In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

1Institute of Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN)
Biology

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Summary

Dieser Artikel beschreibt die Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo als Transfektionstechnik für Hodenzellen der Maus, um einzigartige Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll beinhaltet Schritte Glaskapillare Vorbereitung, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und Transfektion durch Elektroporation.

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Michaelis, M., Sobczak, A., Weitzel, J. M. In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis. J. Vis. Exp. (90), e51802, doi:10.3791/51802 (2014).

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Abstract

Dieses Video und Artikel Beitrag gibt eine umfassende Beschreibung der Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo. Diese besondere Technik für die Transfektion Hodenzellen der Maus ermöglicht die Untersuchung von einzigartigen Prozesse in der Spermatogenese.

Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die Transfektion von Zellen mit der Maus Hoden Plasmid-Konstrukte. Insbesondere verwendeten wir die Reportervektor pEGFP-C1, das verstärkt grün fluoreszierendes Protein (eGFP) und die pDsRed2-N1-Vektor exprimiert, rot fluoreszierendes Protein (DsRed2) exprimieren. Beide Reportergene codiert wurden unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus Immediate-early-Promotor (CMV).

Für die Durchführung Gentransfer in Mäusehoden werden die Reporter-Plasmid-Konstrukte in Hoden von lebenden Mäusen injiziert. Zu diesem Zweck ist der Hoden eines betäubten Tieres ausgesetzt und die Seite der Mikroinjektion hergestellt wird. Unsere bevorzugten Ort derInjektion ist der Ausführungsgang, mit dem letztlich verbunden Rete testis als anatomische Transportweg der Spermien zwischen Hoden und Nebenhoden. Auf diese Weise wird die Befüllung der Samenleiter nach der Mikroinjektion sehr gut verwaltet und gesteuert durch die Verwendung von gefärbten DNA-Lösungen. Nach der Feststellung einer ausreichenden Füllung des Hodens von seinen gefärbten Tubulus Struktur wird das Organ elektroporiert. Dies ermöglicht die Übertragung der DNA-Lösung in den Hodenzellen. Nach 3-tägiger Inkubation wird die Hoden entfernt und unter dem Mikroskop für die grüne oder rote Fluoreszenz untersucht, veranschaulicht die Transfektion Erfolg.

Generell kann dieses Protokoll für die Bereitstellung von DNA-oder RNA-Konstrukte eingesetzt werden in lebenden Maus Hoden, um (über) ausdrückliche oder knock down Gene, die Erleichterung in vivo Analyse der Genfunktion. Darüber hinaus eignet sich für das Studium Reporterkonstrukte oder vermeintlichen Gen Regula ist esTory-Elemente. So sind die Hauptvorteile der Elektroporation Technik sind schnelle Performance in Kombination mit geringem Aufwand als auch die moderate technische Ausrüstung und Fähigkeiten im Vergleich zu alternativen Techniken.

Introduction

Säugetier Spermatogenese wird als eine anspruchsvolle Prozess der Selbst-Erneuerung Stammzellen nacheinander Mitose, Meiose und Differenzierung, um zu reifen Spermien haploid entwickeln. Diese morphologischen Veränderungen sind durch unterschiedliche Zelltypen orchestriert und trotz tiefen Versuche ist es immer noch unmöglich, diese Verfahren in Zellkultur 1,2 imitieren. Daher Forschung auf die Spermatogenese bisher beruht auf lebende Organismen in vivo-Modellen. Im allgemeinen werden die Genfunktion Untersuchungen üblicherweise auf transgene Tiere basiert. Jedoch erzeugendes und aufrechterhalt diese Art von Tiermodell ist zeitaufwendig, kostenintensiv und sehr aufwendig. Dies wird auf die erforderliche lange Züchtungsprozess zum Erzeugen und Aufrechterhalten des Transgens über die Generationen zurückzuführen. Zusätzlich ist die genetische Manipulation des gesamten Organismus oder die transgene Knockout-Ansatz anfällig für physiologische Beeinträchtigungen führen, wenn Targeting genen mit essentiellen Funktionen in mehreren Regionen, beispielsweise außerhalb der Hoden oder systemisch.

