एक नैनोमीटर सटीकता के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग (फियोना)

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Biology

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Summary

एकल fluorophores फियोना का उपयोग नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है. यहाँ फिओना तकनीक का सारांश सूचना दी, और कैसे फिओना प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए वर्णित है.

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Wang, Y., Cai, E., Sheung, J., Lee, S. H., Teng, K. W., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA). J. Vis. Exp. (91), e51774, doi:10.3791/51774 (2014).

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Abstract

एक नैनोमीटर सटीकता (फियोना) के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग XY विमान में नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ ही fluorophores स्थानीयकृत के लिए एक सरल लेकिन उपयोगी तकनीक है. यहाँ फिओना तकनीक का सारांश सूचना दी है और फिओना का उपयोग किया गया है कि अनुसंधान के उदाहरण संक्षेप में वर्णन किया गया हैं. सबसे पहले, कैसे प्रकाशिकी aligning पर विवरण के साथ यानी फिओना प्रयोगों, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM), के लिए आवश्यक उपकरण स्थापित करने के लिए, वर्णित है. तो कैसे एक क्वांटम डॉट के साथ लेबल एक भी छोटा कर दिया मायोसिन- Va मोटर की 36 एनएम कदम आकार को मापने के लिए फियोना के उपयोग के बाद उचित प्रोटोकॉल का उपयोग immobilized Cy3 डीएनए एकल अणुओं स्थानीयकृत पर एक सरल फिओना प्रयोग बाहर ले जाने के लिए, यह साफ है. अन्त में, मोटी नमूने लिए फियोना के आवेदन का विस्तार करने के लिए हाल के प्रयास की सूचना दी है. > (यह एक पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर, कि दिखाया गया है और क्वांटम डॉट्स प जैल और खरगोश आंख कॉर्निया में गहरी लथपथ200 माइक्रोन), 2-3 एनएम का स्थानीयकरण परिशुद्धता प्राप्त किया जा सकता है.

Introduction

1882 के आसपास, अर्न्स्ट अब्बे एक दृश्य प्रकाश माइक्रोस्कोप का संकल्प है कि पाया ~ λ / 2NA, (λ तरंगदैर्ध्य है और एनए संख्यात्मक एपर्चर है) 1,2 ~ 200 एनएम या. इसलिए इस आयाम की तुलना में छोटे किसी भी वस्तु एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में एक विवर्तन सीमित स्थान के रूप में प्रकट होता है. हालांकि, यह एक बहुत उच्च परिशुद्धता 3 के साथ है, उस स्थान का केंद्र, वस्तु का स्थान निर्धारित करने के लिए संभव है. एक नैनोमीटर सटीकता (फियोना) के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग XY विमान 4 में नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ ही fluorophores स्थानीयकृत के लिए एक सरल लेकिन उपयोगी तकनीक है. स्थानीयकरण की शुद्धता, σ μ (यानी, मतलब की मानक त्रुटि),, एकत्र फोटॉनों की कुल संख्या पर निर्भर करता है समीकरण 1 एन फोटॉन गिनती है, जहां, एस फ्लोरोसेंट मौके का मानक विचलन है, एक हैपिक्सेल इमेजिंग डिटेक्टर के आकार, और बी पृष्ठभूमि 3,4 का मानक विचलन है. ~ 10,000 फोटॉनों उत्सर्जन एक फ्लोरोफोरे के लिए, फिओना ~ 1 एनएम परिशुद्धता 4 प्राप्त कर सकते हैं.

फियोना सही रूप में एक स्थिर emitter की स्थिति, या (काफी तेजी से ले जाया जा सकता है छवियों संभालने) एक चलती एक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फियोना फिल्म के फ्रेम करने के लिए क्रमिक रूप से लागू किया है और इस तरह एक अणु 4 8 की गति को ट्रैक किया जा सकता है. फोटो सुरक्षात्मक अभिकर्मकों नमूना photodegrade नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट वस्तु ही किसी भी आकार का हो सकता है, limit- जैसे विवर्तन से छोटा या बड़ा, यह अपनी झिल्ली पर छितरी कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक organelle (~ 1 माइक्रोन) से मिलकर कर सकते. फियोना अभी भी अपनी औसत केंद्र की जन की एक बहुत ही सटीक (नैनोमीटर) औसत उपज कर सकते हैं. फियोना ने स्थानीयकरण परिशुद्धता में काफी सुधार nanome को हल करने की अनुमति देता हैसमय के साथ आतंकवाद पैमाने पर आंदोलनों. इस आणविक लंबाई पैमाने 4 8 में माइक्रोस्कोपी धक्का दिया गया है.

अपने आविष्कार के बाद से, फिओना के संस्करण विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र एक नैनोमीटर सटीकता (bFIONA) 9, फिओना के एक मामूली संस्करण, छवियों के साथ इमेजिंग और प्रेषित प्रकाश के साथ इस तरह melanosomes में विवो (वर्णक मेलेनिन युक्त अंधेरे वस्तुओं) के रूप में घने वस्तुओं localizes. इसके अलावा, फिओना कई रंगों को हल करने के लिए नियोजित किया गया है. उदाहरण के लिए, photobleaching (झींगा) के साथ एकल अणु उच्च संकल्प इमेजिंग 10,11 या एकल अणु उच्च संकल्प colocalization (SHREC) 12 के बारे में 10 एनएम के भीतर दो रंगों को हल करने के लिए विकसित किया गया है. (यह संकल्प है कि एक अलग समान रंगों बता सकते हैं कि कैसे सही ढंग से यानी, नोटिस.) हाल ही में, फिओना विश्लेषण कुछ सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का स्थानीयकरण प्रक्रिया में योगदान दिया है ऐसे stochastic ऑप्टिकल सिफारिश के रूप मेंnstruction माइक्रोस्कोपी (तूफान) 13 15 और अस्थायी अंधेरे fluorophores उत्साहित कर रहे हैं, और उसके बाद प्रतिदीप्ति स्थानीयकृत है जिसमें फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) 16,. बार बार रोमांचक एक काफी कम रंगों के घनत्व (कम से कम एक प्रति विवर्तन सीमित स्थान), और फिर फियोना ने उनमें से प्रत्येक का विश्लेषण, प्रतिदीप्ति इकट्ठा करके, एक एक उच्च संकल्प के नक्शे का निर्माण कर सकते हैं. संकल्प तो सिर्फ एक डाई बाहर डालता फोटॉनों की संख्या है, साथ ही अधिग्रहण के दौरान (जैसे सहित, खुर्दबीन मंच) नमूना स्थिर रखने की तरह बातें द्वारा सीमित है.

