar as funções de genes através do uso de siRNAs, bem como de moduladores químicos.

Introduction

Cardiomiócitos neonatais de ratos primárias têm sido muito utilizados para investigar a função de cardiomiócitos in vitro 1. Eles são fáceis de isolar a partir de crias de ratos por vários métodos bem estabelecidos 2-4. O método mais comum emprega colagenase ou tripsina para digerir o tecido conjuntivo do coração antes do isolamento de células. Os investigadores também foram desenvolvidos métodos para isolar os cardiomiócitos de roedores adultos 5-8, bem como ratinhos neonatais 9,10.

Este protocolo descreve um método para o isolamento de cardiomiócitos de crias de ratos recém-nascidos, empregando um procedimento de digestão com enzimas de duas etapas. A tripsina é usado pela primeira vez O / N a 4 ° C, e, em seguida, colagenase purificada a 37 ° C. A incubação do tecido do coração com tripsina O / N a 4 ° C reduz os passos necessários para colheita de células, em comparação com os métodos que utilizam as incubações sequenciais em uma solução de enzima quente 2. Além disso, através da utilização de co purificadallagenase em vez de enzimas em bruto, a variabilidade de lote para lote pode ser eliminada, proporcionando assim melhorada a reprodutibilidade.

Estudos funcionais de uma proteína particular, muitas vezes empregue um sistema de expressão de proteína utilizando um adenovírus 11-13 e / ou um lentivírus 14-16. [NOTA PREVENTIVAS] A produção e manipulação viral deve ser realizada de acordo com as directrizes de NIH.

O adenovirus não se integra no genoma do hospedeiro. Tem uma elevada eficiência de transdução na maioria dos tipos de células, incluindo as células que se dividem e células que não se dividem, como bem como células primárias e as linhas de células estabelecidas. Isso faz com que o adenovírus de um vector de confiança para a expressão do gene. Níveis elevados da proteína codificada pelo vector de adenovírus desenvolver dentro de 48 horas a seguir a transdução, e pode durar várias semanas 17. No entanto, uma desvantagem do uso de um adenovírus para expressão de proteína é que o desenvolvimento de um ade recombinanteadenovírus é complicado e demorado. Este inconveniente explica em parte por que muitos pesquisadores têm se voltando para lentivírus para a expressão do gene recombinante. Ao contrário de construções de adenovírus, gerando uma construção lentiviral é rápido e fácil. Embora lentivírus geralmente têm eficiências inferiores de transdução do que os adenovírus, tanto em células em divisão e que não se dividem, eles se integram no genoma do hospedeiro. Consequentemente, a expressão do gene transduzido é mais estável para os lentivírus do que para os adenovírus.

Devido aos avanços tecnológicos no campo da microscopia, é muito mais fácil de capturar imagens de células vivas de células que expressam proteínas recombinantes. Isto é válido mesmo em velocidades de taxa de vídeo de aquisição. Isto permite que o investigador como para determinar alterações específicas na proteína de interesse funcionalmente impacto na célula em tempo real. O microscópio confocal disco giratório tem várias características que o tornam uma técnica ideal para livimagem e celular 18,19. O disco giratório Yokogawa permite muito mais rápida aquisição de imagem, e, ao mesmo tempo, utilizando muito menos energia do laser de microscopia confocal de varredura ponto. Ambas estas características especiais são devidos ao disco giratório, que contém várias perfurações confocal através do qual o laser passa simultaneamente com as amostras. Durante a aquisição, o próprio disco gira rapidamente e continuamente 18-20. Ao utilizar o sistema de focagem do microscópio, o foco é mantida estável durante longos períodos de tempo. Isso permite que os pesquisadores para captar imagens de células vivas bem focados. Imagens adquiridas são reproduzidas como um arquivo de filme. As imagens são analisadas usando o software de análise de imagem como o ImageJ 21,22, FIJI 23, ou outro software disponível comercialmente.

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Protocol

1. Isolamento de cardiomiócitos de ratos neonatais

  1. Utilizar o meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) e meio essencial mínimo (MEM) suplementado com soro fetal bovino (FBS) e penicilina / estreptomicina (P / S) como o meio de cultura. Adicionar bromodesoxiuridina (BrdU) para o meio para prevenir o crescimento de fibroblastos para os primeiros 2 dias, após o isolamento.
Meio base FBS BrdU (mM) P / S (U / ml)
seleção DMEM 10% 0 20
O primeiro dia DMEM 10% 0,1 10
No dia seguinte, DMEM / MEM 5% 0,1 10
Além disso a cultura DMEM / MEM 5% 0 10

Tabela 1:. Médio para ratos cardiomiócitos neonatais Use esta mídia para o cultivo de ratos cardiomiócitos neonatais. DMEM / MEM é de 1:1 mistura de DMEM e meio MEM.