Ferner werden einige transiente Transfektion Verfahren mit einigen entscheidenden Nachteilen verbunden. Beispielsweise typische Nachteile von virusvermittelten Gentransfer sind die möglichen Provokation der Immunreaktionen und weitere Sicherheitsbestimmungen, während Lipofektion 3 und 4 Mikropartikelbeschuss kann das Gewebe beschädigt werden und auf einen bestimmten Zelltiefe ausreichend Transfektionseffizienz beschränkt.

Im Gegensatz dazu Elektroporation (EP) als eine weitere gemeinsame Weg von transienter Transfektion, scheint eine vielversprechende Technik zur Aktivierung in vivo Transfektion und konsequent in vivo Gen-Analyse darstellen. Im allgemeinen wird EP als dynamisches Phänomen, das auf der lokalen Membranspannung folglich vermittelte Poren in Nanosekunden abhängig bezeichnet. Diese Lücken können für Millisekunden gehalten werden, ausreichend to Zugriff gewähren, um DNA, RNA oder kleinen Molekülen 5. Wenn die angelegte Spannung zu hoch ist, wird das in der Regel vorübergehend Charakter des EP durch die Wärmeproduktion und die Induktion von zu umfassend Permeabilisierung mit der Folge einer irreversiblen Schädigung der Zelle 5 entgegengewirkt.

Hier zeigen wir, dass die Elektroporation ist eine effektive und kostengünstige Transfektion System, das in der Lage ist für die genetische Transformation Hoden, um Hoden Gen Eigenschaften in vivo aufzuklären genutzt wird. Dieser Artikel behandelt Plasmid-Präparation, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und die anschließende Elektroporation von Maus Hoden. Dieses Verfahren kann das Mittel der Wahl, um schnelle, spezifische und effiziente Transfektion von Samenleiter der Maus-Hoden in vivo, um die Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen erreichen.

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Protocol

Alle Tierversuche durchgeführt wurden von der Ethikkommission (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Deutschland) genehmigt worden.

1. Plasmid-Präparation

  1. Zur Plasmidpräparation, verwenden Plasmid-Reinigungskits (siehe Materialien Tabelle) oder ähnliche Verfahren mit Endotoxin Entfernung Puffer, so dass Immunreaktionen des Tieres zu vermeiden. Folgen Sie den Anweisungen des Handbuchs. Beschäftigen ddH2O, um das Plasmid-Lösung zu verdünnen.
  2. Trümmer zu beseitigen durch Spinnen der DNA-Lösung mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 × g). Dann sammeln Sie den Überstand.
  3. Bestimmen Plasmid-Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Materialien).
  4. Passen Plasmid-Konzentration mit ddH2O auf 1-3 pg (DNA) / ul. Hinweis: Niedrigere Konzentrationen werden Transfektionseffizienz zu reduzieren, während höhere Konzentrationen könnte ein zu viskos Injektionslösung führen. Neben derTransfektionseffizienz hängt von der Größe des Plasmids und muss individuell getestet werden.
  5. Vor der Injektion wird eine Lösung Mischung mit etwa 40 ul Plasmid wurden mit 5 ul PBS (10x) und 5 ul Fast Green (0,5%). Fast Green ist zum Verfolgen der Einspritzvorgang benötigt wird. Vorzugsweise verwenden dünnwandigen PCR-Röhrchen oder Parafilm. Hinweis: Je nach der Größe der Hoden, der ein Volumen von 20-50 ul für jede Hoden benötigt.

2. Herstellung der Mikroinjektion Pipette

  1. Verwenden Borosilikatglas Kapillaren (siehe Materialien Tabelle) für die Herstellung der Mikroinjektion Pipetten.
  2. Ziehen Glaskapillaren mit einer vertikalen Kapillare Abzieher (siehe Materialien Tabelle).
  3. Brechen die Kapillare Spitze mit einer Pinzette von sanft Streifenbildung. Die Spitze ist gewöhnlich 50-80 um im Durchmesser und etwa 1 cm lang. Versuchen Sie Tipps, die zu lang, da diese nicht steif genug, um das Gewebe zu durchdringen sind, zu vermeiden.
  4. Endlich sharpen die Spitze in einem 30 ° bis 45 ° unter Verwendung einer Mikropipette seinveler (siehe Materialien Tabelle).
  5. Laden Sie die Mikroinjektion Pipette mit der Injektionslösung-Mischung (siehe Plasmid-Präparation). Tragen Sie die Lösung in die Rückseite der Glas Kapillare mit einer kleinen Spritze. Hinweis: Versuchen Sie, um Luftblasen zu vermeiden, während Laden, da diese sonst in den Samenkanälchen zusammen mit der Plasmid-Lösung eingespritzt werden und damit die Leitfähigkeit zu verringern sowie eventuell Gewebeschäden verursachen.