इस पत्र में, एक फिओना तकनीक का सारांश और संक्षेप में फियोना बताया जाता है का उपयोग किया गया है कि अनुसंधान के उदाहरण का वर्णन. सबसे पहले, कैसे प्रकाशिकी aligning पर विवरण के साथ यानी फिओना प्रयोगों, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM), के लिए आवश्यक उपकरण स्थापित करने के लिए, वर्णित है. तो फिर कैसे करने के लिएउचित प्रोटोकॉल का उपयोग immobilized Cy3 डीएनए एकल अणुओं स्थानीयकृत पर एक सरल फिओना प्रयोग के लिए बाहर ले, यह साफ है. उसके बाद, फिओना का उपयोग एक क्वांटम डॉट के साथ लेबल एक भी छोटा कर दिया मायोसिन- Va मोटर की 36 एनएम कदम आकार को मापने के लिए प्रस्तुत किया है. मायोसिन- Va एक्टिन तंतु साथ translocating जबकि सेलुलर कार्गो किया जाता है जो एक आवश्यक processive मोटर प्रोटीन है. यहाँ Va छोटा निर्माण एक मायोसिन- कदम आकार के लिए अप्रासंगिक डोमेन हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक झंडा टैग सी टर्मिनस के लिए जोड़ा साथ विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ functionalized क्वांटम डॉट्स के साथ लेबलिंग की आसानी अनुमति देने के लिए. इस प्रयोग मायोसिन- धीमा और हर फ्रेम में एक अच्छा फोटॉन गिनती पाने के लिए काफी लंबे समय जोखिम बार के उपयोग की अनुमति के लिए कम एटीपी के तहत किया जाता है. किसी भी पर्याप्त उज्ज्वल फ्लोरोसेंट लेबल निम्नलिखित प्रोटोकॉल में प्रतिस्थापित किया जा सकता है. अन्त में, मोटी नमूने लिए फियोना के आवेदन को विस्तार देने के हाल के प्रयास की सूचना दी है. एक सबूत की सिद्धांत रूप में, क्वांटम डॉट्स लथपथ थेप जैल और खरगोश आंख कॉर्निया में और फिर imaged और फियोना का उपयोग स्थानीयकृत. इमेजिंग के लिए, एनए के साथ एक 60x पानी विसर्जन उद्देश्य इस उद्देश्य पहले से इस्तेमाल किया 100X तेल विसर्जन उद्देश्य से एक लंबी दूरी काम है क्योंकि 1.2 इस्तेमाल किया गया था =. उद्देश्य में बढ़ाई में नुकसान की भरपाई करने के लिए, एक अतिरिक्त बढ़ाई लेंस (3.3x या 4.0X) उत्सर्जन पथ में डाला गया था. इसके अलावा, महामारी प्रतिदीप्ति (नहीं TIR) माइक्रोस्कोपी मोटी नमूनों में गहरी क्षेत्रों तक पहुँचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह प जैल में और 2-3 एनएम परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता खरगोश आंख कॉर्निया (जेड> 200 माइक्रोन) में गहरी लथपथ कि क्वांटम डॉट्स दिखाया गया है.

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Protocol

आचार विवरण: खरगोश से कॉर्निया ऊतक इलिनोइस संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के विश्वविद्यालय के अनुसार एकत्र किया गया था.

1 TIRFM सेटअप

नोट: लेजर सुरक्षा चश्मे सभी समय पहनें.