  1. Isolamento dos cardiomiócitos, Dia 1 (tempo necessário estimado, cerca de 1 hora)
    NOTA: Para o trabalho com roedores neonatais, consulte as diretrizes da universidade local e regras estabelecidas pelos programas de cuidados com os animais, e aderir a protocolos de animais institucionalmente aprovados. Todos os métodos descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Animal Resource Center Yale Institutional Animal Care e Use.
    1. Preparar os reagentes e ferramentas: solução salina equilibrada de cálcio e magnésio ou livre de Hank (HBSS CMF), 30 ml x 2, 10 mL x 2, em gelo; 1 mg de tripsina, reconstituída com 2 ml de HBSS CMF, sobre gelo; ferramentas autoclavado; 70% de etanol (EtOH) na proveta de 250 ml; quatro pratos de plástico esterilizado de 10 cm, três para o isolamento do coração e uma para a tripsinização.
    2. Ordem 1 litter de 1-a-2 dias de idade, os filhotes de rato (cerca de 10) com o seu filhotes barragem de um distribuidor do animal experimental.
    3. Day1, Transferência filhotes a gaiola pequena e eutanásia barragem com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina, 200ml/10g e xilazina 20ml/10g) overdose.
    4. Pegue um filhote de cachorro e esterilizar todo o seu corpo com etanol 70%. Decapitar filhote com bem conservados tesoura cirúrgica afiadas em um esterilizado 10 centímetros prato de plástico em um local isolado de outros filhotes.
      NOTA: A fim de recolher as amostras o mais rapidamente possível, é melhor usar o método mais rápido e eficiente para encerrar a vida do roedor. Decapitação quando corretamente utilizado por profissionais qualificados, com equipamentos bem conservados pode resultar em menos medo e ansiedade para o animal e ser mais rápido e prático do que outras formas de eutanásia. É consistente com as recomendações dos veterinários Diretrizes da Associação Médica Americana para a eutanásia de animais.
    5. Remover batendo elearte com ferramentas esterilizadas, e colocar o coração em 30 ml de gelo refrigerados CMF HBSS em tubo de 50 ml. NOTA: Remova o coração tão rapidamente quanto possível e colocá-los em gelo imediatamente. Após a remoção dos corações do corpo, todos os procedimentos devem ser feitos em gelo.
    6. Colete 5 corações em 30 ml de gelo refrigerados CMF HBSS e os restantes 5 corações em mais 30 ml de gelo refrigerados CMF HBSS. Agitar o tubo para enxaguar os corações. NOTA: Após esta etapa, executar todos os procedimentos em uma capela de fluxo laminar.
    7. Descartar o sobrenadante e transferir os corações para uma nova placa de 10 cm esterilizado de plástico em gelo. NOTA: Tenha cuidado para não aspirar corações com o aspirador.
    8. Remover grandes vasos e / ou tecidos não desejados. Adicionar 10 ml de gelo gelou CMF HBSS para o prato para lavar os corações.
    9. Transfira todos os corações para um novo esterilizado 10 centímetros prato de plástico com gelo. Picar o coração com uma tesoura para menos de 1 mm 3 em gelo.
    10. Adicionar 9 ml de refrigerados CMF HBSS. Adicionar 1 ml de refrigerados reconstituição tripsinatuído com CMF HBSS (definitivo 50 ug / ml).
    11. Selar o prato com parafilme e cubra com papel alumínio, em seguida, colocá-lo em câmara fria (4 ˚ C) durante a noite.
  2. Isolamento dos cardiomiócitos, Dia 2 (tempo necessário estimado, cerca de 4 horas)
    1. Preparar reagentes e ferramentas: 50 ml cônico tubo x 2; 2 mg inibidor de tripsina, reconstituída com 1 ml de HBSS CMF, no gelo; 1.500 unidades de colagenase, reconstituído com 5 ml de Leibovitz L-15, à temperatura ambiente (RT); Leibovitz L-15, reconstituída com 1 litro de água esterilizada e filtrar através de um filtro de 0,22 mícron, 8 ml de RT; 10 mg / ml (32,6 mM) de BrdU em água; P / S; DMEM + 10% de FBS; MEM; dois pratos de plástico de cultura de célula 10 cm; Pratos de fundo 3,5 centímetros de vidro.
    2. Day2, Preparar gelatina revestido pratos. Adicionar 1 ml da solução de gelatina 0,1% para o revestimento de um prato fundo 3,5 centímetros vidro para uma experiência de imagem. Incubar pratos a 37 ˚ C por várias horas, em seguida, aspirar e descartar solução de gelatina antes de usar.
      NÃOTE: Um prato inferior 3,5 centímetro de vidro é adequado para uma experiência de imagem usando um microscópio de fluorescência. Para extrair as proteínas a partir de cardiomiócitos primários para detectar a expressão de proteínas por transferência Western (WB), 0,1% de gelatina revestidas placas de cultura de células de plástico pode ser usado.
    3. Transferir todo o tecido do coração digerido por tripsina durante a noite com tampão para um tubo cónico de 50 ml em gelo no exaustor esterilizado. Adicionar 1 ml de inibidor de tripsina em HBSS (CMF final de 182 ug / ml). Fechar a tampa de tubo de 50 ml com força para evitar a contaminação.
    4. Incubar o tubo por cerca de 30 minutos em uma incubadora de 37 ˚ C para aquecer o tecido e buffer para 30-37 ˚ C. Adicionar 5 ml de colagenase em Leibovitz L-15 (final de 94 unidades / ml). Incubar a 37 ˚ C por 45 min com agitação suave (170-200 rpm shaker em 37 ˚ C incubadora).
      NOTA: Este passo pode ser feito fora da capela de fluxo laminar. Todas as etapas subseqüentes deve ser feito à temperatura ambiente.
    5. Desinfectar o exterior de um tubo de 50 ml com 70% de EtOH e colocadolo na capa esterilizado.
    6. Tecidos triturar usando auto pipeta com pipeta em 3 ml / s de velocidade de 20 vezes. Permitir resíduo de tecido que se contentar com 3 min e filtrar o sobrenadante com um filtro de células 70 hum.
      NOTA: um tamanho de 10 ml pipeta regular pode ser utilizado para a trituração.
    7. Adicionar 5 ml de Leibovitz L-15 para os tufos de tecido remanescentes e tritura-se e filtra-se o sobrenadante novamente. Lavar coador de células com 2 ml de Leibovitz L-15.
    8. Coloque solução celular filtrado numa campânula durante 20 - 60 min para permitir que a colagenase para digerir o colagénio parcialmente degradado.
    9. Células de sedimentos em 100 x g durante 5 min. Re-suspender as células em 20 ml de DMEM contendo 10% de FBS e alta concentração de P / S (20 U / ml).
    10. As células pré-chapa em dois pratos de plástico de cultura de células 10 centímetros para 1 hora em incubadora de CO 2 a 37 ˚ C para a seleção de cardiomiócitos. NOTA: Os fibroblastos anexar mais facilmente para o fundo do prato de cardiomiócitos.
    11. While espera, preparar DMEM contendo FBS a 10%, P / S (10 U / ml) e 0,1 mM de BrdU. Adicionar 1 ml de 10 mg / ml de BrdU para 325 ml de DMEM contendo 10% de FBS e P / S.
    12. Mexa delicadamente pratos e recolher o cardiomiócito contendo sobrenadante de dois 10 centímetros pratos.
      NOTA: A maioria dos cardiomiócitos ainda estará flutuando no sobrenadante após 1 hora de incubação. Para evitar a contaminação com fibroblastos que são levemente ligados ao prato, não recolher o sobrenadante por pipetagem.
    13. Opcional> Contagem células do sobrenadante com e sem 0,2% de azul tripano para verificar a viabilidade celular.
    14. Células de sedimentos em 100 x g durante 5 min. Re-suspender as células em meio DMEM contendo FBS a 10%, P / S (10 U / ml) e 0,1 mM de BrdU. Células em placas a 2 x 10 5 células / prato em 3,5 centímetros de vidro pratos fundo revestido de gelatina para a observação usando o microscópio. NOTA: Não perturbe células após o plaqueamento por pelo menos 24 horas na incubadora de CO 2 a 37 ˚ C.
    15. Dia 3, Change médias de 24 horas após o plaqueamento de DMEM / MEM contendo FBS a 5%, P / S e 0,1 mM de BrdU.
    16. Dia 4, Mude média 48 horas após o plaqueamento de DMEM / MEM contendo 5% de FBS e P / S.
      NOTA: Mude médio a cada 2-3 dias com DMEM / MEM contendo 5% de FBS e P / S.