3. Anästhesie und Chirurgie

  1. Führen Sie den Vorgang unter aseptischen Bedingungen durch Verwendung von sterilem Material (dh Spritze, Nadel, chirurgische Instrumente, etc.). Dies wird eine Infektion des Tieres zu reduzieren und sorgen für eine gute Überlebensraten.
  2. Verwenden Sie für die Elektroporation männlichen Mäusen im Alter von 6-8 Wochen.
  3. Um postoperative analgetische Behandlung zu initialisieren, bieten die Maus mit Analgetika hinzugefügt Trinkwasser am Tag vor der Operation. Dieser EselUres einen Präventiv Analgesie bei sehr wahrscheinlich postoperativen hypodipsia (verminderte Wasseraufnahme). Hierzu aussetzen Trinkwasser beispielsweise einer pädiatrischen Ibuprofensuspension (20 mg / ml). Die heil Trinkwasser sollte auch am Tag eins und zwei der Erholung in identischer Konzentration zugeführt werden. Das bedeutet, eine tägliche Dosis von 7,5 mg / kg, gültig für 5 ml / d Trinkwasser und Körpergewicht von 25 g für 8 Wochen im Alter von C57BL / 6J. Diese schmerzstillende Therapie gewährleistet eine grundlegende Schmerzlinderung und eine beschleunigte Genesung zusammen mit hohen Tierschutz 26.
  4. Zur Herstellung der Arbeitslösung Anästhesie am Tag der Operation, mischen Sie 10% Ketamin und Xylazin 2% in einem Verhältnis 1: 1 (siehe Materialien Tabelle).
  5. , Um das Tier zu betäuben, gelten 0,25 ml / 100 mg Körpergewicht von Anästhesielösung subkutan (= 0,125 g Ketamin / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Verwenden Sie eine Injektionsstelle zwischen Becken und Gliedmaßen, um Organschäden und Verletzungen der Mäuse zu verhindern. Regel 10 min benötigt werdenbis die Maus tief anästhesiert.
  6. Decken Sie die Augen mit der Maus Tierarzt Salbe zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  7. Testen tiefe Narkose Festnahme, die von einem völligen Mangel an Reaktion bemerkbar macht. Zu diesem Zweck, nur eine Prise der Spitze des Tieres.
  8. Um die Operation zu starten, zu entfernen Bauchhaar mit einem elektrischen Rasierer oder ähnliche und desinfizieren den Arbeitsbereich mit Sterilium oder ähnliches.
  9. Machen Sie eine ventrale Inzision direkt über den Vorhautdrüsen in der Mitte der Bauchbereich. An dieser Stelle zunächst die Haut ziehen weg und führen einen kleinen Querschnitt der Haut von etwa 8-14 mm. Dann weiter auf der Bauchmuskelschicht.
    Anmerkung: Die Läsion sollte so klein wie möglich sein, um Schaden von dem Tier zu verringern.
  10. Ziehen Sie die Bauchfettpolster sorgfältig, um die Hoden befestigt aussetzen und auf eine vorherige bereit wasserdichte Einweg-Papiertuch gleich neben der Einschnittstelle (Abbildung 2a).
  11. Mit einem Fernglas zu find den Ausführungsgang als Einspritz Ziel. Der Ductus ableitenden als feine Gefäß Verbindung zwischen Hoden und Nebenhoden identifiziert. Es befindet sich neben dem prominenten Hodenarterie. Der Ductus verläuft fast unter einem Winkel von 45 ° zu der Arterie und in den Nebenhoden Caput sichtbar. Hinweis: Je nach der Maus die Alter, wird der Ductus meist im Fettgewebe begraben.
  12. Verwenden feinen Pinzette, um den Ausführungsgang des Fettgewebes zu löschen. Danach legen Sie die Freigabe Ductus auf einer sterilen Papierstreifen, um die klare Sicht auf den Kanal erfolgt Umgebung beeinträchtigen gewährleisten.

