Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

L’objectif global de ce protocole est d’effectuer des changements génomiques ciblés dans une variété de cellules et d’organismes à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques CRISPR/Cas9. Cette méthode peut aider à résoudre des questions biologiques fondamentales en donnant aux chercheurs le pouvoir de générer des insertions, des suppressions et des substitutions conçues sur mesure dans des génomes autrement non modifiés d’organismes modèles et non modèles. Le principal avantage de l’utilisation de complexes de ribonucléoprotéines ou de RNP au lieu de l’ADN plasmidique est que l’efficacité est plus élevée et que les événements hors cible sont réduits.

Les implications de cette technique s’étendent aux thérapies ex vivo pour lutter contre le cancer, le VIH ou les maladies génétiques. En effet, l’édition du génome peut être utilisée pour corriger des mutations nocives ou même améliorer la capacité des cellules à combattre des maladies nocives. Cette méthode peut donc fournir des informations sur les cellules humaines primaires, C. elegans et Parhyale hawaiensis.

Il peut être appliqué pour apporter des modifications génétiques à des centaines d’autres systèmes, y compris des organismes auparavant intraitables. Commencez cette procédure par la conception et la préparation de l’ARN guide comme décrit dans le protocole de texte. Assemblez un complexe RNP en mélangeant une à deux molaires d’ARN guide avec 200 picomoles de protéine Cas9 dans un volume total de 10 microlitres.

Très lentement, ajoutez du Cas9 concentré à l’ARN guide pendant environ 30 secondes, en faisant des cercles rapides avec la pipette. Portant la concentration finale de Cas9 à 20 micromolaires. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de RNP dans chaque cuvette bien.

Après avoir préparé les HSPC comme décrit dans le protocole textuel, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et transférez 150 000 à 200 000 cellules par cuvette à électroporer dans un tube de centrifugation. Faites tourner le tube à 100 fois la gravité pendant 10 minutes pour granuler les cellules. Aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur, en éliminant les bulles.

Remettez doucement les cellules en suspension avec 20 microlitres de tampon d’électroporation par cuvette bien. Ensuite, ajoutez 20 microlitres des cellules qui contiennent 150 000 à 200 000 HSPC dans chaque cuvette qui possède déjà 10 microlitres de RNP et mélangez bien en pipetant de haut en bas sans créer de bulles. Enfin, électroporez les cuvettes après les avoir placées dans un Nucleofector.

Pour les HSPC, utilisez le code d’impulsion ER-100. Commencer par la préparation de C. elegans dans des coussinets d’agarose comme décrit dans le protocole de texte. Placez un tampon d’injection d’agarose et une lamelle sur un endoscope de dissection.

Utilisez un pic à vis sans fin pour poser une petite trace d’huile d’halocarbure le long d’un bord du tampon. Ensuite, utilisez le cure-vis recouvert d’huile pour soulever plusieurs vers de la plaque de gélose NG et les déposer dans la trace d’huile. À l’aide d’un poil fin attaché à une pipette, comme un cil ou une moustache de chat, positionnez les vers en parallèle, en poussant doucement les vers dans le tampon d’agarose.

Jusqu’à ce que vous soyez à l’aise avec la procédure de micro-injection, ne montez et injectez qu’un ver à la fois. Une fois en position et fixé au tampon, recouvrez les vers avec quelques gouttes supplémentaires d’huile d’halocarbure à partir de la pointe du pic à vers. Placez la lamelle avec les vers montés sur le microscope à injection.

Sous un faible grossissement, positionnez les vers perpendiculairement à l’aiguille d’injection qui a été remplie avec la solution RNP, comme décrit dans le protocole de texte. Passez à un grossissement élevé et repositionnez l’aiguille adjacente au bras gonadique, correspondant à la région près des noyaux chez le pachytène moyen à tardif. À l’aide du micromanipulateur, déplacez l’aiguille contre le ver, en enfonçant légèrement la cuticule.

Ensuite, d’une main, tapotez le côté de la platine du microscope pour faire passer l’aiguille à travers la cuticule. Appuyez sur la palette ou le bouton d’injection, remplissez lentement le bras de la gonade avec le mélange d’injection et retirez l’aiguille. Répétez l’étape avec l’autre bras gonadique.

Une fois les vers injectés, retirez la lamelle et le tampon d’agarose et placez-les sous un microscope à dissection. À l’aide d’une pipette capillaire tirée, déplacez l’huile des vers en pipetant un tampon M9 sur eux. Effectuez ce traitement pour libérer les vers de l’agar.

Au bout de 10 minutes, lorsque les vers se débattent dans le tampon, déplacez-les vers une plaque de gélose NG avec des bactéries OP50 à l’aide de la pipette capillaire tirée. Placez l’assiette à 20 degrés Celsius pendant deux à trois heures jusqu’à ce que les vers se soient rétablis et se déplacent. Une fois récupérés, transférez individuellement les vers sur des plaques de gélose NG avec OP50.

Ensuite, transférez les plaques dans un incubateur à 25 degrés Celsius. Prélever les embryons de Parhyale à cellules uniques entre zéro et quatre heures après la fécondation en anesthésiant d’abord les femelles gravides avec 0,02 % d’huile de clou de girofle et de l’eau de mer. Grattez doucement les embryons de sa poche ventrale à l’aide d’une pipette en verre arrondie tirée par une flamme et d’une paire de pinces numéro trois.

À l’aide d’azote compressé, injectez les embryons de Parhyale sous un microscope de dissection à l’aide d’un micro-injecteur et d’un micromanipulateur. Chargez 1,5 microlitre du mélange d’injection à l’arrière d’un tube capillaire tiré à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur. Après avoir placé l’aiguille sur l’appareil d’injection, cassez la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince sous la lunette de dissection.

Calibrer le volume délivré en injectant dans de l’huile Halocarbure 700 et en mesurant le diamètre de la bulle. Découpez une auge dans l’agent de durcissement à l’aide d’une lame de rasoir. Remplissez-le à moitié d’eau de mer stérilisée par filtre et alignez les embryons de Parhyale dans l’auge pour l’injection.

Injectez les embryons à l’aide du dispositif de micro-injection, en stabilisant chaque embryon à l’aide d’une paire de pinces pendant l’injection. Après l’injection, utilisez une pipette de transfert en verre pour transférer les embryons dans une boîte de culture fraîche de 60 millimètres remplie à moitié d’eau de mer stérilisée par filtre avant de disséquer et de fixer les embryons à différents stades. Fabriquez des aiguilles de dissection en enfilant un morceau de fil de tungstène plié d’environ 0,5 pouce de longueur à l’extrémité d’une aiguille à insuline.

Utilisez une seringue d’un millilitre comme poignée de l’aiguille de dissection et aiguisez l’aiguille dans de l’hydroxyde de sodium sous un courant. Remplissez à moitié un puits d’un plat en verre à trois puits avec une solution fraîchement préparée de neuf parties de tampon PEM, une partie de 10X PBS et une partie de 32 % de PFA. Placez trois à cinq embryons dans le plat et percez un petit trou dans chaque embryon à l’aide d’une aiguille en tungstène pointue pour piquer et d’une aiguille légèrement émoussée pour stabiliser, permettant au jaune de s’écouler et au fixateur de s’écouler.

À l’aide d’une paire d’aiguilles de tungstène aiguisées, retirez doucement les deux membranes externes entourant l’embryon de Parhyale. Disséquez-les dans un fixateur pour rendre les embryons plus robustes, mais travaillez rapidement pour empêcher la membrane de se fixer à l’embryon, ce qui rend l’élimination de la membrane plus difficile. Laisser les embryons se fixer pendant un total de 15 à 20 minutes pour la coloration des anticorps, ou de 40 à 50 minutes pour l’hybridation in situ.

Parfois, les résultats d’une expérience d’édition sont mieux évalués par le biais d’un test expérimental. Les résultats représentatifs des lymphocytes T de type sauvage et des cellules knock-out CD25 sont présentés ici. La cytométrie en flux montre que les cellules qui n’ont pas été modifiées avec Cas9 RNP expriment CD25.

Cependant, les cellules dans lesquelles CD25 a été éliminé n’expriment pas la protéine. Pour les perturbations à grande échelle, les résultats de l’édition peuvent avoir des phénotypes visuels clairs. Par exemple, les Parhyale hawaiensis de type sauvage ont des abdomens normaux avec des pattes natatoires et d’ancrage.

La perturbation du gène Abd-B remplace les pattes de nage et d’ancrage abdominales par des jambes de saut et de marche, qui ne sont généralement associées qu’au thorax. En plus de vérifier les phénotypes, les expérimentateurs doivent également analyser le génotype pour évaluer l’efficacité globale de l’édition et détecter des changements génétiques spécifiques. Pour les clones uniques, cela peut être réalisé par un simple séquençage de Sanger.

Dans les populations mixtes de cellules, une analyse de séquençage plus poussée est recommandée. Par exemple, TIDE peut cartographier tous les différents indels qui se sont produits dans les cellules individuelles d’un pool édité RNP. Lors de la première tentative de cette procédure, essayez d’utiliser l’un des contrôles positifs que nous avons répertoriés dans le tableau un.

L’utilisation d’un ARN guide éprouvé peut vous aider à vous faire une idée de l’édition avec RNP avant de concevoir votre propre expérience.