בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התימוס הוא איבר חיוני להתפתחות לימפוציטים T. של תאי סטרומה הרתי, תאים הרתי אפיתל (Tecs) הם קריטיים במיוחד בשלבים שונים של התפתחות תא T: מחויבות T תא, סלקציה חיובית וסלקציה שלילית. עם זאת, הפונקציה של Tecs בבלוטת התימוס נשארה הבינה באופן חלקי. במאמר, אנו מספקים שיטה לבודד תת TEC מבלוטת התימוס עכבר טרי באמצעות שילוב של הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת לתאי סטרומה הרתי וthymocytes להשתחרר ביעילות מתאי תאים וחיבורי מטריצת תאים תאיים וכדי ליצור השעיה תא בודד. שימוש בתאים המבודדים, cytometry זרימת פרמטרים המרובה יכול להיות מיושם על זיהוי ואפיון של Tecs ותאים דנדריטיים. בגלל Tecs הוא אוכלוסיית תאים נדירה בבלוטת התימוס, אנחנו גם לתאר דרך יעילה להעשרה ולטהר Tecs ידי כלה thymocytes, סוג התא הנפוץ ביותר בבלוטת התימוס. Folloאגף ההעשרה, זמן מיון התא יכול להיות ירידה כל כך אובדן של כדאיות תא ניתן למזער במהלך הטיהור של Tecs. תאים מטוהרים מתאימים לניתוחים במורד הזרם שונים כמו Real Time-PCR, כתם מערבי ופרופיל ביטוי גנים. הפרוטוקול יהיה לקדם את המחקר של פונקצית TEC וכמו גם את הפיתוח של במבחנה הכינון מחדש של תאי T.

Introduction

בשלב מוקדם בהתפתחות תא T, אבות multipotent מח עצם גזע hematopoietic שמקורן בתאים מגויסים לקליפה של בלוטת התימוס, עובר מחויבות לשושלת T ולהיות מבשרי תא T 1. בקליפת המוח, השלילי כפול thymocytes מבשר תא T מסוג CD4 ו CD8 (DN) להרחיב ולהתמיין CD4 לא בוגר וthymocytes החיובי כפול CD8 (DP), ויצר מאגר גדול של אבות עם קולטני תא T משתנה מאוד 1. רק קבוצת משנה מוגבל-MHC נבחרת של תאי DP יהפוך החיובי יחיד thymocytes CD4 או CD8 (SP), לעבור למדולה של התימוס, ולהתמיין לתאי T בוגרים מבחינה תפקודית המוסמכים, אירוע שנקרא סלקציה חיובית כ2 6. בניגוד לכך, שיבוטים של thymocytes האוטומטי-reactive עוברים סלקציה שלילית ויוסרו באמצעות אפופטוזיס, יומרו לתאי T רגולטורים לסובלנות עצמית, או מופנים לימפוציטים intraepithelial למטרות שאינן ברורים עדיין 3,7-10.

בבלוטת התימוס, תאי סטרומה הרתי ליצור microenvironment ייחודי המספק אותות לאלה גורלות פיתוח תאים השונים T 5,11,12. תאי סטרומה הרתי מורכבים מתאי אפיתל הרתי (Tecs) - כולל Tecs קליפת המוח (cTECs) וTecs הלשדי (mTECs), תאים דנדריטיים, מקרופאגים, פיברובלסטים, תאי אנדותל, pericytes המופק מרכס העצבי ותאי mesenchymal אחרים 13-15. בין אלה, Tecs הם קריטיים בשלבים השונים של פיתוח תאי T 1,2,16,17. עם זאת, חוסר דרך חזקה כדי לבודד Tecs עכב הבנה מקיפה של הפונקציות שלהם 16. בפרט, cTECs, אשר יוצר רשת תלת ממדים המקיפה את האבות בקליפת המוח, חיוני לסלקציה חיובית 13,18,19 מסיבות שאינן ברורים עדיין. מחקרים קודמים סיפקו רמזים לגבי ההטרוגניות והתפקיד של Tecs, בעיקר להסתמך על כלים מורפולוגיים והיסטולוגית 13 12,20. דרך חזקה ושחזור כדי לבודד Tecs היא יסוד להשגת אפיון משוחד של תת TEC, הערכה כמותית ואיכותית של פונקציות TEC, והבהרה של מנגנונים איך cTECs יתמוך בבחירה חיובית.