4. Mikroinjektion und DNA-Anwendung

  1. Verbinden des Mikroinjektionspipette, die mit dem Plasmid-Lösung zu den Mikromanipulator / Injektor-Einheit geladen wird.
  2. Legen Sie die Mikroinjektionsnadel parallel zum Ausführungsgang mit der Spitze in Richtung des Rete testis (2B).
  3. Verwenden feinen Pinzette undStreifen der Kanal über die Mikroinjektion Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Kapillare parallel zu der Leitung gehalten, und ziehen Sie es um.
    Hinweis: Dieses Verfahren ist bequemer als die Durchdringung des Behälters durch Bewegen der Nadel mit dem Mikromanipulator.
  4. Richten Sie die Nadel vorsichtig in Richtung Hoden und stoppen so wie es das Rete testis dringt direkt unterhalb der Tunica albuginea (2C).
    Hinweis: Im Fall der Übervorteilung des Rete testis, wird die Plasmid-Lösung in den interstitiellen Raum austreten. Dies führt häufig zu einem Versagen der Transfektion der Hodenkanälchen.
  5. Für die Injektion der Plasmid-Lösung nutzen die Mikroinjektor mit folgenden Einstellungen: pi: 100 hPa, ti: 0,2 sec, und pc: 0 hPa (2D).
  6. Überwachen Sie die gesamte Einspritzvorgang durch die Beobachtung der Hoden Füllen Status mit Hilfe der grünen Farbe. Achten Sie darauf, dass die Hoden nur bis zu zwei Drittel ihres Volumens mit der pl gefülltasmid Lösung (Abbildung 2E).
    Hinweis: Wenn das Injektionsvolumen überschritten, wird der Hodengewebe geschädigt werden könnte.

5. Elektroporation von Hoden

  1. Um wirksam Elektroporation zu ermöglichen, genießen die Pinzette Elektroden in PBS (1x). Dies gewährleistet eine ausreichende Leitfähigkeit.
  2. Reibungslos drücken Sie die Hoden zwischen den nassen Elektroden (2F). Messen den elektrischen Widerstand mit der Elektroporator.
  3. Bewerben Strom an die Hoden. Führen acht Rechteckimpulse von 40 V an 4 verschiedenen Standorten Hoden mit einem konstanten Dauer von 50 ms Pulszeit und 950 ms Intervallzeit.

6. Wundverschluss und Post-Chirurgie

  1. Wenn Elektroporation beendet ist, legen Sie die Hoden wieder in die ursprüngliche Position.
  2. Nähen Sie die innere Muskelschicht mit chirurgischem Naht (siehe Materialien).
  3. Schließen Sie die Haut durch den Einsatz von Wundklammern (siehe Materialien Tabelle). Ziehen Sie die Haut bis with Pinzette. Achten Sie auf die Muskelschicht auszuschließen. Zeigen die Clips, die jeweils in einem Abstand von nicht mehr als 5 mm.
    Hinweis: Da chirurgisches Nahtmaterial kann mit der Maus verschluckt werden, sind Wundklammern zum Verschließen der Hautläsionen begünstigt.
  4. Lassen Sie die Maus, um aus der Narkose auf sterilen Papierhandtücher in einem sterilen leeren Käfig Maus, die auf einem 37 ° C warmen Unterlage aus gehärtetem platziert erholen. Das Kissen sollte die Erwärmung der einen Hälfte des Käfigs Schaffung eines Wärmegradienten zu gewährleisten. Für das Tier macht es möglich, für die einzelnen, am bequemsten Bereich aufgrund der Temperatur Vielzahl in den Käfig suchen. Darüber hinaus umfassen die Maus mit einem Blatt sterilen Papiertuch so dass Stress kann weiter reduziert werden. Hinweis: Da der Körperoberfläche des Maus in Bezug ungewöhnlich hoch, um Körpermasse ist, wenn sie mit größeren Tieren verglichen wird, ist der für die erfolgreiche Wiederherstellung von Nagetieren besonderer Bedeutung die thermische Unterstützung.
  5. Wenn das Tier betrieben voll erwacht ist, übertragen it für eine weitere Erholung auf eine komplett ausgestattete neue Maus Käfig. Legen Sie das Tier wieder zu seiner alten Käfig oder an eine Gruppe von Mäusen. Sicherzustellen, dass der Käfig so sauber und steril wie möglich zu Wundinfektionen zu verhindern. Überwachen den gesamten Recovery-Prozess. Um die Maus zurück in die Tierstation zu übertragen, warten Sie, bis es vollständig erholt und scheint normal zu verhalten.
    Hinweis: Weitere per- und post-operative Strategien werden von Pritchett-Corning KR et al 6 diskutiert.