  1. माल की सूची में सूचीबद्ध सभी आवश्यक ऑप्टिकल घटकों उपलब्ध और संरेखण के लिए तैयार कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. यदि आवश्यक हो, अन्य कंपनियों से बराबर कार्यों के साथ के विकल्प का उपयोग करें. दर्पण और लेंस प्रयोग में लेजर मिलान विरोधी चिंतनशील (एआर) कोटिंग्स होना चाहिए कि यह सुनिश्चित करें.
  2. माइक्रोस्कोप वापस बंदरगाह के केंद्र की ऊंचाई करने के लिए सभी ऑप्टिकल घटकों की ऊंचाई निर्धारित करें.
  3. लेजर, लेजर शटर और एन डी फिल्टर (ओं) माउंट. दिखाई किरण रखते हुए यथासंभव कम लेजर शक्ति नीचे attenuate करने के लिए एन डी फिल्टर का प्रयोग करें. उचित हेक्स कुंजी के साथ शिकंजा कस.
  4. एक किरण पथ योजना और ऑप्टिकल टेबल पर टेप या मार्कर (डॉट के साथ यह चिह्नचित्रा 1 में टेड नीली लाइनों). सादगी के लिए, ऑप्टिकल मेज पर छेद की तर्ज पर सीधे रास्ते रखना.
  5. प्लेस दर्पण एम 1 पहले सही कोण मोड़ पर (चित्रा 1). योजना बनाई किरण पथ के दूसरे सीधे खंड के किनारे दो irises रखें. स्थिति और लेजर irises के माध्यम से चला जाता है कि इस तरह के एम 1 के झुकाव दोनों को समायोजित करें.
  6. प्लेस दर्पण M2 दूसरा सही कोण मोड़ पर (चित्रा 1). पथ के तीसरे खंड साथ 10X किरण विस्तारक (एल 1 और एल 2, चित्रा 1) रखें. किरण विस्तारक ऑप्टिकल तालिका और योजना बनाई किरण पथ दोनों के समानांतर है कि अपने झुकाव इस तरह समायोजित करें.
    1. लेजर बीम विस्तारक के दोनों लेंस के केन्द्रों के माध्यम से straightly चला जाता है कि एम 1 और M2 iteratively ऐसे समायोजित करें. विस्तारित किरण की बीम प्रोफाइल गाऊसी गैर काटा गया है जब तक इस चरण को दोहराएँ.
  7. (एल 1 पर किरण केंद्रित करने के लिए फाई एम 1 समायोजितgure 1) और M2 iteratively L2 पर किरण (चित्रा 1) केंद्र के लिए. एक बुरा बीम प्रोफाइल आमतौर पर लेजर काटा गया है इसका मतलब है; आँखों से बीम प्रोफाइल की जाँच करने के लिए बीम विस्तारक के बाद किरण को ब्लॉक करने के लिए सफेद कागज के एक टुकड़े का उपयोग करें. उच्च परिशुद्धता के विश्लेषण के लिए, एक ऑप्टिकल बीम Profiler का उपयोग करें.
  8. बीम collimated है कि इस तरह के एल 1 और एल 2 के बीच की दूरी को समायोजित करें. दोहराने कदम 1.8 और 1.9 यदि आवश्यक हो तो.
    नोट: किरण आकार दूरी के साथ नहीं बदलता है, जब किरण एक TIRFM स्थापना के लिए पर्याप्त collimated है. आगे बीम संधान में सुधार करने के लिए, इस तरह के एक बाल काटना interferometer रूप में उपकरणों का इस्तेमाल किया जा सकता है. विस्तार के बाद एक ठेठ बीम आकार ~ 20 मिमी है.
  9. लेजर शटर. खुर्दबीन उद्देश्य खोलना और एक फ्लोरोसेंट संरेखण लक्ष्य में पेंच. प्लेस एम 3 और M4 (चित्रा 1) माइक्रोस्कोप पोर्ट में और बुर्ज अंदर dichroic दर्पण पर विस्तार बीम निर्देशित करने के लिए दर्पण. लेजर बीम टी बंद bounces सुनिश्चित करें किवह dichroic और छत की ओर.
  10. फ्लोरोसेंट लक्ष्य पर किरण के प्रतिभाशाली हिस्सा केंद्र के लिए एम 3 समायोजित करें, और एम 4 बीम झुकाव खड़ी होने के लिए समायोजित करने के लिए.
  11. लेजर शटर और पीठ में उद्देश्य पेंच. पिछले चरण में संरेखण किया जाता है, तो अच्छी तरह से उद्देश्य बाहर निकलने एक सममित जगह नहीं होनी चाहिए. ठीक धुन एम 3 और M4 के tilts उद्देश्य से बाहर लेजर शक्ति और बीम प्रोफाइल अनुकूलन करने के लिए.
  12. माइक्रोस्कोप के लिए एक EMCCD कैमरा माउंट और एक कंप्यूटर के लिए कैमरा कनेक्ट. कैमरे के लिए सॉफ्टवेयर शुरू करो.
  13. माइक्रोस्कोप पर एक फ्लोरोसेंट नमूना (fluorophores के समाधान) माउंट. कैमरे पर उज्ज्वल फ्लोरोसेंट जगह को देखो. फोकस बदल जाता है के रूप में जगह स्क्रीन पर बदलाव नहीं करता है कि जाँच करें.
  14. L3 की फोकल लंबाई (~ 30 सेमी) के बराबर है, जो उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ से एक दूरी पर XYZ अनुवाद मंच पर TIR लेंस (L3, चित्रा 1) रखें. L3 की स्थिति को समायोजितऐसी लेजर लेंस के केन्द्र के माध्यम से चला जाता है.
  15. किरण संधान समायोजित करने के लिए बीम मार्ग के किनारे L3 अनुवाद करें. किरण अभी भी नजर रखने पर केंद्रित है और आकार में सममित है कि सुनिश्चित करें.
    नोट: TIR लेन्स की फोकल लंबाई में कमी के साथ नमूना विमान बढ़ जाती है पर रोशनी क्षेत्र. सामान्य तौर पर, सेट अप पर फिट सकता है कि छोटी से छोटी फोकल लंबाई का उपयोग करें.
  16. उद्देश्य के बाहर बीम झुकाव किरण पथ को सीधा L3 अनुवाद करें. TIR हासिल की है कि इस तरह के TIR लेंस का अनुवाद रखें. अच्छा SNR पाने के लिए EMCCD कैमरा, और ठीक धुन L3 के माध्यम से फ्लोरोसेंट मोतियों का एक नमूना निरीक्षण.

चित्रा 1
कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के लिए 1 ऑप्टिकल विन्यास चित्रा.

Cy3 डीएनए पर 2 फिओना

  1. सीदुबला खुर्दबीन स्लाइड और coverslips: DDH 2 हे और isopropanol साथ खुर्दबीन स्लाइड और coverslips कुल्ला और नाइट्रोजन गैस के साथ उन्हें सूखी; आर्गन प्लाज्मा के तहत 5 मिनट के लिए प्लाज्मा क्लीनर में स्लाइड और coverslips जगह है.
  2. (चित्रा 2 में sketched के रूप में) नमूना कक्षों का निर्माण.
    1. बेंच पर एक ऊतक प्लेस और फिर ऊतक के शीर्ष पर लेंस कागज का एक टुकड़ा डाल दिया. लेंस कागज पर स्लाइड रखें. स्लाइड की साफ ओर ऊपर की तरफ है कि सुनिश्चित करें.
    2. केन्द्र में 3-5 मिमी के अंतराल छोड़ने, लंबी किनारों के साथ स्लाइड पर डबल पक्षीय टेप के दो स्ट्रिप्स लागू करें. स्लाइड के शीर्ष पर साफ coverslip जगह. Coverslip के स्वच्छ ओर स्लाइड का सामना करना पड़ रहा है कि सुनिश्चित करें.
    3. दो तरफा टेप पर नीचे प्रेस करने के लिए एक विंदुक टिप का उपयोग करें. टेप केवल coverslip के तहत बनी हुई है कि इतने स्लाइड से अतिरिक्त टेप को दूर करने के लिए एक रेजर का प्रयोग करें.
      नोट: चैंबर के खुले सिरों को खुला छोड़ दिया और के रूप में प्रवेश और बाहर की सेवा कर रहे हैंचलो. चैम्बर मात्रा कई microliters है.

चित्रा 2
एक ठेठ नमूना कक्ष की चित्रा 2 स्केच (क) ऊपर देखें. (ख) सही से साइड दृश्य; सामने से (ग) साइड देखें.