בשל הנדירות של Tecs בבלוטת התימוס והאינטראקציות הדוקות הם יוצרים באיבר שלם, הבידוד של Tecs היה מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על תגליות קודמות, כיום ריאגנטים זמינים, טכניקות, ואת הידע של מבנה בלוטת התימוס והרכב סטרומה. לפני כמעט שני עשורים, כמה נהלים דווחו לdisaggregate רקמות בלוטת התימוס 21-27, שבו אנזימים שונים שמשו במהלך עיכול, כולל טריפסין, Collagenase וDispase. אפור et al. לעומת אלה אנזימים בprecedure 28, ודיווח ספיד משופרod עם עיכול מרובה צעד של קוקטיילים אנזים 29 שהפכו בשימוש נרחב 20,30. עם זאת, שיטה זו כרוכה בזמן הכנה ארוך וצעדים מורכבים עיכול ותוצאות במשתנה מספרים סלולריים ופרופורציות של Tecs הסופי אפילו באותו הדור העכברי 29,30. לפני מספר שנים, אנזים כיתה מחקר Liberase, מכיל מטוהר ביותר Collagenase ופרוטאז הניטרלי התחיל להיות בשימוש בניתוק רקמת התימוס 30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס עיכול Liberase, עם נהלי הפרדה מכאנית מותאמים, שמניב מספר גבוה של Tecs קיימא מרקמות בלוטת התימוס עכבר. .

כדי להעשיר את תאי סטרומה ניתק, מחקרים קודמים השתמשו גם מפלי צפיפות או הפרדת חרוז מגנטית 21,29. עם זאת, שתי השיטות לגרום חמורות אבודות של אוכלוסיות מסוימות של תאי סטרומה הרתי, במיוחד האוכלוסייה של cTECs 29. חיסול ציטוטוקסיות וטכניקות צילום פנורמי 12,31. לאחר השוואה של טכניקות אלה, הקמנו את פרוטוקול צילום פנורמי הנוכחי להעשרה של Tecs. המצב העדין במהלך הליך ההעשרה מוביל למוות של תאים ופחות משוחד והתאוששות TEC מוגברת.

ההשעיה תא התימוס המבודדת שתוארה בסעיף 3 יכולה להיות מיושמת ישירות לזרום ניתוח cytometric לזיהוי ואפיון של תת TEC ותאים דנדריטיים. סעיף 4 מתאר דרך פשוטה ושימושית לזיהוי תת TEC באמצעות זרימת פרמטרים מרובה cytometer. ניתן למצוא בניסויים שמבקשים להשיג cTECs מטוהר או mTECs, העשרת TEC ומיון תא הליכים בסעיף 5 ו -6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

במחקר זה, למבוגרים - הנשי (6 8 שבועות) C57Bl / 6 עכברים היו בשימוש. עכברים שנרכשו מהמכון הלאומי לסרטן וקיומם תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. אוניברסיטת ועדת בעלי החיים המוסדית מינסוטה טיפול ושימוש (IACUC) אישרה את כל הניסויים בבעלי החיים.

.1 הכנת מכשירים והחוצצים

  1. הכן פתרון אנזים (בינוני RPMI1640 עם 0.05% [w / v] של Liberase TH ו100 U / ml של DNase I), חיץ אלבומין העשיר (1X PBS [Ca 2 + / 2 + -חינם Mg] עם 0.5% בסרום שור אלבומין ו2 חומצת Ethylenediamine Tetraacetic מ"מ [EDTA]), חיץ FACS (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -חינם] 1% בסרום שור עוברי המכיל [FBS] ו0.02% NaN 3), FACS מיון חיץ (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -חינם] (בינוני RPMI-1640 המכיל 2% FBS), ובינוני RP10 מסופק עם 10% FBS).
  2. הכן 10 צלחות צילום פנורמי. הכן פתרון ציפוי 40 מ"ל (0.01 מ"ג / מ"ל ​​Gשיבולת שועל אנטי העכברוש-IgG ב0.1 M NaHCO הצפת 3), ולהוסיף 4 מ"ל של תמיסת ציפוי לכל 100 x 15 צלחת מ"מ, מערבולת ולדגור על 4 CO ° / N. יוצקים את פתרון נוגדן ולשטוף את הצלחת באמצעות 5 מ"ל של 1x PBS עבור 2 פעמים, מערבולת במרץ בין שטיפות. אחסן את הצלחות מוכנות ב 4 ° C..