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Representative Results

Die Versuchsanordnung für die Durchführung der Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden in vivo, wie es verwendet wird, gemäß dem Protokoll ist in 1 dargestellt. Obwohl es möglich ist, industriell hergestellten Mikro erwerben, bevorzugt man, indem (1A unseren eigenen Pipetten erzeugen ) und Anfasen (Abbildung 1B) Glaskapillaren montiert, so dass sie unsere Bedürfnisse. Die Ausrüstung für die Mikroinjektion und Elektroporation in 1C dargestellt. Aus Gründen der Transfektionseffizienz ist es von Bedeutung, um eine Rechteckwelle -Elektroporator nutzen.

Abbildung 2 zeigt die wichtigsten Schritte der Maus Chirurgie mit besonderem Schwerpunkt auf der Vorbereitung der Ausführungsgang. In diesem Zusammenhang ist der Hoden ausgesetzt ist (2A) und dem Ausführungsgang durch binokulare Beobachtung identifiziert und aus Fettgewebe freigesetzt (FigurE 2B). Anschließend wird der Ausführungsgang mit einer Mikroinjektionspipette durchstochen und die Plasmid-Lösung verabreicht wurde (2C-E). Schließlich wird das eingelegte Hoden zwischen zwei Elektroden zusammengedrückt und durch angelegtes Rechteckwellenimpulsen (2F) transfiziert.

Diese in vivo-Transfektion Ansatz erlaubt die Verwendung von verschiedenen Plasmiden verschiedener Reportergene kodieren. Hier verwendeten wir den Reportervektor pEGFP-C1 (3A), das verstärkt grün fluoreszierendes Protein (eGFP) und die pDsRed2-N1 (3C) Vektor ermöglicht Trans rot fluoreszierendes Protein (DsRed2) drückt. In unserem Fall wurden beide Reportergene unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus Immediate-early-Promotor (CMV).

Zur Transfektion Erfolg zu bewerten, wurden die Mikroinjektion und Elektroporation Hoden 3 Tage nach der gesamten Prozedur geerntet und unter fluores beobachtetFluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 3). Für detaillierte Untersuchung, waren die Hoden Formaldehyd-fixierte, in Paraffin eingebettet, geschnitten (5 um) sowie gegengefärbt mit To-Pro-3, was in blau gefärbten Kernen. Schließlich wurden die Schnitte durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Zwei Beispiele für mögliche Transfektion Ergebnisse in Abbildung 4 zu sehen ist. Ist die Expression des Reportergens EGFP durch grüne Fluoreszenz angegeben, wird die Trans DsRed2 durch rote Emission bezeichnet.

