La génération d'transgénique Hydra Par micro-injection d'embryons

L’objectif global de cette procédure est de micro-injecter de l’ADN plasmatique dans des embryons d’hydre pour produire des lignées transgéniques. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord une solution d’ADN plasmatique et de la charger dans une aiguille d’injection. Ensuite, la solution d’ADN plasmatique est injectée dans des embryons d’hydre entre le un et le huitième stade cellulaire.

Ensuite, les embryons d’hydre sont laissés se développer et éclore et les juvéniles avec des tissus transgéniques sont sélectionnés. L’étape finale consiste à produire une lignée transgénique uniforme par bourgeonnement asexué de l’animal transgénique d’origine. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour visualiser l’expression transgénique chez l’hydre.

Cette méthode a été conçue pour les chercheurs qui souhaitent fabriquer des lignes hydroélectriques transgéniques à faible coût, permettant ainsi une application plus large de cette technologie utile, à la fois pour les chercheurs actuels en hydroélectricité, mais aussi pour ceux qui veulent simplement commencer à utiliser ce modèle. Les hydres transgéniques sont utilisées pour étudier la dynamique des tissus, la localisation des protéines, la fonction des gènes par knockdown et surexpression, ainsi que la fonction du promoteur. Après avoir préparé l’ADN plasmatique selon le protocole textuel, préparez une parabole d’injection en plaçant d’abord un microscope en verre de 75 x 50.

Glisser dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millimètres en biais et dissoudre 2 % d’agros dans 50 millilitres d’hydra media. Laissez refroidir. Ensuite, versez-le dans la boîte de Pétri Une fois que l’agros s’est solidifié, retirez la lame de verre et avec la lame de rasoir, coupez tout excès d’agros pour former un mur.

Ensuite, versez immédiatement hydra medium dans le plat et utilisez-le immédiatement ou conservez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour préparer la solution d’injection, combinez trois microlitres de 2,5 milligrammes par millilitre de solution d’ADN plasma avec deux microlitres de solution de rouge de phénol à 10 %. Vortex brièvement la solution, puis faites-la tourner pendant 10 minutes à vitesse maximale dans une micro-centrifugeuse pour éliminer toutes les particules qui pourraient obstruer l’aiguille sous un microscope à dissection.

À l’aide d’une pince, coupez l’aiguille à quelques millimètres de la pointe pour créer une petite ouverture. Orientez la boîte de Pétri contenant l’aiguille de manière à ce que l’aiguille soit en position verticale avec la pointe vers le bas. Ensuite, pipetez environ 0,5 microlitre de solution d’injection dans l’extrémité arrière de l’aiguille.

Pour préparer les embryons à l’injection, commencez par scanner une culture d’hydre, une souche EP à la recherche de polypes produisant des œufs. Collectez ces polypes et transférez-les dans une boîte de culture séparée. Observez ces polypes toutes les quelques heures pendant la journée pour surveiller la progression de la formation des œufs.

Lorsque les ovules traversent l’ectoderme et reposent sur un anneau de cellules dermiques rétractées, ils sont prêts à être injectés placez des polypes qui ont des œufs prêts à être injectés dans une boîte avec plusieurs hydres qui ont des testicules pendant au moins une heure avant l’injection pour permettre la fécondation si les femelles sont trouvées dans une colonie EP avec des œufs entièrement formés ou un à huit embryons au stade cellulaire. Prélevez-les également pour l’injection avant l’injection. Utilisez un scalpel avec une lame numéro 15 pour retirer la majeure partie du tissu parental au-dessus et en dessous des embryons qui ont commencé à se cliver, ne les laissant qu’avec un petit morceau de la colonne corporelle du parent attaché.

Conservez le tissu disséqué dans le milieu Hydra car il se régénérera et garantira que les femelles restent dans la colonie d’hydres. À l’aide d’une pipette de pâturage, transférez les embryons clivants dans une boîte d’injection, en les disposant parallèlement à la paroi de l’auge agros. Pour préparer le micro-injecteur monté sur un support magnétique qui repose sur une plaque de fer.