  1. नमूना कक्षों की भीतरी सतहों पर Cy3 डीएनए स्थिर.
    1. टी 50 बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल 8.0 पीएच, 50 मिमी NaCl) तैयार करें. 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में टी 50 में बीएसए बायोटिन तैयार करें. 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में टी 50 में बीएसए भंग करके T50-BSA बफर तैयार करें.
    2. 0.5 मिलीग्राम / T50-BSA बफर में मिलीलीटर neutravidin तैयार करें. 5-10 बजे के अंतिम एकाग्रता में biotinylated Cy3 लेबल डीएनए T50-BSA में (Cy3 डीएनए) तैयार करें.
    3. नमूना कक्ष में पिपेट 10 μl बीएसए बायोटिन (1 मिलीग्राम / एमएल). 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
    4. 40 μl T50-बीएसए के साथ चैम्बर धो लें. नमूना कक्ष में पिपेट 20 μl Cy3 डीएनए. 5 मिनट के लिए सेते हैं और फिर 80 μl T50-बीएसए के साथ चैम्बर धो लो.
  2. छवि Cy3 डीएनए TIRFM तहत एकल अणुओं.
    1. 50 μl 6-hydroxy-2,5,7,8-, 1 μl Protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD, 5 माइक्रोन), 4 μl Protocatechuic एसिड (पीसीए, 62.5 मिमी) के मिश्रण से इमेजिंग बफर (100 μl) तैयार करें tetramethylchromane-2-कार्बोक्जिलिक एसिड (टी 50 में Trolox, 2 मिमी), और 45 μl T50-बीएसए.
    2. और 30 μl इमेजिंग बफर में पिपेट 8-10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
    3. एक हरे रंग की लेजर (532 एनएम) के साथ सुसज्जित है कि एक TIRFM पर इमेजिंग के लिए नमूना माउंट, एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य (1.45 एनए), और एक EMCCD कैमरा.
    4. 1,0 के लिए नमूना की एक फिल्म मोल 100 के लिए 100 से 500 मिसे और 25 के लिए उन्हें हासिल करने के लिए जोखिम समय सेट करें00 तख्ते.
  3. Cy3 डीएनए की दर्ज की छवियों पर फियोना डेटा विश्लेषण प्रदर्शन.
    1. प्रभावी पिक्सेल आकार का निर्धारण (यानी, नैनोमीटर पिक्सल से रूपांतरण कारक) शारीरिक पिक्सेल आकार विभाजित करके कुल बढ़ाई (किसी अतिरिक्त आवर्धन से गुणा खुर्दबीन उद्देश्य से बढ़ाई) से (EMCCD कैमरे का विवरण पत्र से पढ़ें).
    2. सीसीडी संवेदनशीलता छवि अधिग्रहण के दौरान प्रयोग किया जाता है (यानी, सीसीडी कैमरे का विवरण पत्र से पढ़ा ए / डी गिनती, प्रति इलेक्ट्रॉनों) इलेक्ट्रॉन गुणक द्वारा (ईएम) लाभ विभाजित करके संख्या फोटॉन के लिए पिक्सेल तीव्रता से रूपांतरण कारक निर्धारित करते हैं.
    3. संकलित करें और फिओना विश्लेषण के लिए FIONA.pro चलाते हैं. इनपुट (चरण 2.5.1) से प्रभावी पिक्सेल आकार और (चरण 2.5.2 से) फोटोन संख्या को तीव्रता से रूपांतरण कारक को हासिल कर लिया छवि आयात करने के लिए इस आईडीएल प्रोग्राम का उपयोग करें, और फिओना विश्लेषण के लिए स्थानों को चुनने के लिए.
      नोट: अंत में, कार्यक्रममीटर उत्पादन होगा 2D गाऊसी काम करता है, और साथ ही कुल फोटोन नंबर और स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ फिटिंग का परिणाम है. एक ठेठ परिणाम प्रतिनिधि परिणाम और आंकड़े 4C-4D के खंड में दिखाया गया है.
    4. संकलित करें और फोटोन गिनती चिह्नित करने phcount.pro चलाते हैं. (चरण 2.5.2 से) फोटोन संख्या को तीव्रता से प्राप्त छवि और निवेश करने के लिए रूपांतरण कारक आयात करने के लिए, photobleaching से पहले एक फ्लोरोफोरे द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों की औसत संख्या को मापने के लिए इस आईडीएल प्रोग्राम का उपयोग करें.
      नोट: कार्यक्रम तो, (मैनुअल चयन एक विकल्प है) स्वतः फ्लोरोसेंट स्पॉट का पता लगाने के एक फ्रेम संख्या के समारोह, और आउटपुट के रूप में फोटोन गिनती के निशान फोटोन मायने रखता गणना करेगा.
      1. बुरा निशान त्यागें और आधारभूत सुधार के लिए photobleaching के बाद फ्रेम पर्वतमाला निर्दिष्ट. अंत में, कार्यक्रम उत्पादन सभी स्थानों के लिए कुल फोटॉन नंबरों की सूची नहीं त्याग देगा. फिर फोटोन संख्या का वितरण साजिश और वितरण फिटएक घातीय क्षय के साथ tion औसत फोटोन नंबर प्राप्त करने के लिए. एक ठेठ परिणाम प्रतिनिधि परिणाम की धारा में दिखाया गया है और 4E-4F आंकड़े है.