Figur 1
Abbildung 1. Ausrüstung für die In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden. Glaskapillaren werden mit Mikropipette Puller (A), während die Spitzen geschärft Verwendung der Mikropipette seinveler gebildet ( (C) dargestellt. Statt der Verwendung eines kommerziellen Mikromanipulator verwendeten wir eine XYZ-Kreuztisch eines Mikroskops und befestigt ein Gerät, um die Mikropipette zu halten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Darstellung der in-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation Hoden Verfahren in der Maus auch vor chirurgischen Eingriff. Zugriff auf die Hoden wird über die Öffnung der Bauch der Maus, die vor betäubt wurde gewährt. Der Schnitt ist gerade über den Vorhautdrüsen gemacht. Nach enthüllt die Hoden, wird es aus Bauchfett pa veröffentlicht ds (A). Fernglas unter Beobachtung, wird die Ausführungsgang identifiziert und fett befreit. Die Mikroinjektion Pipette wird neben dem Ductus positioniert, während das scharfe Ende der Nadel in Richtung der Ausführungsgang (B) zeigt. Die Glaskapillare in den Ductus eingesetzt und in Richtung der Hoden bewegt, um direkt in das Rete testis (C) positioniert werden. Das Verfahren der DNA-Anwendung und Befüllung der Samenleiter wird mit Hilfe des Fast Green (D) überwacht. Nur zwei Drittel der Hoden wird, um Schaden von dem Gewebe (E) zu verhindern gefüllt. Für die endgültige Elektroporation Schritt wird die Hoden zwischen Pinzette artigen Elektroden gequetscht, um elektrische Rechteckimpulse (F) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

"> Figur 3
Abbildung 3. ganze Berg Hoden 3 Tage nach In-vivo-Elektroporation Unter Fluoreszenzmikroskopie, transfiziert Hoden von C57BL / 6 Maus-Show Ausdruck verstärkt grün fluoreszierende Protein -. EGFP (A) und rot fluoreszierendes Protein - DsRed2 (C), die beide auf pEGFP- codiert C1 und pDsRed2-N1-Plasmid sind. Die Expression der beiden Reportergene unter Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV-Promotor-Element. Die effektive Transfektion der Zielsamenleiter durch Fluoreszenzintensitäten gezeigt. Platten (B) und (D) veranschaulichen Autofluoreszenz von nicht transfizierten Kontroll Hoden. Maßstab = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Abschnitte Maus Hoden 3 Tage nach einseitige In-vivo-Elektroporation mit Plasmid pEGFP-C1. Transfektion Ergebnis der festen Maus Hoden Abschnitte (5 um) 3 Tage nach einseitigen Elektroporation mit Plasmid pEGFP-C1 gezeigt. Erfolgreich transfiziert Hoden durch grüne Fluoreszenz angegeben Rohr cellsare. TO-PRO-3 gegengefärbt Kerne sind durch blaue Emission (A und B) nachweisbar. Die runden Strukturen sind typisch für die Organisation von Zellen in den Samenkanälchen. Maßstab = 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Forschung im Bereich der Reproduktionsbiologie, insbesondere im Bereich der männlichen Fruchtbarkeit und Spermatogenese zwangsläufig beruht auf Lebewesen. Um Hodenfunktion zu untersuchen, hat keine ausreichende Zellkultur / in vitro-System wurde reflektieren kann alle entscheidenden morphologischen Veränderungen von einer diploiden Spermatogonie zu einem haploiden Spermium reifen 1,2 etabliert. Somit ist die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tieren oft eine notwendige und als solches ein wertvolles Werkzeug in männlichen Reproduktionsbiologie. Zu diesem Zweck hat sich eine Reihe von transgenen, Knock-out-und Knock-in-Mäusen, die Einblicke in die männliche Fruchtbarkeit geliefert erstellt wurden. Dennoch ist die Erzeugung transgener Mäuse in der Regel durch Injektion von Genkonstrukten in die Vorkerne von befruchteten Eiern durchgeführt. Jedoch ist dieses Verfahren zeitaufwendig und sollte durch Speziallabors durchgeführt werden. Das Verfahren zur Knock-out erzeugen oder Knock-in Tierenist noch anspruchsvoller.

Eine weitere Möglichkeit, die Untersuchung von Genfunktionen von lebenden Modellorganismen ist durch transiente Transfektion. Allerdings kann die gemeinsame Transduktion mit viralen Vektoren immunogene oder andere unspezifische Reaktionen verursachen und erfordert besondere Sicherheitsbestimmungen. Lipofektion 3 und Mikropartikelbeschuss 4 Ansätze werden leider zu einer bestimmten Zelle Tiefe zurückgehalten und sogar könnte sich nachteilig auf das Gewebe auslösen.

Trotzdem die direkt angelegte elektrische Rechteckimpulse auf dem Zielgewebe, sogenannte Elektroporation, ist es tatsächlich möglich ist, lebendes Gewebe, beispielsweise hierin Maushoden transfizieren. Außerdem erfordert diese Methode nur geringe Kosten, geringe Ausstattung und richtig qualifizierte Labor persönlich.

Eine weitere nennenswerte Vorteil mit in vivo-Transfektion Methoden im Vergleich zu anhaltend Gen-veränderte Tier-Modus verbundenls ist die Möglichkeit der Co-Transfektion. Während transgenen oder Knockout-Mäuse tragen normalerweise nur ein Genkonstrukt, in vivo Transfektion ermöglicht eine umfassende gleichzeitige Analyse von verschiedenen Genkonstrukten innerhalb der gleichen Zelle. Dies kann durch die Verwendung von verschiedenen Reportergenen, beispielsweise durchgeführt werden, im Vergleich zu GFP YFP oder Gaussia- gegen Renilla-Luciferase, so dass eine vergleichende Untersuchung von Wildtyp-und Mutanten-Gen Effekte möglich.

Ferner kann durch die Anwendung von Zelltyp-spezifische Promotoren, die die Expression der Gen-Konstrukte können vorzüglich an bestimmte Zellen im Hoden gerichtet werden. Zum Beispiel könnte dies eine Hoden Genexpression nur in Sertoli-Zellen oder Spermatozyten ermöglichen.

Die in diesem Artikel vorgestellten Protokoll deckt zwei wichtige Methoden im Bereich der männlichen Fortpflanzungsbiologie. Die erste ist die Mikroinjektion in Samenleiter mit der Vorbereitung der Injektion Kapillare. Diese Tech-nique wurde häufig in Verbindung gebracht Keim / Stammzelltransplantation entweder aus transgenen Tieren an den Empfänger 7 oder im Rahmen der xenografting 8. Die zweite Methode ist die Transfektion Elektroporation zu induzieren transiente Poren in der Plasmamembran als auch als gerichtete Massenströmung von geladenen Molekülen, wie Plasmiden, wodurch Eintritt in bestimmte Zellen bzw. Geweben. Diese spezifische Richtung von Makromolekülen durch Elektroporation wird häufig in einseitig neuronalen Zell Transfektion oft in utero 9,10 getan oder bei der Entwicklung von Retina 11 geschätzt.

Die vorangegangene ausführliche Verfahren Protokoll enthält als die ersten entscheidenden Schritte der Anästhesie des männlichen Mäusen, die Exposition des Hodens über Bauch Läsion, die Vorbereitung der Ausführungsgang als auch die Mikroinjektion in den Ductus. Da diese Aktionen sind sehr anspruchsvoll, es ist stark an der Praxis auf ersten toten Tiere vor der Durchführung o empfohlenArbeitsvorgänge an lebenden Mäusen. Darüber hinaus sind Anweisungen, wie zu injizieren und füllen Sie die Samenkanälchen mit Plasmid-DNA-und wie die Elektroporation von den Hoden entsprechend durchzuführen ist.

Aufgrund der Anwendung von Elektrizität während EP könnte die Wärmeerzeugung Gewebeschäden, insbesondere bei hohen Spannung auszulösen. Diese Zunahme der Transfektionseffizienz 12, 13, 15, die durch erhöhte Spannung wird durch den nachteiligen Effekt von Hodenschrumpf 12-14 begleitet. Die günstigste Spannungsbereich scheint zwischen 30-50 V ist und garantiert geringe Wirkungen auf Hoden-Integrität, eine normale Spermien-Qualität 16, einen normalen Paarungsverhalten 17, die Aufrechterhaltung der Fähigkeit zur Produktion von Nachkommen 16-20 sowie eine ausreichende Wirksamkeit der Transfektion.

In Bezug auf die Genexpression Intensität der übertragene Gen-Konstrukte, Yomogida et al. 21 haben auch gezeigt, eine deutlich reduzierte ausdression linearisierter Vektoren 3 Tage nach EP Umsetzung der Erwägung, dass zirkuläre Plasmid-DNA offensichtlich immer noch aufrecht Ausdruck nach 35 Tagen mit der höchste in Sertoli-Zellen. Dies legt nahe, daß die besten Ergebnisse werden bei Verwendung von Plasmid-Konstrukte für die Elektroporation wie hier getan erhalten. In unserem Ansatz untersuchten wir Transfektionseffizienz 3 Tage nach der Elektroporation durch die Beobachtung, dass diese Zeit ist ausreichend, um die Wundheilung, Reparatur von Zellintegrität sowie die gewünschte richtige Expression der Reporterproteine ​​eGFP und DsRed2. Somit scheint eine Inkubationszeit von 3 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff und der gesamten Transfektionsverfahren notwendig, angemessen wiederhergestellt Zellfunktionen einschließlich Genexpression, so dass ein Fluoreszenzsignal so intensiv wie möglich erfaßt werden eine zuverlässige Transfektion Ergebnis garantieren zu können. Bezüglich der Transfektionseffizienz Yomogida et al. 21 hat gezeigt, dass the somatischen Sertoli-Zellen offenbar stärker auf die EP-Transfektion als Keimzellen. Wir empfehlen Cotransfektion Hoden mit Zielsteuerung und Plasmiden, jedes kodierend eine unterschiedliche Reportergens.

Der vorgestellte Ansatz ist die Elektroporation für ein breites Spektrum von möglichen Problemen, die sich auf männliche Keimzelle und der Fruchtbarkeit Prozesse. Zum Beispiel kann es für die Analyse von regulatorischen Elementen der Spermatogenese spezifischen Genen 17,22 verwendet werden. Das Verfahren ist auch mit small interfering RNA 23 für Verlust-of-function Studien und gain-of-function Studien 24. Darüber hinaus gibt es vielversprechende Möglichkeiten zu erreichen, selbst EP zur therapeutischen Behandlung und der Erzeugung von transgenen Nachkommen als Forschungsgruppen haben bereits gezeigt, 18,20,25.

Daher ist die illustrierten Roman methodischen Ansatz der Maus in vivo Elektroporation Hoden in Verbindung mit Ausführungsgang microinjection von Plasmid-Konstrukte werden hoffentlich zu einem wertvollen Technik steigen für die Natur der Spermatogenese erfolgreich entwirren.

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Disclosures

Marten Michaelis, Alexander Sobczak, und Joachim M. Weitzel beschäftigt am Institut für Reproduktionsbiologie, Leibniz-Institut für Nutztierbiologie (FBN), Dummerstorf, Deutschland, erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

Wir danken Birgit Westernstroeer des Zentrums für Reproduktionsmedizin und Andrologie an der Universität Münster für die Lehre des Hodenmikroinjektion. Außerdem sind wir dankbar, Ursula und Petra Antkewitz Reckling für die technische Unterstützung. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Unterstützung dieser Arbeit (WE2458 / 10-1).  

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Sigma 1-15 PK
Spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Micropipette puller Narishige PC-10 vertical capillary puller
Microinjection capillaries Clark GC100-10 borosilicate standard wall
Micropipette beveler Bachofer Typ 462 rotating disk beveler
Electroporator Nepagene CUY 21EDIT square wave electroporator
Tweezer electrodes Nepagene CUY 650P5 5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
Cold light source Zeiss KL 1500LCD
Microinjection pump Eppendorf Femtojet
Micromanipulator homemade XYZ cross table
Surgical instruments FST scissors, forceps, needle holder
Fine forceps FST Dumont #5, #7 efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler FST Michel, 12029-12
Michel suture clips FST Michel, 12040-01 7.5 x 1.75 mm
Surgical suture Catgut, Markneukirchen, Germany Catgut 00
Syringe with 30 G needle B. Braun Omnican 40 to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit Promega Cat. # A2495 plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye Sigma F7258-25G for dilution in ddH2O
10% Ketamine Serum Werk, Bernburg, Germany Urotamin mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine Serum Werk, Bernburg, Germany Xylazin mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium Bode Chemie Sterillium disinfection
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide Invitrogen T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl Carl Roth 3957.1
Ibuprofen, Dolormin Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany 01094902 analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl Carl Roth 6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O Carl Roth T106.2
18 mM KH2PO4 Carl Roth 3904.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
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