낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 유체로부터 적절한 농도로 저농도, 저분자량 바이오마커를 수확, 농축 및 보존하는 것입니다. 표준 단백질 분석의 경우, 이는 먼저 화학적으로 기능화된 하이드로겔 나노입자를 생물학적 유체, 저분자량에 첨가하여 수행됩니다. 분석물은 나노 입자의 코어로 들어가 친화성이 높은 단백질 미끼 역할을 하는 다양한 유기 화학 염료에 의해 포집됩니다.

두 번째 단계는 원심분리를 통해 생체 유체에서 입자를 분리하는 것입니다. 나노 입자는 관심 단백질을 몇 자릿수 크기로 농축합니다. 그런 다음 나노 입자를 물로 세척하여 외부 단백질을 제거합니다.

마지막 단계는 나노 입자에서 포획된 단백질을 용리하는 것입니다. 궁극적으로, 웨스턴 블로팅(western blotting), 질량 분석법(mass spectrometry) 또는 아미노 분석법(amino assay)은 이전에 검출할 수 없었던 채취된 저농도 바이오마커의 존재 및/또는 농도를 보여주는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 나노 입자를 세척하고 소생을 중단해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

피펫 팁을 막지 않으면 나노 입자가 세포만큼 쉽게 현탁되지 P.So 첫 번째 배양 후 나노 입자를 적절하게 현탁시키기 위해 위아래로 격렬하게 피펫을 사용해야 합니다. 나노 입자를 사용하면 튜브에 부착될 수 있는 나노 입자 잔류물을 수집하기 위해 튜브의 벽을 헹구는 것이 중요합니다. 혈청 샘플의 나노 입자 처리를 수행하려면 마이크로 원심 분리 튜브에서 50 밀리 몰 트리스, HCL pH 7로 500 마이크로 리터의 인간 혈청 1-2를 희석합니다.

500마이크로리터의 폴리 및 isop 프로필 아크릴아미드 또는 아크릴산 코어 나노 입자의 폴리 니팜 CO 단량체를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 10분 동안 16, 100회 G 및 25°C에서 샘플을 회전시킵니다. 고정 각도 로터가 장착된 원심분리기에서 SUP 나틴을 제거하고 버리고 500마이크로리터의 티오시아네이트나트륨을 펠릿에 첨가하기 전에 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 나노 입자를 재현탁합니다.

이전과 같이 샘플을 회전시키고 상등액을 버리고 나노 입자 펠릿에 500마이크로리터의 milli Q 물을 첨가합니다. 다시 한 번, resus는 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 나노 입자를 현탁시킵니다. 샘플을 다시 회전시킨 후, 시연된 기술을 사용하여 300마이크로리터의 새로운 엘루시안, 완충 및 재현탁액을 얻었습니다.

실온에서 15분 동안 배양합니다. 샘플을 마지막으로 회전시킨 후 EIT를 제거하고 라벨이 부착된 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 보관합니다. 두 번째 용리하고 두 EIT를 하나의 마이크로 원심분리기로 결합합니다. 2.

다음으로, 공기 흐름을 6으로 설정하고 질소 흐름과 질소 증발기 매니폴드에서 질소 흐름과 질소 증발기 매니폴드에서 EIT를 건조합니다. 건조된 EIT를 실온에서 보관하여 하룻밤 동안 보관하거나, 질량 분석, 웨스턴 블로팅 또는 EISA 분석 전에 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도를 추가하여 소변 샘플의 나노 입자 처리를 수행합니다. 최소 22ml의 부피를 수집하고 분석할 준비가 될 때까지 검체를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

얼린 소변을 실온 또는 섭씨 4도에서 밤새 해동합니다. 해동되면 소용돌이 믹서에서 잠시 혼합합니다. 그런 다음 22ml 원뿔형 바닥 폴리프로필렌 튜브에 최소 50ml의 소변을 붓습니다.

다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 3, 700회 G로 스윙 아웃 로터가 있는 원심 분리기에서 15분 동안 소변을 회전시킵니다. 깨끗한 50ml 원뿔형 바닥 폴리프로필렌 튜브에 소변을 담그고 펠릿을 버립니다. 다중 분석물 소변 계량봉 시약 스트립을 사용하여 소변 검사를 수행합니다.

깨끗하고 마른 종이 타월 위에 시약 스트립을 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 일회용 피펫을 사용하여 소변 1ml를 흡인합니다. 시약 스트립의 각 테스트 패드에 소변 1-2방울을 빠르게 분주합니다.