3 फिओना एप्लाइड नैनोमीटर स्तर पर मोटर (जैसे, actin पर मायोसिन) गतिशीलता यों

  1. Actin भाजन फिओना प्रयोग से पहले एक दिन (यानी एफ actin तैयार).
    1. सामान्य actin के बफर के साथ मिलीलीटर 10 मिलीग्राम / जी actin (monomer) और बायोटिन जी actin (monomer) पुनर्गठित. दोनों पूरी तरह से भंग कर रहे हैं सुनिश्चित करें, और बर्फ पर दोनों रखने के लिए हलचल.
    2. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 1.7 μl बायोटिन जी actin के साथ 10 μl जी actin (monomer) मिलाएं. 100 μl बर्फ ठंड actin polymerization बफर जोड़ें.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात मिश्रण छोड़ दो (एफ actin का गठन) और फिर 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा को DDH 2 हे जोड़ें.
    4. प्रयोगों में बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक्टिन तंतु (एफ actin) की दुकान.
      नोट: फिलामेंट्स बिखर और समय के साथ छोटा, लेकिन कम से कम दो सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता होगा.
  2. इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करें.
    1. (प्रोटोकॉल 2.1 और 2.2 में वर्णित के रूप में) एक नमूना कक्ष बनाओ. DDH 2 ओ में 1 मिलीग्राम / एमएल पर बीएसए biotinylated 20 μl में पिपेट 10 मिनट के लिए सेते हैं. 30 μl DDH 2 ओ के साथ कुल्ला
      नोट: इस ब्लॉक कांच की सतह और actin filaments के बंधन के लिए बायोटिन नीचे देता है. Biotinylated पाली एल Lysine - पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीएलएल खूंटी) एक ही समारोह में सेवा कर सके.
    2. 0.5 मिलीग्राम / एमएल neutravidin में पिपेट. 2 मिनट के लिए सेते हैं और फिर 30 μl M5 बफर के साथ चैम्बर धो लो.
    3. तैयार एफ actin में पिपेट अंतिम एकाग्रता ~ 0.004 मिलीग्राम / एमएल के लिए, सामान्य actin के बफर में 25 गुना पतला. , 10 मिनट रुको 30 μl बफर के साथ चैम्बर कुल्ला.
    4. एक अंतिम एकाग्रता ओ M5 बफर (20 ​​मिमी HEPES (पीएच 7.6), 2 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी KCl, 1 मिमी EGTA) में झंडा टैग के साथ 30 गुना Va मायोसिन पतलाएफ 250 एनएम. (निर्माता से निर्देश पुस्तिका के अनुसार Qdot705 एंटीबॉडी संयुग्मन किट का उपयोग कर विरोधी झंडा एंटीबॉडी और Qdot705 से संयुग्मित ~ 1 माइक्रोन,) 1 μl विरोधी झंडा Qdot705 साथ 1 μl मायोसिन- मिलाएं. 10 μl को भरने के लिए 8 μl M5 में जोड़ें. ऊपर पिपेट और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए. बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
      नोट: यह ~ 25 एनएम मायोसिन- एकाग्रता में, 1 मोटर 4 को क्वांटम डॉट्स का एक मिश्रण पैदावार.
  3. Actin पर चलने मायोसिन- की इमेजिंग.
    1. मिश्रण से इमेजिंग बफर (100 μl) तैयार 84 μl M5-बीएसए (1 मिलीग्राम के साथ M5 बफर / एमएल बीएसए), 1 μl एटीपी (DDH 2 ओ में 50 माइक्रोन), 2 μl डीटीटी (500 मिमी DDH 2 ओ में), 1 μl सीके (500 यू / एमएल), 5 μl सीपी (200 मिमी), 1 μl PCD, 4 μl पीसीए, 1 μl मायोसिन- Qdot के बाद 2.5 एनएम मायोसिन- एकाग्रता, और 1 μl बीएमई के लिए एक और 10 गुना पतला.
    2. 20 μl इमेजिंग बफर में पिपेट चेंबर नमूना और 8-10 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. छवि टी पर नमूना30 मिसे जोखिम पर आईआरएफ माइक्रोस्कोप. कम से कम 1,000 फ्रेम मोल. यदि आवश्यक कदम 3.3.1 में मायोसिन- Qdot की मात्रा समायोजित करें.
  4. डेटा विश्लेषण प्रदर्शन और मायोसिन- चलने के कदम आकार पाते हैं.
    1. ImageJ 17 में वीडियो फ़ाइल को खोलें और एक चलती स्थल के आसपास वीडियो फसल. स्थान कभी नहीं बढ़त के 20 पिक्सल के भीतर हो जाता है कि एक बड़ा पर्याप्त क्षेत्र फसल, और वीडियो में कोई अन्य स्थानों रहे हैं सुनिश्चित करें. इस मौके एक रेखीय पथ में आगे बढ़ रहा है कि सुनिश्चित करें.
    2. एक्स उत्पन्न करने के लिए वीडियो के माध्यम से जगह ट्रैक और वाई प्रत्येक और वीडियो के हर फ्रेम को फियोना विश्लेषण (चरण 2.5.3) को लागू करने से, पिक्सल में समय के माध्यम से समन्वय करता है.
    3. पिछले भाग में वर्णित है, नैनोमीटर पिक्सल कन्वर्ट.
    4. समय के एक समारोह के रूप में प्रारंभिक स्थिति से विस्थापन की गणना.
    5. मायोसिन- चलने के इस कदम को प्राप्त करने के विस्थापन पर टी परीक्षण चलाएँ.
      नोट: टी परीक्षण (step_t_test.zip) के लिए प्रदान कार्यक्रम आईडीएल और चुनाव में कोडित हैफ़ोल्डर में 14 सबरूटीन्स के sists.
      1. आईडीएल में सबरूटीन्स के सभी खुले और दो बार सभी संकलन. फिर mtltyanalysis_ttest.pro चलाने के लिए और एक एकल स्तंभ में केवल दूरी डेटा युक्त एक पाठ फ़ाइल का चयन करें. एक उत्पादन एक्सेल फाइल कच्चे डेटा, फिट, और कदम आकार युक्त उत्पन्न हो जाएगा.
    6. कदम आकार के स्तंभ से सब शून्य मान हटाएं. उत्पत्ति या MATLAB का उपयोग कदम आकार के वितरण प्लॉट. हिस्टोग्राम एक गाऊसी फिट.
      नोट: शून्य से एक कदम कोई कदम पिछले फ्रेम से लिया जाता है कि क्योंकि इसका मतलब शून्य मूल्यों के कदम आकार हटाए जाने की जरूरत है. (चित्रा 5 में दिखाया गया है) फिटिंग 36 एनएम के चारों ओर एक शिखर देता है.