2. Transdução Lentivirus

  1. Embalagem de plasmídeos lentivíricos
    NOTA: Por favor, consulte outras fontes para obter mais informações detalhadas sobre o assunto 24-26. Isso levará cerca de três dias para preparar a solução lentiviral. É melhor usar a solução lentiviral fresco para alcançar maior eficiência de transdução. Comece a embalagem de plasmídeos lentivírus e isolamento de cardiomiócitos neonatais de ratos em paralelo. Em vez de usar a polietilenoimina (PEI) 27 para a embalagem de plasmídeos lentivíricos, um reagente de transfecção disponíveis comercialmente podem ser utilizados. Siga as instruções do fabricante.
    1. Preparar os reagentes e ferramentas; HEKAs células 293T, 10 centímetros de plástico pratos de cultura de células, as soluções de plasmídeos lentivíricos (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentiviral vector de transferência, 1,0 mg / ml de cada), 1 g / l de PEI, meio isento de soro, de 20 mM cloroquina em água, 10% de água sanitária, 1% SDS em etanol 70%
    2. Dia 0, placa de 2-2,5 x 10 6 células HEK 293T por placa de 10 cm no dia antes da transfecção.
      NOTA: 30-60% de confluência em transfecção é o ideal.
    3. Dia 1, Preparar solução de transfecção PEI. Adicionar 30 ul de 1 g / L de PEI para 960 de meio isento de soro ul num tubo de 1,5 ml. Adicionar 4 plasmídeos para a solução de transfecção de PEI no tubo de 1,5 ml, e misturar com o vazamento.
    Nome do plasmídeo Nota Tamanho (kbp) volume adicionado (ml) Montante final de placa de 10 cm (mg) Concentração final de placa de 10 cm (PM)
    Lentivirus vetor de transferência gene codifica para ser embalado 9-13 3,6-5,2 3,6-5,2 60
    pMDLg / pRRE expressa HIV-1 gag / pol 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-Rev expressa HIV-1 REV 4.1 0,82 0,82 30
    pMD2.G expressa VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    Tabela 2:. A quantidade de plasmídeos para a embalagem lentiviral Use estas quantidades de plasmídeos para transfecção de células HEK293 em placas de 10 cm. Montante final do vetor de transferência lentiviral por prato podem ser diferentes de acordo com seu tamanho, manter a concentração final por prato em 60 horas. Peso molecular médio de um par de bases de DNA de cadeia dupla é de 660 daltons.