.2 קציר של רקמות קורנית

  1. להרדים עכבר בתא CO 2. שים את החיה על גבה על מחצלת לנתיחה, להצמיד את הרגליים על המזרן ולהרטיב את הפרווה על ידי ריסוס עם אתנול 70%.
  2. לעשות חתך קו האמצע דרך העור, החל מלמעלה פתיחת השופכה ישר עד הלסת התחתונה עם מספריים ולהאריך את החתך כלפי מטה עד הברכיים בשני הצדדים. החתך נראה כמו במהופך "Y". משוך את העור הרפוי לאחור בצדדים, ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה.
  3. לנקב את הסרעפת מxiphoid, לחתוך את הצלעות בכל צד עד כ עצם הבריח, ואז להרים את הצלעות עםמלקחיים ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה. התימוס הוא בדיוק מתחת לצלעות, ונראה כמו שתי אונות הלבנות דקות שמעל הלב (איור 1). רקמת חיבור נתק המקיף את בלוטת התימוס, משוך בעדינות ולהסיר את זוג אונות התימוס עם מלקחיים משוננים מעוקלים. אונות התימוס מקום לצלחת 6 היטב המכילה 5 מ"ל RPMI-1640.

.3 הכנת התאים הרתי סטרומה

  1. חתוך את כל רקמת שומן וחיבור המקיפה ולהעביר את אונות התימוס לבאר חדשה של צלחת 6 היטב המכילה 5 מ"ל טרי להכין פתרון אנזים. לעשות חתכים קטנים באונות התימוס עם מספריים עדינים, ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. בעדינות פיפטה לעכל רקמה עד התימוס וירידה של 2 - 3 פעמים באמצעות 5 פיפטה מ"ל לניתוק רקמות. לאסוף חלק supernatant בצינור 50 מ"ל מכיל 10 מ"ל חיץ אלבומין העשיר קר לנטרל אנזימים. שמור את צינור האיסוף על קרח. הוסף 2.5פתרון מ"ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. לבצע תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ"ל ומחט 18 G כדי לשבור את אגרגטים. supernatant בריכה לצינור האיסוף. הוסף פתרון 2.5 מ"ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. חזור על תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ"ל ו25 מחט G, ודגירה את הצלחת נוספת 5 - 10 דקות.
  5. לאחר עיכול מלא, בריכת supernatant לתוך צינור האיסוף. צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות כדי לאסוף את התאים. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted ב10 מ"ל חיץ אלבומין העשיר ולסנן את המדגם באמצעות 100 רשת מ"מ. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. ואז לבצע ניתוח תזרים cytometic (סעיף 4) או העשרת Tecs (סעיף 5).

.4 זיהוי של Tecs על ידי cytometry הזרימה

  • הכן תאים לריכוז סופי של 4 x 10 6 תאים במאגר FACS 100 μl מכתים בצלחת מבחן גם מסביב לתחתית 96 ולשמור את הצלחת על קרח. הוסף 20 μl פתרון לחסום Fc (אנטי CD16-/ נוגדן CD32 ב10 מיקרוגרם / מ"ל ​​במאגר FACS) לתאי דגירה התאים ל10 דקות על קרח. ספין הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. בטל נוזל מבארות על ידי מצליף את פני הצלחת לתוך כיור.
  • להשעות את תאי pelleted ב100 קוקטייל נוגדני μl (אנטי CD45, -EpCAM, כיתת -MHC השנייה, ו-Ly51 נוגדנים, וקטיני UEA-1 שכותרתו עם fluorochromes שונה ביצרן מומלץ או נבדקים ריכוזים אופטימליים של כל נוגדן במאגר FACS ), ודגירת התאים על קרח ל20 דקות בחושך. לפיצוי, להכתים 1 x 10 6 תאים עם כל fluorochrome הבודד.
  • הוספה של חיץ FACS 100 μl היטב כל אחד ולסובב את הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על צעד אחד לשטוףזמן, ולאחר מכן resuspend תאי חיץ FACS 100 μl. להעביר את תאי צינור FACS מסביב לתחתית 12 x 15 מ"מ מלא ב300 μl FACS חיץ. לרכוש דגימות על cytometer זרימה ולנתח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS. אסטרטגית gating TEC מוצגת באיור 2.
  • .5 העשרה של Tecs על ידי צילום פנורמי