Montez le porte-injection, qui fait partie du micro-injecteur qui maintient l’aiguille sur un manipulateur microm joystick. À l’aide d’un support magnétique, montez le manipulateur de joystick sur la plaque de fer. Placez ensuite l’ensemble de l’installation sur le côté droit d’un microscope de dissection et positionnez le support d’injection de manière à ce qu’il soit visible dans le champ d’observation.

Placez la boîte d’injection avec les embryons sous le microscope de dissection orientée de telle sorte que la paroi verticale de l’auge agros soit vers la gauche. Insérez l’aiguille dans le porte-injection et abaissez la pointe de l’aiguille dans le milieu hydra dans le plat. Ensuite, tournez lentement le bouton de la seringue dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que l’huile minérale remplisse le haut de l’aiguille et qu’un jet constant de solution injectable soit observé sortant de l’aiguille dans le milieu hydre.

Si le jet est trop fort, baissez la pression en tournant le bouton dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Centrez un embryon dans le champ de vision et déplacez l’aiguille de manière à ce qu’elle touche l’embryon. Ensuite, utilisez le manipulateur microm pour percer l’embryon avec l’aiguille et laissez la solution d’injection s’écouler dans l’embryon pendant une ou deux secondes avant de retirer rapidement l’aiguille.

Si l’embryon a plus d’une cellule, injectez chaque cellule individuellement. Continuez jusqu’à ce que tous les embryons aient été injectés. Une fois que tous les embryons ont été injectés, transférez-les dans une boîte avec quelques Hydra, un polype EP qui ont des testicules et incubez-les à 18 degrés Celsius pendant qu’ils continuent à subir une embryogenèse.

Lorsque les embryons atteignent le stade de cuticule, déplacez chaque embryon dans un puits d’une plaque de 24 puits remplie de milieu hydra, et incubez pendant deux semaines dans l’obscurité à 18 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection, vérifiez que chaque embryon ne se détache pas du petit morceau de tissu parental et qu’il ne se régénère pas. S’il est présent, retirez-le immédiatement afin qu’il ne soit pas confondu avec un nouveau nouveau-né.

Après avoir vérifié chaque embryon, déplacez la parabole sous une lumière d’aquarium à température ambiante. Vérifiez les plaques chaque jour et récupérez les nouveau-nés. Les nouveaux nouveau-nés seront de couleur blanche car ils n’ont pas encore mangé.

Observez-les au microscope fluorescent pour l’expression des transgènes. Utilisez art napoli pour nourrir les nouveau-nés transgéniques tous les deux à trois jours. Lorsque les nouveau-nés qui sont transgéniques dans le tissu épithélial électrodermique ou endodermique produisent des bourgeons, ils sont évalués pour l’expression transgénique

On voit ici un nouveau-né avec l’expression chimérique d’un rouge Ds, deux transgènes sous le contrôle d’un promoteur d’actine et un patch de cellules épithéliales ectodermiques. Le bourgeonnement continu de l’animal peut éventuellement produire une lignée avec une expression uniforme du transgène dans la lignée épithéliale électrodermale ou endodermique. Comme on le voit ici, le nouveau-né d’origine produit maintenant deux nouveaux bourgeons.

Le bourgeon marqué d’un astérisque, n’a pas de tissu transgénique et a été utilisé comme animal fondateur d’une lignée de contrôle génétiquement identique à la lignée transgénique, à l’exception de la présence du transgène. Cet animal est le premier bourgeon avec des tissus transgéniques produits à partir du nouveau-né d’origine. Grâce à ces expériences utilisant des transgènes qui n’ont aucun impact sur la fonction biologique, des lignées cellulaires épithéliales uniformes ont été établies à partir d’environ 30 % d’hydres qui éclosent avec du tissu transgénique épithélial.

Une ligne électrodermale uniforme, comme on le voit ici, est établie 33 à 50 % moins souvent qu’une ligne endodermique. Donc, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fabriquer des lignes hydroélectriques transgéniques, ce qui s’ajoutera au répertoire d’études fonctionnelles que vous pouvez faire avec ce modèle.