    1. Descarte média de idadea partir de placa de 10 cm de células HEK 293T, e suavemente adicionar 9 ml de meio novo (DMEM + 10% de FBS, sem P / S).
    2. Adicione a mistura de PEI-DNA suavemente gota a gota sobre a placa e gentilmente agite para misturar com o meio. Adicionar 10 ul de 20 mM cloroquina (final de 20 uM) a 10 ml médio. NOTA: A cloroquina é pensado para reduzir a degradação de complexos de transfecção com plasmídeos através de neutralização parcial do pH dentro de compartimentos lisossomais 28.
    3. Incubar em incubadora de CO 2 a 37 ˚ C durante 6 horas. Em seguida, remover o meio contendo a mistura de PEI-ADN e adicionar 10 ml de meio novo (DMEM + 10% FBS + 20 mM de ácido 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), pH 7,4 + P / S) . Nota: Após a incubação, o vírus vai ser produzido no meio. Pipetas Pasteur Aspiração e / ou sugestões devem ser descontaminados por 10% de alvejante. Sempre descontaminar a superfície cabine de segurança biológica e equipamentos potencialmente contaminados com etanol 70%, independentemente de sobrenadante foi derramadoou não. Se derramamento ocorreu, descontaminação completa com 1% de SDS em 70% de EtOH é necessário.
    4. Dia 2-3, Incubar em incubadora de CO 2 a 37 ˚ C por 48-72 horas. Dia 4, recolher solução lentiviral (continuar a Seção 2.2).
      NOTA: médio pode ser mudado em 48 horas após a transfecção. Coleta sobrenadante vírus 48 horas e 72 horas duas vezes pode atingir para obter soluções de vírus título mais elevados.
  2. Recolha de solução lentiviral e transdução
    1. Prepare reagente e ferramentas: 15 ml tubos cônicos, 1 M HEPES, pH 7,4 (0,22 hum filtrada)
    2. Dia 4, Coletar sobrenadante contendo partículas lentivírus (solução lentiviral) com 10 ml esterilizados Luer-Lok seringa, em seguida, filtrar o sobrenadante através 0,45 filtrar para um tubo de 15 ml. Adicionar 1/100 do volume de 1 M de HEPES pH 7,4 a solução filtrada lentiviral (10 mM final).
      NOTA: Para filtragem, use apenas ace celulosetate ou polietersulfona (PES) (baixa ligação protéica) filtros. Não use filtros de nitrocelulose. Nitrocelulose liga proteínas de superfície sobre o envelope lentiviral e destrói o vírus.
    3. Remova o meio de 3,5 centímetros pratos de ratos cardiomiócitos neonatais, obtidos na última etapa da Seção 1.2, adicionar 1 ml de solução lentiviral filtrada para o 3,5 centímetros prato.
    4. <Opcional> Adicionar brometo de hexadimetrina (concentração final de 4-6 ug / ml).
      NOTA: brometo Hexadimetrina pode melhorar a eficácia de transdução lentiviral. Concentração de brometo Hexadimetrina deve ser otimizado.
    5. Incubar prato para 6 horas em incubadora de CO 2 a 37 ˚ C para a transdução lentiviral, em seguida, mudar para um novo meio DMEM / MEM contendo 5% de FBS e P / S. Incubar prato na incubadora de CO 2 a 37 ˚ C durante 3 dias.
      NOTA: Integração do gene exógeno no genoma do hospedeiro por lentivírus é considerada concluída por 72 horas.
    6. Dia 7, usar células do passo 2.2.5 para a próxima etapa. NOTA: A expressão de proteínas a partir do plasmídeo lentiviral pode ser confirmada por WB ou imunocitoquímica (ICH) após 48-72 horas de transdução, a fim de determinar o nível de expressão relativa (Figura 1a e 1b).
  3. Concentração da solução lentiviral
    NOTA: É melhor utilizar solução lentiviral fresco, a fim de alcançar maior eficiência de transdução, no caso da solução título lentivírico não é suficientemente elevada, a solução lentiviral pode ser concentrada por polietileno glicol (PEG) 29.
    1. Preparação de solução de 4x PEG (32% PEG6000, 400 mM de cloreto de sódio (NaCl), 40 mM HEPES pH 7,4)
      1. Para 125 ml de solução de 4x PEG, pesar 40 g de PEG6000, em seguida, dissolva-a em 60 ml de água.
        NOTA: NOTA: (. Isto é, peso molecular médio de PEG6000 é 6000) O número depois de PEG é o peso molecular médio
        NOTA: 2.3.1.2) Lentamente, adicionar 10 mlde 5 M de NaCl. Adiciona-se lentamente 5 mL de HEPES 1 M pH 7,4. Ajustar o pH para 7,4 utilizando hidróxido de sódio 2 M.
        NOTA: 2.3.1.3) Adicionar água para 125 ml. Esterilizar solução PEG 4x por filtração de membrana com um filtro de 0,22 hm e armazená-lo em 4 ˚ C.
    2. Concentração Lentivirus
      1. Filtro lentiviral transduzidas sobrenadante para novo tubo de 50 ml utilizando um filtro de 0,45 um.
        NOTA: 2.3.2.2) Adicionar solução 4x PEG 01:03 ratio (solução de PEG: sobrenadante = 1:3). Armazenar a 4 ˚ C por 16-48 horas.
        NOTA: 2.3.2.3) Centrifugar a 2.600 x g a 4 ˚ C durante 30 min. Elimine o sobrenadante e centrifuga-se a 2.600 x g a 4 ˚ C durante 5 min.
        NOTA: 2.3.2.4) Elimine o sobrenadante com cuidado para evitar perturbar o sedimento. Re-suspender a pelete em meio isento de soro, utilizando 1/2 a 1/25 do volume do volume de sobrenadante inicial.
        NOTA: 2.3.2.5) Use diretamente ou congelar usando nitrogênio líquido, em seguida, armazenar a -80 ˚ C

3. Transdução adenoviral

NOTA: Por favor, consulte outras fontes para os métodos de construção e propagação de construções de adenovírus 13. Pipetas Pasteur Aspiração e / ou sugestões devem ser descontaminados por 10% de alvejante. Sempre descontaminar a superfície cabine de segurança biológica e equipamentos potencialmente contaminados com etanol 70%, independentemente de sobrenadante foi derramado. Se derramamento ocorreu, descontaminação completa com 1% de SDS em 70% de EtOH é necessário.