    1. ספין למטה תאי התימוס (שהוכנו בסעיף 3) ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted במאגר מיון FACS בריכוז של 2 x 10 8 תאים לכל מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל או 50 מ"ל. הוסף נוגדן אנטי CD90.2 (Clone 30-H12) (או אנטי CD45) בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של השעיה תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף עם 5 - 10x נפח בינוני RP10 וצנטריפוגות הצינור ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted בבינוני RP10 בריכוז של 1 x 10 7 לכל מ"ל. הוסף השעיה תא 5 מ"ל לכל צלחת מצופה צילום פנורמי (מוכנה בשלב 1.3), מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. מערבולת במרץ; להעביר את supernatants לתוך צינור חרוטי. יש לשטוף את הצלחת שתי פעמים באמצעות מדיום RP10 וברכת supernatants לתוך צינור האיסוף.
    3. צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted במדיום RP10 5 מ"ל. מוסיף את ההשעיה התא לצלחת צילום פנורמי חדשה, מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. לאסוף את התאים לשטוף את הצלחת וברכה אותם לתוך צינור חרוטי. ברגע שTecs מועשרים, ספין למטה התאים ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהשעות תאי 5 FACS מ"ל מיון חיץ.

    .6 טיהור Tecs על ידי מיון תאים

    1. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהכין השעיה תא בריכוז של 4 x 10 7 תאי חיץ מיון FACS. הוספת נוגדני described בסעיף 4.4 לפתרון תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעקבות צביעה, לשטוף ולהשעות תאים לריכוז של 10 x 10 6 תאים לכל מ"ל של חיץ מיון FACS.
    2. מיין תת TEC דרך נחיר 100 מיקרומטר באמצעות מיון תא הקרינה הופעלה. תא ממוין נאספים ב30% (v / v) FBS בRPMI-1640). ברגע שמיון תא נעשה, תאי צנטריפוגות ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהתכונן לניתוח במורד הזרם.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    שימוש בפרוטוקול זה, איבר התימוס הוסר מעכבר בוגר (סעיף 2) והשעית תא הרתי הוכן כפי שתואר בסעיף 3 ההשעיה התא שהושגה כללה thymocytes, תאי סטרומה שמקורם hematopoietic ותאי סטרומה שאינו hematopoietic. CD45 הוא הפאן סמן hematopoietic הביע בשני thymocytes ותאי סטרומה hematopoietic כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים. בניגוד לכך, Tecs אינו ממוצא hematopoietic ואינו מבטא CD45 15. מכתים תא וניתוח התזרים cytometric בוצעו כפי שתוארו בסעיף 4.

    שני סוגים של תת TEC, cTECs וmTECs, מקורן מבשר TEC דו עוצמה משותפת 15. cTECs וmTECs שני להביע את מולקולת EpCAM על פני השטח שלהם 28. כך ניתן מגודר Tecs פי (איור 2 א) EpCAM החיובי וCD45 שלילי על ידי cytometry זרימה. ניתן להבחין cTECs וmTECs על ידי שני חומרים כימיים: Ly51נוגדן שמכיר aminopeptidase glutamyl לידי ביטוי על ידי cTEC, וקטיני Ulex Europaeus agglutinin-1 (UEA-1) 28 שנקשר לMtec (איור 2). mTECs וcTECs שני להביע כיתת MHC II מולקולות על פני השטח שלהם (איור 2 ג ו 2 ד). mTECs יכול להיות מסווג נוסף לתוך עד גבוה נמוך וMtec Mtec בהתאם לרמה של מולקולות MHC II (איור 2 ד). המספר הממוצע של TEC לבלוטת התימוס הוא על 9 x 10 5. בהשוואה ישירה, שהתאוששנו Tecs כ 8 פעמים יותר תוך שימוש בפרוטוקול אנזים Liberase זה מבוסס השוואה לפרוטוקול רב שלבים עם collagenase / dispase 29 (איור 3).