फियोना के लिए 4 मोटा नमूना तैयार

  1. प जेल में समझाया क्वांटम डॉट्स तैयार करें.
    1. मिक्स 4.5 मिलीलीटर TMOS, 1 मिलीलीटर DDH 2 हे और 100 μl एचसीएल (120 मिमी). अल्ट्रासोनिक क्लीनर सपा में 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण Sonicateमाल की सूची में ecified (आवृत्ति = 40 किलोहर्ट्ज़, हीटर बंद =). समाधान के लिए हर 10 मिनट मिश्रण.
    2. 1.5 मिलीलीटर HEPES (50 मिमी 7.2 पीएच) में 1.5 μl Qdot605 पतला. पिछले चरण से 1.5 मिलीलीटर TMOS साथ समाधान मिलाएं.
    3. एक गिलास नीचे डिश में मिश्रण डालो. 1 5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गिलास नीचे Parafilm के साथ पकवान और दुकान सील.
    4. नमूना पकवान पीबीएस में 2 मिलीलीटर 1% BME जोड़ें और इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  2. क्वांटम डॉट्स के साथ दाग कॉर्निया नमूना तैयार करें.
    नोट: खरगोश की आंखें डॉ मरीना Marjanovic से उपहार थे.
    1. आंखों से कॉर्निया को अलग और 3 मिमी x 3 मिमी टुकड़ों में काट लें.
    2. पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 1 μl Qdot 605-streptavidin पतला. 4 में 1 एनएम Qdots समाधान के साथ कॉर्निया ऊतक सेते 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस. पीबीएस के साथ ऊतक धो लें.
    3. एक साफ कांच स्लाइड और एक # 1.5 coverslip लो. , अब पक्ष के साथ कांच स्लाइड पर दो तरफा टेप के 4 परतों रखो एकND पिछले टेप करने के लिए दो तरफा टेप समानांतर का एक और 4 परतों डाल दिया और बीच में 1 सेमी के बारे में एक चैनल छोड़ दें. चैनल के बीच में पिछले चरण से ऊतक रखो, और एक coverslip के साथ कवर.
    4. धीरे coverslip के किनारों पर प्रेस इसे टेप करने के लिए छड़ी बनाने के लिए. इमेजिंग से पहले 50 μl पीबीएस के साथ चैनल गीले.
  3. प जेल और कॉर्निया में छवि क्वांटम डॉट्स.
    1. मोटी नमूनों में फियोना इमेजिंग के लिए, 0.27 मिमी, या 0.28 मिमी की दूरी काम करने के साथ एक 60X पानी विसर्जन उद्देश्य की दूरी काम करने के साथ एक 60X पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें.
    2. खुर्दबीन पर नमूना माउंट. यह महामारी प्रतिदीप्ति मोड तक पहुँच जाता है कि इस तरह के TIRF लेंस समायोजित (यानी लेजर बीम coverslip के खिलाफ एक कोण के साथ उद्देश्य से बाहर आता है). एक अतिरिक्त बढ़ाई लेंस (3.3x या 4.0X) डालें.
    3. एक वांछित Z स्थिति (जैसे> 200 माइक्रोन) के उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ पर ले जाएँ. स्थिर की छवियों को रिकार्डनमूने में क्वांटम डॉट्स.
  4. इस प्रोटोकॉल की धारा 2.5 में वर्णित के रूप में फियोना विश्लेषण प्रदर्शन.

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Representative Results

एक ठेठ उद्देश्य प्रकार TIRFM सेटअप चित्रा 3 में दिखाया गया है. पहले, सतह immobilized Cy3 डीएनए नमूना उतारी थी. एक ठेठ छवि चित्रा -4 ए में दिखाया गया है. छवि ईएम लाभ = 50 और सीसीडी संवेदनशीलता = कैमरे के लिए 12.13 के साथ, जोखिम समय के साथ 0.5 सेकंड लिया गया था. एक भी Cy3 डीएनए अणु की बात फैल समारोह (पीएसएफ) चित्रा 4 बी में दिखाया गया है रंग बार पिक्सेल तीव्रता के पैमाने से पता चलता है जहां, (चित्रा -4 ए में तीर द्वारा संकेत मौके से). वास्तविक फोटान मायने रखता है एक रूपांतरण कारक, α = सीसीडी संवेदनशीलता / ईएम लाभ द्वारा पिक्सेल तीव्रता गुणा करके गणना की जा सकती है. इस मौके (पृष्ठभूमि के लिए सुधार के बाद) लगभग 14,000 फोटॉनों शामिल हैं.

(एक्स μ एक्स) 2 / (2s एक्स 2) - (- वाई - & # पीएसएफ तो एक दो आयामी गाऊसी समारोह च (एक्स, वाई) = Z 0 + एक · ऍक्स्प (साथ फिट है181; y) 2 / (2s वाई 2)), चित्रा 4D में दिखाया फिटिंग बच) के साथ (चित्रा 4C में दिखाया गया है. स्थानीयकरण की सटीक फिर से गणना की है 2 समीकरण मैं = एक्स या वाई, मैं फिटिंग का मानक विचलन है, जहां, एन कुल फोटोन नंबर एक पिक्सेल आकार है, और बी पृष्ठभूमि का मानक विचलन है, है. इस विशिष्ट उदाहरण में, एन = 14528, एक = 106.67 एनएम, एक्स = 115.5 एनएम है, एस वाई 109.4 एनएम =, बी = 18.9, σ का स्थानीयकरण precisions एक्स = 1.3 एनएम और σ वाई = 1.2 एनएम में जिसके परिणामस्वरूप. एक फ्लोरोफोरे का स्थानीयकरण परिशुद्धता यानी 1 / √N, लगभग आनुपातिक है, अधिक फोटॉनों हैं, और अधिक सटीक स्थानीयकरण है. हालांकि, फियोना की वास्तविक अनुप्रयोगों में, प्रयोगात्मक अवलोकन की अवधि एक और विचार है. इसलिए एकसामान्य में स्थानीयकरण परिशुद्धता और प्रेक्षण अवधि और आगे की योजना के बीच tradeoff का एहसास होना चाहिए. ऐसी स्थितियों में, यह कुल में एक fluorophore photobleaching से पहले फेंकना करने में सक्षम है कि कितने फोटॉनों निर्धारित करने के लिए आम तौर पर उपयोगी है. फ्रेम बनाम फोटॉन गिनती का एक विशिष्ट ट्रेस चित्रा 4E में दिखाया गया है. एक घातीय फिटिंग देता है कि औसत फोटोन संख्या ~ 1.4 x 10 6 (चित्रा 4F).

मायोसिन- कदम आकार के माप का डेटा विश्लेषण प्रक्रिया चित्रा 5 में दिखाया गया है. पहले, अच्छा संकेत करने वाली शोर यह चलता है के रूप में एक भी मायोसिन- के साथ एक वीडियो फ़ाइल एक actin रेशा कब्जा कर लिया है साथ. चित्रा 5A एक वीडियो से तीन फ्रेम से पता चलता है 100X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ 100 मिसे जोखिम में ले लिया. आगे बढ़ पीएसएफ तो एक टी परीक्षण के माध्यम से लगाया जाता है जो दूरी बनाम समय की जानकारी निकालने के लिए आईडीएल में लिखा एक कस्टम कोड का उपयोग कर फसली वीडियो फ़ाइल के माध्यम से पता लगाया हैकदम के लिए. समय (लाल) बनाम दूरी के साथ 5 ब से पता चलता है और उत्पादन (सफेद) की खोज करने के लिए कदम. यह एक स्थानीयकरण त्रुटि को कम एक देखना चाहता सैद्धांतिक कदम आकार की तुलना में आधे से मेल खाती है, जो हर फ्रेम में एक फोटान गिनती प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि प्रत्येक फ्रेम में स्थानीयकरण त्रुटियों का पता लगाने की सीढ़ी आकार obscures. 5C कई से कदम से पता चलता है निशान सच मायोसिन- कदम आकार के बारे में गाऊसी वितरित किया जाता है कि एक हिस्टोग्राम में संयुक्त. हिस्टोग्राम डिब्बे को एक गाऊसी फिट 35.8 ± 0.4 एनएम के अंतिम चरण के आकार माप पैदावार.