  1. Titulação adenoviral por 50% da cultura de tecido dose infecciosa (TCID 50)
    NOTA: Antes de transdução, que é necessário para titular a solução de estoque de adenovírus. TCID 50 é um dos melhores métodos para titular a solução viral. Porque o método de avalia um título por uma capacidade infecciosa de células HEK 293T, calculada TCID50 reflecte infectability real do estoque de adenovírus. A UFP (uni-formadoras de placasts) é proporcional a TCID 50, com um factor de cerca de 0,56 30.
    1. Prepare células e ferramentas: células HEK 293T, 10 centímetros pratos de cultura de células, 96 poços de placas de cultura de células de fundo plano, de 8 canais múltiplos de pipeta
    2. Preparar 70-90% confluente HEK células 293T em uma placa de 10 cm.
    3. Realizar uma pré-diluição de 1/10 4 do estoque de vírus. Adicionar 50 ul de DMEM + 10% de FBS a cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços de fundo plano. Adicionar 25 ul do estoque de vírus pré-diluído em primeira linha, de A a H.
    4. Misturar bem e transferir 25 ul da primeira fila de poços para a segunda linha com uma pipeta de multi-canal 8. Repetir a diluição de 1/3 da solução virai para cada linha de poços até e incluindo o dia 11 de linha e descartar último 25 ul.
    5. Tritura-se células 293T de HEK em 10 ml de DMEM + 10% de FBS. Adicionar 50 ul da solução de células em cada poço a partir de linhas de 1 a 12.
    6. Incubar as células a 37 ˚ C em estufa de CO2 por 11-13 dias. Adicionar 50 ul de DMEM + 10% de FBS e depois de 4-5 dias de 7-8 dias de plaqueamento.
    7. Medir os efeitos citopáticos em cada poço a 11-13 dias após a infecção.
    pista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Uma linha d d d d d d d d d
    Fila B d d d d d d d d d
    Fila C d d d d d d d d d
    Fila D d d d d d d d
    Fileira E d d d d d d d d d d d
    Fila F d d d d d d d
    Row G d d d d d d d d
    Fila H d d d d d d d d d d d
    o número de poços positivos por fila 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    a proporção de poços positivos por fila 1 1 1 1 1 1 1 0,75 0,63 0,25 0,25 0
    d Exibindo mais de 50% os efeitos citopáticos
    Resultados abaixo de 50% ou sem efeitos citopáticos

    Pista 1, diluição x10 3 1 4; faixa 2, 3 de diluição 2 x10 4; ...; pista 11, a diluição de 3 2 x10 11; pista 12, o controle.
    S = a soma dos índices de poços positivos por linha
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 +0 = 8,875
    TCID50 = 3 x 10 x 3 x 4 (8,875-0,5) = 2,97 x 10 8
    DICC 50 / mL = 5,94 x 10 9

    Tabela 3: Exemplo de uma pessoa infectada com 96 poços de placa após 10 dias de incubação medir os efeitos citopáticos em cada poço e somar os rácios de poços positivos por fila..

    1. Calcula-se a título de acordo com a fórmula de Kaerber
    2. TCID50 = (diluição de primeira pista) x (diluição) (S-0.5)
    3. S = a soma dos índices de poços positivos por linha
      NOTA: Para este protocolo, DICC 50 = (30000) x (3) (S-0.5). Porque 50 ul de solução viral é usado neste protocolo, divida DICC 50 por 0,05 para calcular DICC 50 / ml.
  2. Transdução de adenovírus
    1. Calcular a quantidade necessária de solução de adenovírus a partir da sua titulação (UFP / ml, de partículas virais / ml ou TCID 50 / ml). Utilizar a fórmula para calcular MOI (multiplicidade de infecção).
    2. em> [Local Tabela 4 aqui]
    3. Adicionar quantidade calculada de solução de vírus de meio isento de soro (ver Tabela 5). Misturar bem e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.
    4. em> [Local Tabela 5 aqui]
    5. Day7, Tome prato obtido na última etapa da Seção 2.2, e substituí-médio, com 750 ul de novo DMEM / MEM contendo 5% de FBS e P / S.
      NOTA: Redução do volume médiona transdução de cerca de 50% do volume original é crítica para a alta eficiência de transdução.
    6. Adicionar vírus solução diluída para prato. Incubar prato por 4-8 horas em incubadora de CO 2 a 37 ˚ C. Em seguida, substitua-o por meio fresco.
    7. Incubar prato por 24-48 horas em incubadora de CO 2 a 37 ˚ C. No dia 8-9, usar as células para o experimento de imagem de células vivas. NOTA: A expressão de proteínas a partir do plasmídeo de adenovírus podem ser confirmados por WB ou HIC após 24-48 horas de transdução, a fim de determinar o nível de expressão de proteínas em relação (Figura 1c e 1d).

4. Imagens de células vivas

  1. A aquisição de imagens usando um microscópio confocal disco giratório com uma câmara de temperatura controlada e um sistema de CO 2 do meio ambiente (opcional)
    1. Ligar o sistema de controlo da temperatura em, pelo menos, 1 hora antes da aquisição, de modo a que todos os dispositivos de equilibrar a 37 ˚ C antes do início da aquisição. Ligue confocal girando sistema de microscópio disco (PC para a operação, microscópio, girando unidade de disco, câmera CCD, laser, fonte de luz fluorescente, fonte de luz normal, palco motorizado, e persianas automáticas).
      NOTA: Mais de 1 hora é necessário para atingir o equilíbrio completo de temperatura de todos os dispositivos.
    2. Mude médio em 3,5 centímetros de vidro pratos inferiores a mídia desejada para a aquisição, se necessário. Colocar a cápsula na fase de microscópio confocal de disco rotativo, numa câmara de temperatura controlada.
      NOTA: Devido a aberração esférica para observação ideal pelo uso de microscopia de um fundo prato 3,5 centímetros de vidro com tampa de vidro No. 1,5 (cerca de 0,16-0,19 mm de espessura) é o ideal. Se o objectivo a ser utilizado tem um colar de correcção, as imagens obtidas com os vidros de cobertura mais espessas do que 0,17 milímetros pode ser corrigido. Além disso, vermelho de fenol tem uma ligeira fluorescência. Às vezes, é preferível utilizar um meio isento de vermelho de fenol, tal como DMEM sem vermelho de fenol. Se não houver um dispositivo para controlar CO 2 independente, ou em meio tamponado por HEPES para o prazo de imagem time-lapse.
    3. Selecione o caminho de luz para as oculares.
    4. Vire o obturador da fonte de luz brilhante em campo diante. Ajuste o foco para as células ao microscópio através das oculares. Gire o botão do obturador para o brilhante-campo de origem luz.
    5. Gire o botão do obturador para a fonte de luz fluorescente por diante. Localizar células que expressam proteínas fluorescentes sob o microscópio através das oculares. Gire o botão do obturador para a luz fluorescente fonte.
    6. Opcional> Pressione o botão de ativação para o sistema de foco perfeito em frente ao microscópio para ligar o sistema de foco perfeito em ordem para manter o foco constante durante a aquisição de lapso de tempo.
    7. Altere o caminho de luz para o microscópio confocal disco giratório. Ajuste as definições para aquisição apropriadamente usando o software de operação, verificando imagens displaYed na tela. (Por exemplo, Focus, potência do laser, tempo de exposição, CCD ganho câmera e off-set)
    8. Definir configurações para a aquisição de imagem fluorescente usando software de operação. Exemplo: Selecione "Alterar canais usando caminhos de luz" e "Canal 1: EGFP" para adquirir sinal fluorescente EGFP para um canal.
    9. Defina a frequência entre pontos de tempo ao configurar as definições de lapso de tempo, a fim de obter imagens de lapso de tempo usando o software operacional. Exemplo: Para adquirir um tempo de ponto a cada 5 minutos, selecione "Minutos por Tempo de ponto" a partir do menu drop-down e digite 5 no campo de texto.
      NOTA: Selecione "Velocidade máxima" para fazer um filme em velocidade real. Se a expressão da proteína fluorescente é baixa, a fluorescência pode branquear rapidamente durante a aquisição de lapso de tempo. Nesse caso, é melhor reduzir o número de aquisição de pontos de tempo.
    10. Comece a aquisição de lapso de tempo clicando no botão "stabotão rt "para adquirir uma sequência de imagens.
      NOTA: É melhor não usar a função de aquisição-vários pontos. Isso pode causar perda de foco ou movimento do campo de imagem durante o exame de lapso de tempo.
  2. Análise das imagens adquiridas
    NOTA: Adquirida imagens podem ser reproduzidas como um arquivo de filme e analisados ​​usando o software de análise.
    1. Selecione as imagens adquiridas para serem incluídos em um filme. Se necessário, as regiões de culturas de interesse a partir de imagens e selecionar interessantes pontos de tempo para reduzir o tamanho do arquivo do filme usando o software operacional.
    2. Exportar imagens como um arquivo de filme em formato AVI ou MOV. Selecione um formato de filme a partir do menu "Format" drop-down eo tempo exigido para o filme terminar, clique em "Export". NOTA: imagens de lapso de tempo adquiridos em um ponto de tempo a cada 5 minutos pode ser reproduzido como um filme em 10 frames por segundo, o que é 3.000 vezes mais rápido do que a velocidade real.
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Representative Results

Para ilustrar a técnica, a codificação de EGFP lentivírus (reforçada proteína fluorescente verde) marcado com Cx43 (Connexin43) ou um Cx43 mutante 32 foi utilizado para expressar proteínas EGFP-marcado em células, e um adenovírus codificador FGFR1DN (receptor do factor de crescimento do fibroblasto 1 negativo dominante ) foi utilizado para fechar a sinalização do FGF-se na célula de 33-35. Três dias após o isolamento de cardiomiócitos, os cardiomiócitos foram isolados transduzidas com lentivírus, a fim de expressar as proteínas marcadas com EGFP nas células. Em seguida, depois de 3 dias de transdução lentiviral, os cardiomiócitos foram isolados mais transduzidas com um adenovírus codificador FGFR1DN para eliminar a sinalização do FGF nas células. Depois de se deixar o tempo suficiente para as células a expressar os genes exógenos transduzidas, de um microscópio confocal de disco giratório foi usada para captar imagens de células vivas. Imagens adquiridas são reproduzidas como um arquivo de filme e analisados ​​usando o software de análise de imagem. Para representação mais detalhadaTive resultados consulte Sakurai et al 32.

A expressão de proteínas marcadas com EGFP seguinte transdução lentiviral foi confirmada por microscopia confocal de disco giratório 72 horas seguintes lentiviral de transdução Figuras 1A-B. A expressão de FGFR1DN por transdução adenovírus foi confirmada pela WB e ICC após 24 horas de adenovírus transdução Figuras 1C-D. O tempo de adição de adenovírus de 3,5 centímetros pratos foi definido como o tempo 0 e o tempo transcorrido imagens foram adquiridas com uma 40x ar NA 0.9 lente objectiva cada 5 min durante 6 horas utilizando uma câmara de aquecimento para manter a temperatura a 37 ˚ C. Imagens de lapso de tempo de proteínas marcadas-EGFP nos cardiomiócitos primários tomadas por microscopia confocal disco giratório são mostrados em filmes Suplementares 1-2.

Nos casos em que o equilíbrio de temperatura não era adequado, ou o modo de múltiplos aquisição não estava a funcionar correctamente,imagens capturadas pode mover no plano xy Suplementar Filme 1. No entanto, quando a funcionar correctamente o sistema de focagem automática mantida de forma estável foco e isso não ocorreu. Como mostrado na Suplementar filme 2, quando o equilíbrio da temperatura foi adequada e apenas uma região de interesse foi adquirida, as imagens captadas são de altíssima qualidade.

A batida dos cardiomiócitos foi avaliada após longo prazo de lapso de tempo imagens de células vivas, a fim de confirmar a viabilidade celular. Mesmo depois de 16 horas de lapso de tempo de imagem expressando EGFP cardiomiócitos mantiveram suas propriedades funcionais e bater filme ritmicamente Suplementar 3.

Figura 1
Figura 1. Confirmação da expressão da proteína seguinte transdução lentiviral ou adenovírus. (A) isolado de rato cardiomiócitos neonatais expressam Cx43-WT-EGFP transduzidas com Ad-FGFR1DN 3 dias após a transdução. Veja também Filme Suplementar 1. (B) de ratos cardiomiócitos neonatais isolados expressando Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP transduzidas com Ad-FGFR1DN 3 dias após a transdução. Veja também Filme Suplementar 2. (C) A expressão de proteínas após a transdução de adenovírus detectados pelo ICC 24 horas após a transdução. A hemaglutinina (HA) FGFR1DN foi detectado por anticorpo anti-HA usando métodos convencionais ICC marcado com proteína, a alfa-actinina foi usada como um marcador para cardiomiócitos. (D) Expressão da proteína de transdução de adenovírus FGFR1DN seguinte detectado por WB 24 horas após a transdução. Marcada com HA FGFR1DN foi detectado por anticorpo anti-HA pela WB, beta-tubulina foi utilizada como controlo de carga.

Filme Suplementar 1. Time-lapse de imagens de isolado de rato carro neonatal cardiomiócitos expressam Cx43-WT-EGFP transduzidas com Ad-FGFR1DN. As imagens de lapso de tempo foram adquiridos com uma lente de 40x objetivo a cada 5 min durante 6 horas com um microscópio confocal disco giratório. Imagens obtidas foram reproduzidas como um filme em 10 frames por segundo. Este filme tem sido modificado a partir Sakurai et al 32. Clique aqui para ver este vídeo.

Filme Suplementar 2. Time-lapse de imagem de cardiomiócitos isolados de ratos neonatais expressando Cx43-S325/328/330E-EGFP transduzidas com Ad-FGFR1DN. As imagens de lapso de tempo foram adquiridos com uma lente objetiva de 40x a cada 5 min durante 6 horas com uma confocal girando microscópio disco. Imagens obtidas foram reproduzidas como um filme em 10 frames por segundo. Este filme tem sido modificado a partir Sakurai et al 32."Target =" _blank "> Clique aqui para ver este vídeo.

Time-lapse de imagens de ratos cardiomiócitos neonatais filme isolado Suplementar 3. Reproduzidos a velocidade real. As imagens de lapso de tempo de cardiomiócitos isolados de ratos recém-nascidos que expressam Cx43-EGFP transduzidas com Ad-FGFR1DN foram adquiridos com uma lente objetiva de 40x a cada 200 milissegundos para 10 seg com um microscópio confocal disco giratório após 16 horas de aquisição de lapso de tempo. Imagens obtidas foram reproduzidas como um filme em 5 quadros por segundo na velocidade real. Clique aqui para ver este vídeo.

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Discussion

Cardiomiócitos primários isolados de ratos recém-nascidos têm sido usados ​​para estudar as funções de cardiomiócitos in vitro. Este protocolo descreve um método para o isolamento de cardiomiócitos neonatais de filhotes de rato usando um método de digestão enzimática de dois passos, primeiro digestão com tripsina O / N a 4 ° C e, em seguida, colagenase purificada. Uma vantagem de se empregar o passo colagenase purificada é que o mesmo tipo de enzima é utilizado para todos os isolamentos. Assim, a qualidade e quantidade de células isoladas é consistente de experiência para experiência.

Dadas as eficiências de transdução mais elevados associados com adenovírus, se uma elevada eficiência de transdução da cultura de células é necessário para uma dada experiência, é melhor usar um adenovírus. No entanto, se os níveis elevados de transdução não são necessários, um vector lentiviral pode ser usado. Tendo a opção de usar ou vetores adenovirais ou lentivirais torna mais fácil para alcançar transd apropriadouction níveis de expressão e para diferentes tipos de genes. Se a intensidade de fluorescência detectado por imagem de células vivas, utilizando o microscópio confocal de disco giratório ou ICC é muito baixo após a transdução lentiviral, utilizando um outro vector de transferência lentiviral que utiliza um promotor diferente para expressar o gene de interesse pode resolver este problema. Com vetores adenovirais, se a banda detectada por WB é fraco após a transdução adenovírus, isso pode indicar um estoque baixo título viral. Nesse caso, é melhor preparar uma solução de adenovírus título mais elevado, por propagação em células antes de prosseguir.

Uma limitação desta técnica é que o rendimento dos cardiomiócitos viáveis ​​isoladas não é altamente consistente de experiência de experimentar, mesmo quando se usa colagenase purificada. A fim de realizar experimentos com imagens reprodutíveis, é melhor contar células viáveis ​​após a seleção dos cardiomiócitos isolados do sobrenadante no passo 1.2.13. na seção de protocolo. Então, seed cardiomiócitos em pratos com fundo de vidro em diluições variáveis. Uma vez que as células tenham anexado, escolha pratos com a concentração de células apropriado para a experiência planeada.

Existem muitas vantagens de usar cardiomiócitos neonatais, mas também há algumas desvantagens. A principal desvantagem é a clara diferença de cardiomiócitos adultos. Cardiomiócitos adultos são totalmente diferenciados rod-forma e cardiomiócitos primários adultos isolados manter sua morfologia em forma de bastonete, enquanto cardiomiócitos primários neonatais isoladas espalhar em todas as direções 36. As diferenças fenotípicas entre isolado adulto e cardiomiócitos neonatais também são refletidos em seus padrões de expressão gênica 37. Portanto, para as experiências em que são necessários cardiomiócitos diferenciados, um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos adultos serão necessários 4.

Utilizando transdução de adenovírus e lentivírico recombinanteproteínas em cardiomiócitos primários de rato neonatal em combinação com a microscopia confocal de disco giratório permite analisar as funções das proteínas em células vivas em cultura primária. Em relação a métodos existentes, que utilizam a transfecção para introduzir o gene de interesse em células, uma vantagem significativa do presente protocolo é que os adenovírus e os lentivírus são tomadas de forma muito eficiente pelas células resultantes da expressão do gene de interesse em quase todas as células a cultura. Além disso, a utilização de dois tipos diferentes de vírus para a expressão do gene faz com que seja mais fácil de atingir taxas de transdução adequadas e os níveis de expressão de vários genes. siRNAs e químicas agonistas e antagonistas também podem ser usados ​​neste sistema para desorientar ainda mais e analisar as funções dos genes e as proteínas que eles codificam.

Preparação dos corações é um passo extremamente importante no protocolo. Remover os corações do corpo tão rapidamente quanto possível. Certifique-se decolocá-los em gelo imediatamente para manter a viabilidade celular de alta. Outro passo importante é a preparação de alta qualidade, e título, os estoques lentivirais / adenovírus. Se forem utilizadas reservas virais má qualidade, os níveis de transdução e expressão do gene de interesse será baixo. Portanto, eles podem não ser adequados para estudos de imagiologia.

Uma futura aplicação importante desta técnica será a sua 'utilização em cardiomiócitos de rato. Testes de estudos-piloto se este método pode ser utilizado para o isolamento de cardiomiócitos neonatais de rato produziram resultados promissores. Devido ao tamanho relativamente pequeno dos corações do rato, em comparação com as dos ratos, menos tecido é obtido inicialmente. Assim, menos células são isolados num procedimento único, utilizando o mesmo número de animais, mas simplesmente utilizando mais ratinhos para o isolamento deve eliminar este obstáculo. A capacidade de isolar os cardiomiócitos de rato permite aos investigadores para investigar as funções de células isoladas a partir de m geneticamente modificadogelo (transgênico, knock-out, knock-in) que tenham sido produzidos a fim de estudar uma forma particular do gene de interesse.

Um dos principais obstáculos na investigação cardiovascular tem sido a dificuldade associada com a investigar a expressão e função de um determinado gene expresso no tecido do coração in vivo e em tempo real. No entanto, a capacidade de isolar os cardiomiócitos batendo funcionais, modular funções celulares usando a transdução viral, e depois estudá-los em tempo real usando o microscópio confocal disco giratório ajuda a lançar luz sobre o papel dos cardiomiócitos in vivo e colmatar esta lacuna. Este método proporciona um sistema simplificado para a compreensão da função de cardiomiócitos a nível celular. Ela permite a análise de como perturbações na expressão gênica alterar a função dos cardiomiócitos tempo real. Imagens de células vivas de cardiomiócitos fornecerá mais insights sobre a função dos cardiomiócitos. Tais percepções vai levar a avanços na cardiovascula básicopesquisa r, resultando em novas terapias para o tratamento de doenças cardiovasculares.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

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References

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