    על מנת לקצר את זמן מיון ולהגדיל את יכולת הקיום של תאי סטרומה התאוששו, פיתחנו שיטת צילום פנורמי לרוקן thymocytes בגלל ההשעיה תא התימוס מורכבת מthymocytes מעל 95%. תאים הודגרו עםTI-CD90 נוגדן ונתפס על ידי צלחות Precoated. בהשוואה לזה שבתאי התימוס מוכנים שלמים (מועשר מראש), חלקם של Tecs הוגדל מ פחות מ -0.5% ליותר מ 15% בתאים מועשרים בהודעה (איור 4 א ו -4 ב). גם צילום פנורמי עם אנטי CD45 יכול לשמש אם, למשל, אף אחד לא צריך להתאושש תאים דנדריטיים, כמו גם. במקרה זה, עולה העשרת TEC ל% על 80 (מידע לא מוצג). לאחר תא סטרומה העשרה על ידי צילום פנורמי, הפרופורציות של תת TEC לא שינו (איור 4C ו4D), המצביעות על כך משנה זה או האחר הוא לא איבד באופן סלקטיבי במהלך צילום פנורמי. בהשוואה למדגם מראש ההעשרה, קצב ההתאוששות של Tecs היה כ -85% (איור 4E).

    איור 1
    איור 1 התימוס העכבר דוריןנתיחה גרם. התימוס ממוקם מעל הלב בבית החזה העליון הקדמי. לאחר חיתוך והסרת הצלעות, שתי האונות הלבנות של התימוס נחשפות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור .2 זיהוי cTEC וMtec עם ניתוח נתוני הזרימה cytometric. דגימות תאי התימוס ויטראז נותחו באמצעות cytometry זרימה. פרופילי FACS נציג מוצגים. המספרים מציינים את האחוז של כל אוכלוסייה. (א) לתאים חיים, שער של אירועים חיוביים EpCAM CD45 שלילי ומייצג תאי TEC. (ב) בתוך שער TEC, שתי אוכלוסיות מופרדות על ידי רמה של Ly51 וUEA- 1. cTECs יש לי גבוהביטוי er של Ly51; יש לי mTECs רמה גבוהה יותר של UEA-1. מולקולות (C) MHC II מתבטאות במידה רבה בcTECs. (D) mTECs מורכב של תתי אוכלוסיות MHC II גבוהות וMHC II נמוכות, אשר בנפרד מכונים Mtec גבוה וMtec נמוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3 פרוטוקול מבוסס liberase אפשר תשואות תא גבוהות יותר מבלוטת התימוס מאשר באמצעות collagenase רב שלבים / פרוטוקול dispase. תאי התימוס הוכנו באמצעות collagenase רב שלבים / פרוטוקול dispase שפורסם בעבר או פרוטוקול מבוסס liberase זה. שתי קבוצות של דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה. () </ פרופילי FACS strong> הנציג מוצגים. המספרים מציינים את האחוזים של תאי TEC בכל קבוצה. (B) מספרים סלולריים סך הכל של TEC להתימוס עכבר מוצגים בגרף העמודות. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן (n> 3). מבחן T שני זנב, מזווג בוצע באמצעות פריזמה תוכנה. P <0.0001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4 העשרה של Tecs בשיטת צילום פנורמי. פרופילי FACS של תאי סטרומה הרתי לפני ומועשר בהודעה מוצגות. תאי התימוס מוכנים הוכתמו נוגדן אנטי CD90. thymocytes CD90 החיובי להלחין מעל 95% מתאי בלוטת התימוס. במהלך הליך העשרת TEC, thymocytes הוא capturעורך ומדולדל על צלחת צילום פנורמי מצופה מראש, ובכך Tecs מועשר בsupernatant. (א) ו (ב), שערי TEC מוצגים. המספרים מראים את חלקם של Tecs בין תאי חיים הכולל באוכלוסייה (Pre-ההעשרה) מתחילה או לאחר ההעשרה (Post-העשרה). (ג) ו (ד), תאים בתוך שערי cTEC וMtec מוצגים. המספרים להציג את אחוזי cTEC וMtec באוכלוסיות TEC מכל קבוצה. מספרים סלולריים (E) של cTECs וmTECs להתימוס עכבר מוצגים בגרף. הנתונים הם נציג של 5 ניסויים. "מראש" עומד למדגם מראש העשרה; "הודעה" עומדת למדגם הודעה העשרה; קווים אופקיים קטנים מצביעים על הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    בפרוטוקול, שלבים קריטיים הם ההכנה של תאי התימוס סטרומה (סעיף 3) וההעשרה של Tecs (סעיף 4). מומלץ מאוד שפתרון אנזים טרי מוכן בכל פעם, והוא התייחס אל הרקמה בהקדם האפשרי. לthymi נקווה, אופטימיזציה של הנפח של פתרון אנזים נדרש בהתאם למספר של thymi. אם כל שאריות רקמה שנשארו לאחר העיבוד, והוסיף עוד פתרון אנזים והארכת זמן דגירה יכול להגדיל את תשואת תא. במהלך העשרת Tecs, השלים אוסף של supernatant וחוזר לשטוף הצלחת שתוארה בסעיף .5.3 יקטן אובדן תא.