प जेल और कॉर्निया नमूने पारदर्शी होते हैं, क्योंकि उत्तेजना लेज़रों बहुत ज्यादा बिखरे हुए बिना नमूनों में गहरी पैठ कर सकते हैं. इसके अलावा, नमूना से ऑटो प्रतिदीप्ति कम से कम है. क्वांटम डॉट्स की कम एकाग्रता के साथ लेबल है, यह गहरी शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत के साथ नमूना में Qdots से प्रतिदीप्ति एकत्र करने के लिए संभव है.पानी उद्देश्य के उपयोग इसे दूर coverslip से जहाँ तक 280 के रूप में माइक्रोन ध्यान केंद्रित करना संभव है जिसका अर्थ है कि हमें 270 या 280 माइक्रोन का काम दूरी देता है. यह हमें मोटी नमूनों में क्वांटम डॉट्स पर फियोना विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है. एक प जेल नमूने में क्वांटम डॉट्स, coverslip के पास 1-2 एनएम और नमूना (आंकड़े 6A-6B) में 280 मीटर गहरे में 2-3 एनएम का स्थानीयकरण परिशुद्धता के लिए हासिल की है. एक जैविक नमूने में क्वांटम डॉट्स (एक खरगोश आँख से एक कॉर्निया का हिस्सा, चित्रा 6E), coverslip के पास 1-2 एनएम और 2-3 एनएम का स्थानीयकरण सटीकता के लिए नमूना में गहरी ~ 223 माइक्रोन पर (आंकड़े 6c-6D) हासिल की है. यह स्थानीयकरण परिशुद्धता 6-7 एनएम के एक स्थानीयकरण परिशुद्धता प्राप्त हुई थी जो बिना अतिरिक्त बढ़ाई लेंस का उपयोग करके सुधार किया है कि उल्लेख किया है. इस स्थानीयकरण परिशुद्धता ~ 200 से प्रभावी पिक्सेल आकार बदलकर सुधार किया जा सकता दिखा रहा है कि पिछले संख्यात्मक अध्ययन के साथ संगत हैएनएम ~ एकत्र फोटॉनों की कुल संख्या के कारण अतिरिक्त प्रतिबिंब / refractions 18 तक कम हो सकता है, भले ही 50 एनएम.

चित्रा 3
लेजर TIRF हालत में है और लेजर महामारी रोशनी में जब ख) छत पर लेजर बीम आकार है जब चित्रा 3 ऑप्टिकल विन्यास. कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के ऑप्टिकल विन्यास. एक) एक तस्वीर है.

चित्रा 4
स्थिर Cy3 डीएनए की चित्रा 4 स्थानीयकरण. एक) सीसीडी छवि Yel ने संकेत दिया Cy3 डीएनए. ख) एक एकल Cy3 डीएनए अणु के सीसीडी छवि का (256 x 256 पिक्सल)एक दो आयामी गाऊसी समारोह. डी) सी से फिटिंग बच). ई) के साथ एकल Cy3 डीएनए अणु की बात फैल समारोह फिटिंग एक). सी में कम तीर) फोटॉन फ्रेम संख्या बनाम गिनती. की एफ) वितरण photobleaching से पहले Cy3 अणु द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5 मायोसिन फियोना ने मनाया चल रहा है. एक) = 0 सेकंड, 30 सेकंड, और 60 सेकंड के लिए टी इसी उदाहरण डेटा फ़ाइल से तख्ते. मायोसिन- Qdot निर्माण हर फ्रेम में एक अच्छा फोटॉन गिनती (> 5000) एक सीधे मार्ग के किनारे में बढ़ रहा है और है. ख) फियोना के आवेदन प्रत्येक फ्रेम Yie कोLDS लाल में साजिश रची है, जो एक दूरी बनाम समय का पता लगाने. टी परीक्षण के आधार पर एक कदम ढूँढने एल्गोरिथ्म तो अलग अलग चरणों निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है, और उत्पादन सफेद में मढ़ा है. चरण आकार नैनोमीटर. ग) कई निशान से कदम एक हिस्टोग्राम में संयुक्त रहे हैं की इकाइयों में सफेद में चिह्नित कर रहे हैं. मापा कदम आकार गाऊसी वितरित बारे 35.8 ± 0.4 एनएम हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6 मोटी नमूनों में गहरी क्वांटम डॉट्स पर फियोना विश्लेषण. प जेल में QD 605 के) फ्लोरोसेंट छवि जेड 90X बढ़ाई. बी के साथ = 280 माइक्रोन) QD की बात फैल समारोह में) एक में चिह्नित. σ x = 2.6 एनएम, σ वाई 2.3 एनएम =. एक्स और वाई अक्ष में प्रत्येक इकाई QD की पीएसएफ) सी में चिह्नित 360X बढ़ाई. डी) के साथ जेड = 223 माइक्रोन पर खरगोश कॉर्निया के ऊतकों में QD 655 से 266.7 एनएम. ग) फ्लोरोसेंट छवि का प्रतिनिधित्व करता है. σ x = 2.2 एनएम, σ वाई 3.6 एनएम =. एक्स और वाई अक्ष में प्रत्येक इकाई में एक coverslip पर मुहिम शुरू की कॉर्निया के ऊतकों की 44.4 एनएम. ई) चित्र का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

फियोना 1 मिसे 4 से 8 नीचे नैनोमीटर परिशुद्धता और अस्थायी समाधान के साथ एक फ्लोरोसेंट emitter (जैविक फ्लोरोफोरे या क्वांटम डॉट) की स्थिति के लिए स्थानीय बनाना एक तकनीक है. पर्याप्त फोटॉनों एकत्र कर रहे हैं, इस तकनीक का बहुत अधिक सही विवर्तन सीमा (~ 200 एनएम) की तुलना में एक फ्लोरोसेंट emitter की स्थिति निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार इस तकनीक पारंपरिक / पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी 4 के साथ नहीं देखा गया है क्या निरीक्षण करने के लिए एक रास्ता खोलता है - 8. अपने आविष्कार के बाद से, फिओना सफलतापूर्वक myosins और kinesins के रूप में कई आणविक मोटर्स, से पैदल देख के लिए लागू किया गया है. हाल ही में, यह एक साथ अन्य काम 3,19 के साथ, इस तरह के तूफान और पाम 13 16 के रूप में कुछ उभरते सुपर संकल्प तकनीक का स्थानीयकरण प्रक्रिया में योगदान दिया.

फियोना को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम विभिन्न च से प्रभावित है जो एकत्र फोटॉनों की संख्या में निहितअभिनेताओं. उदाहरण के लिए, फिओना प्रयोगों के लिए इस्तेमाल TIRFM सेटअप अच्छी तरह से एक अच्छा पीएसएफ (यानी आदि, नहीं-लांछित, बढ़ाकर नहीं) हासिल की है और एक उचित संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त की है कि इस तरह के गठबंधन किया जाना चाहिए. इसके अलावा, एक उच्च एनए मूल्य के साथ एक उद्देश्य के रूप में संभव के रूप में कई फोटॉनों एकत्र करने के क्रम में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

स्थानीयकरण परिशुद्धता बढ़ाने के लिए इस प्रकार अधिक फोटॉनों इकट्ठा करने और करने के लिए, विभिन्न ऑक्सीजन मेहतर तरीकों और अभिकर्मकों photobleaching और 20 22 निमिष दबाने के लिए पता लगाया गया है. दो अलग ऑक्सीजन सफाई तरीकों हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया है. एक "gloxy" समाधान (ग्लूकोज oxidase और Catalase) 20 है. अन्य पीसीए / PCD 22 से ऊपर वर्णित है. पूर्व निर्माण तुरंत मिश्रण लेकिन समाधान के पीएच समय के साथ परिवर्तन के बाद. उत्तरार्द्ध रासायनिक अपरिवर्तित समाधान रहता है, लेकिन 8 मिनट 10 के एक ऊष्मायन समय की आवश्यकता है.

एकयहाँ दिखाया गया है, यह एनए = 1.2 के साथ एक 60X पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर मोटी नमूने लिए फियोना का विस्तार करने के लिए भी संभव है. इस उद्देश्य पहले से इस्तेमाल किया 100X तेल विसर्जन उद्देश्य (0.17 मिमी) की तुलना में एक लंबे समय तक काम दूरी (0.27 मिमी) है. मोटी नमूने पर काम करने के लिए, महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. TIRFM की कम पृष्ठभूमि का लाभ बलिदान हालांकि उज्ज्वल क्वांटम डॉट्स का उपयोग करते समय, नैनोमीटर स्थानीयकरण परिशुद्धता अभी भी प्राप्त है. इस विस्तार मोटी ऊतक इमेजिंग और चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोगी हो जाएगा.

फियोना के आवेदन कुछ पहलुओं में सीमित है. स्थानीयकरण परिशुद्धता एकत्र फोटॉनों की कुल संख्या पर निर्भर करता है के रूप में सबसे पहले,, फिओना के अस्थायी समाधान आम तौर पर समझौता किया है. दूसरा, अकेले फिओना ही कम लेबल नमूने के लिए लागू किया जा सकता है. कई fluorophores काफी करीब हैं अगर दूसरे शब्दों में, फिओना विफल हो जाएगा जैसे उनके PSFs ओवरलैप. इसके अलावा, उत्सर्जन प्रकाश के प्रकीर्णन एपी की सीमामोटी ऊतक इमेजिंग में फियोना की तह.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgements

यह काम एनआईएच अनुदान 068625, NSF अनुदान 1063188 और 0822613. विशेष धन्यवाद खरगोश आँखों के उपहार के लिए उन्नत विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए Beckman संस्थान में डॉ मरीना Marjanovic के लिए जाना जीवित कोशिकाओं के भौतिकी केंद्र द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-sided tape 3M ~75 µm thick
EMCCD camera Andor Technology DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner Branson 2510
Fluorescence filter set Chroma 49016
Actin polymerization buffer  Cytoskeleton  BSA02
Biotin G-actin Cytoskeleton  AB07
G-actin  Cytoskeleton  AKL95
General actin buffer  Cytoskeleton  BSA01
Laser shutter (with driver) Electro-Optical Products Corp.  SH-10-MP
IDL Exelis Visual Information Solutions
Neutravidin  Fisher Scientific PI-31000
Coverslip Fisherbrand  22X30-1.5 0.16-0.19 mm thick
Microscope slide Gold Seal Microslides  30103X1 0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Glass bottom dish  In Vitro Scientific D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos Integrated DNA Technologies 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads  Invitrogen T-7280
Qdot 605-streptavidin  Invitrogen Q10101MP
Qdot605  Invitrogen Q21301MP
Qdot705 Invitrogen Q22021MP 
Qdot705 Antibody Conjugation Kit Invitrogen Q22061MP
MATLAB MathWorks
Optical table Newport Corp RS4000 Series
60X Objective Nikon Plan Apo VC 60x WI
100X Objective Olympus PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective Olympus UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope Olympus IX71/IX70/IX81
Origin OriginLab
Anti-FLAG antibody Sigma Aldrich F7425-.2MG
ATP Sigma Aldrich A7699
BME  Sigma Aldrich 63689-25ML-F
BSA Sigma Aldrich A7906
BSA-biotin Sigma Aldrich A8549-10MG
CK Sigma Aldrich C3755 Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP Sigma Aldrich P1937 Phosphocreatine di(tris) salt
DTT Sigma Aldrich 43815 DL-Dithiothreitol
EGTA Sigma Aldrich E3889 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl  Sigma Aldrich 93363-500G
HEPES  Sigma Aldrich H0887
KCl Sigma Aldrich P9333
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S7653
PCA Sigma Aldrich 03930590 Protocatechuic acid 
PCD Sigma Aldrich P8279 Protocatechuate-3,4-dioxygenase 
TMOS Sigma Aldrich 341436-25G Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl  Sigma Aldrich 93363
Trolox Sigma Aldrich 238813 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts Thorlabs  BB1-E02, KM100 Quantity: 2
½” diameter posts Thorlabs  TR4 Quantity ≥ 6
10X beam expander Thorlabs  BE10M-A
2” diameter f = 300 mm lens with mount Thorlabs  LA1256-A, LMR2 TIR lens
Fluorescent alignment target  Thorlabs  VRC2SM1
Laser safety goggles Thorlabs  LG3
ND filter(s) Thorlabs  FW1AND
Optical beam profiler Thorlabs  BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm Thorlabs  ID25 Quantity: 2
Shearing interferometer Thorlabs  SI100
XYZ translation stage, ½” travel  Thorlabs  T12XYZ
Laser World Star Technologies  TECGL-30 532 nm, 30 mW

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References

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