시약 스트립 용기에 표시된 시간에 이전에 2분으로 설정된 타이머를 즉시 시작합니다. 개별 시약 스트립의 색상을 시약 용기의 해당 색상으로 구분된 표시기와 비교하여 시약 스트립의 다양한 분석물에 대한 정성적 결과를 기록합니다. 일반적인 정상 소변 결과는 pH 5.5 - 7.0, 비중 1.001 - 1.020으로 특징지어집니다.

소변은 혈액 단백질, 백혈구, 아질산염, 포도당, 케톤, 빌리루빈 및 우로빌리노겐에 대해 음성이어야 합니다. 다음으로, 정화된 소변 20ml를 깨끗한 50ml 원뿔형 바닥 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다. 소변을 제거하는 소변관 바닥에 있을 수 있는 파편 펠릿을 방해하지 마십시오.

200ml의 소변 샘플에 200마이크로리터의 나노 입자를 넣고 와류 믹서에서 잠시 혼합합니다. 그런 다음 소변 나노 입자 혼합물을 흔들거나 섞이지 않고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 스윙 아웃 로터가 장착된 원심분리기에서 소변 나노 입자 현탁액을 3, 700회 G로 10분 동안 회전시킵니다.

상층액을 제거하고 버린 후 나노 입자 펠릿에 500마이크로리터의 Milli Q 물을 첨가합니다. 나노 입자를 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 재현탁합니다. 나노 입자 용액을 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 고정각 로터가 장착된 원심분리기에서 10분 동안 16, 100배 G로 나노 입자를 회전시킵니다. 물로 이 단계를 반복하기 전에 상층액을 제거하고 버리십시오. 나노 입자를 세척하려면 나노 입자 펠릿에 20 마이크로 리터의 새로운 용출 완충액을 추가하고 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫을 사용하여 나노 입자를 재현 탁시킵니다.

실온에서 15분 동안 배양합니다. 나노 입자 펠릿을 방해하지 않고 스내트를 제거하기 전에 나노 입자 샘플을 다시 회전시키고 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 상등액을 저장합니다. 펠릿을 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오.

샘플을 화학 흄 후드의 랙에 놓습니다. 뚜껑을 열고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 또는 건조될 때까지 섭씨 40도의 질소 흐름 아래에 샘플을 놓습니다.

15마이크로리터의 트리스 글리신 SDS 샘플 버퍼를 샘플에 추가합니다. 뚜껑을 연 상태에서 또는 튜브에 남아 있는 부피가 20마이크로리터를 넘지 않을 때까지 건조 열 블록에서 섭씨 100도에서 5분 동안 가열합니다. 튜브에 캡을 놓고 열 블록에서 튜브를 제거합니다.

샘플은 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 다운스트림 웨스턴 블롯 분석에 즉시 사용할 수 있습니다. Silver stain 1D gel 전기영동은 인간 플라즈마에서 종양 괴사 인자 알파의 나노 입자 캡처 및 농도를 보여줍니다. 종양 괴사 인자 알파를 나타내는 띠는 입자에 대해 문자 P로 지정된 나노 입자 EIT에만 존재하지만 상등액 나노 입자에는 존재하지 않습니다 두 가지 다른 화학 미끼, 아크릴산 또는 VSA 코어 쉘로 기능화 된 코어 쉘은 상층액 및 나노 입자의 플라즈마 웨스턴 블로팅에서 다양한 농도의 IL 17을 수확 할 수 있습니다.

EIT는 EIT의 17.5 킬로달톤 대역에서 IL 17의 존재를 명확하게 보여주지만 상등액 나노 입자에서는 존재하지 않습니다. 소변 샘플을 채취하면 이 은색 염색 SDS 페이지에서 박테리아 항원과 사이토카인을 확인할 수 있습니다. U4 및 U 6 열의 소변 샘플 분석은 RET ESAT 6, 결핵균 관련 단백질, IL 2, 사이토카인을 포함하는 소변 샘플의 나노 입자 EIT입니다.

이 단백질은 15킬로달톤에서 두드러진 띠로 묘사됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 겔 나노 입자를 사용하여 생물학적 유체에서 낮은 버려진 바이오마커를 수확, 농축 및 보존하는 동시에 원치 않는 버려진 분자를 배제하여 현재 분석 방법의 검출 감도를 크게 높일 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.