    בשנת 1980, Wekerle et al. דווח לראשונה סוג של Tecs - "תאים הרתי אחות" (חברות רבות לאומיות) 33, שהם תאי אפיתל בקליפת המוח גדולים שעוטפים לחלוטין רבים תאי הלימפה קיימא בתוך שלפוחית ​​תאית. בשנת 1982, Kyewski וקפלן תיארו מנצח בידוד שוניםitions המשפיעים על התשואה של חברות רבות לאומיות 34. לאחרונה, Takahama ועמיתים בקרו הבידוד ומאפיינים של חברות רבות לאומיות. הם זיהו כגון תאים על בסיס הצביעה מועדפת לCD45 רק לאחר permeabilization הקרום 35. הם גם תיארו את "שבורה" TNC בהכנה שלהם, שהייתה מורכבת מcTEC וthymocytes הכפות מרובה. TNC השבור כאלה היו חיוביים עבור CD45 תאי ולβ5t סמן cTEC ומורכב 70% מcTECs סך הכל בהכנה שלהם. ואכן, אנחנו גם נצפו אוכלוסיית תאים דומה, שהייתה + הגבוה EpCAM CD45 וLy51 + בהשעית תא התימוס מוכנה שלנו, אם כי מורכבים פחות מ40% מcTECs המוחלט עם הליך הבידוד שלנו. TNC השבור אלה יוסרו מפרוטוקולי העשרת TEC, כמו שלנו, שעושה שימוש בדלדול עם או CD90 או CD45. לפיכך, אתגר בעתיד יהיה למזער את ההפסד של אוכלוסייה זו.

    לעומתלהליך עיכול רב שלבים הקיימים 29, פרוטוקול עיכול Liberase מאפשר תשואת תא גבוהה באופן משמעותי של Tecs (איור 3). גם קבוצות אחרות לא דיווחו על השיטות החדשות שלהם לבידוד תא סטרומה הרתי על ידי שינוי השיטה של גריי 30,36, למרות שתשואת תא לא גדלה באופן משמעותי. לאחרונה, Chidgey ועמיתים עצמאיים דיווחו פרוטוקול TEC באמצעות עיכול Liberase והם גם השיגו שחרור יעיל של Tecs 37. עם זאת, צעד שחרור thymocyte הראשון של הפרוטוקול שלהם יש את הפוטנציאל להשליך על 1.6 x 10 4 Tecs מכל התימוס 29, אשר רובם cTECs. בשל העשרת שיפוע צפיפות גורמת לאובדן של תאי סטרומה קטנים יותר, דלדול CD45-microbead מבוסס AutoMACS משמש עממי להעשרה של Tecs לפני טיהור FACS 29,36,37. בהשוואה להעשרה מבוססת AutoMACS תוך שימוש בפרוטוקולי דלדול CD45-microbead 29,צילום פנורמי העשרה הושג שיעורי החלמה גבוהים יותר של Tecs. בסך הכל, הפרוטוקול המובא כאן צובר מספר היתרונות שדווחו בעבר. תת TEC מטוהר עם פרוטוקול זה (סעיף 6) שימשו בהצלחה לניתוח נוסף, כגון Real Time-PCR וניתוח כתם מערבי 12.

    פרוטוקול זה מתאים גם לבידוד ומחקר של תאים אחרים הרתי סטרומה, כגון תאים דנדריטיים. אנו מאמינים כי בידוד חזק של תאים הרתי סטרומה, במיוחד Tecs, יאיץ את ההבנה של איך פונקציות התימוס לפיתוח תאי T והשיגו במבחנה חוקת תא T. יתר על כן, אפיון של תאים אלה יש ערך מעשי גדול לקהילה הרפואית, שכן בעיה נפוצה עם התאוששות מטיפולים (כגון אלו המשמשים בהשתלה וטיפול בסרטן) הוא הכינון מחדש ירוד של תאי האפיתל בבלוטת התימוס מוביל לכשל חיסוני.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

    Acknowledgments

    עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט R01 AI088209 (לקה). אנו מודים גם לאוניברסיטת מינסוטה cytometry זרימת המשאבים.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics