추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

Biology

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Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

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Abstract

아나스타시스 ( "생활에 상승"에 대한 그리스어) 죽어가는 세포의 회복을 의미한다. 이들 세포의 회복 전에, 미토콘드리아 단편화, 세포질 내로 미토콘드리아 사이토 크롬 C의 방출, 카스파 제 활성화, 크로 마틴 응축, DNA 손상, 핵 분열, 세포막에 blebbing, 세포 수축, 세포 표면 노출을 포함한 세포 사멸 중요한 체크 포인트를 통과 한 포스파티딜 세린, 및 세포 사멸 기관의 형성. 세포 사멸 자극함으로써 죽어가는 세포가 사멸하고 잠재적으로 다른 죽음의 메커니즘을 취소 할 수 있도록, 죽음 이전에 제거 될 때 아나스타시스가 발생할 수 있습니다. 따라서, 아나스타시스는 부적절하게 손상된 세포를 유지할 수있는 생리적 치유 과정을 포함 나타납니다. 기능 및 메커니즘 아나스타시스 명백하게 건강한 세포의 복구 후에 과거 사건을 검출하기위한 제한된 도구에 의해 부분적으로 방해, 여전히 불분명하다. 전략 anasta를 검출SIS는 아나스타시스를 변조 생리 메커니즘 연구, 질병 병리 언데드 세포의 유해성과 잠재적 인 치료제를 가능하게 할 것이다. 여기서 우리는 살아있는 세포 현미경 및 포유 동물 세포에 아나스타시스를 식별하고 추적하기위한 포유 동물 카스파 바이오 센서를 사용하여 효과적인 전략을 설명합니다.

Introduction

세포 사멸 ( "죽음에 떨어지는"에 대한 그리스어)는 일반적으로 세포 자살 1-7로 끝나는 단방향 프로세스로 간주됩니다. 이미 세포 사멸 경로의 8,9을 시작했다 세포를 포함, 그렇지 않으면 전체 동물에 죽을 것 여분의 세포의 생존에 프로 죽음 유전자 결과의 유전 중단. 마찬가지로, 유전자 조작 인위적으로 표시 신호를 "날 먹고"또는 자신의 세포 외 기질 접착 성을 잃게 건강한 포유 동물 세포는 모든 세포의 식균 작용 또는 entosis 각각 10, 11에 의해 죽음을 탈출 할 수 있습니다. 그러나, 우리와 다른 사람들은 또한 세포 사멸 12-15의 초기 단계에서 복구 할 수 있습니다 유전자 조작 정상적인 건강한 포유 동물 세포 및 세포 선없이 것을 보여 주었다. 세포는 전형적인 중요 체크 포인트를 통과 한 후 각각의 세포를 추적 할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 또한, 세포 사멸 (12, 13)의 후반 단계에서 복구를 증명하고있다해동 2-6 "니나"를 표시합니다. 최종 단계의 세포 사멸이 체크 포인트는 미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스, 카스파의 활성화, 핵 분열 및 세포 사멸 기관의 형성을 포함한다. 우리는 세포 사멸 2-6의 위기에서 세포 사멸이 반전을 설명하기 위해, "생활에 상승"을 의미 그리스어 합성어 "아나스타시스"을 채택했다.

전체 죽어 복구 프로세스가 라이브 세포 이미징에 의해 관찰되지 않는 한,이 세포 사멸 이벤트를 경험하지 못한 세포에서 아나스타시스를받은 세포를 구별하기 위해 도전하고있다. 작품의 수십 년 세포 사멸에 의한 세포 자살의 형태 적 특징은 진화 적으로 보존 된 생화학 및 분자 이벤트 16-19에 의해 구동되는 것을 밝혀졌다. 이러한 이벤트는 손상 또는 d 제거하여 단세포와 다세포 생물의 발달과 homoeostatic 과정을 조절하는 세포의 자기 파괴를 촉진angerous 세포 16-19. 사멸 세포에 쉽게 사멸 1,5,6,16,20의 표준화, 형태 학적, 생화학 및 분자 발현에 의해 구별 될 수 있지만, 현재 아나스타시스 12, 13에 해당 알려진 마커가 없습니다. 중요한 것은, 아나스타시스를받은 세포는 정상적인 건강한 세포, 단지 세포 사멸을 반대로 시작 세포 표시와 같은 세포 사멸 죽어가는 세포 (12, 13)로 나타납니다. 따라서, 새로운 도구는 주어진 생존 세포가 이전의 활성 세포 사멸 과정을 경험했다 확실하게 결론을 내릴 필요가있다.

이 신속하고 대규모 파괴 과정이기 때문에 세포 사멸은 일반적으로 돌이킬 수없는 계단식으로 가정한다. 미토콘드리아는 세포질 (21, 22)에 시토크롬 C와 같은 apoptogenic 요인을 발표 한 후에는 일부 세포가 세포 사멸을 시작하는 것이 일 분 정도 걸릴 수 있지만, 카스파는 5 분 23, 24 내에서 활성화 세포질 다음에 할 수 있고,핵 10 분 25 ~ 27 내에서 응결 및 세포 사멸 잠시 후 25-27. 활성화 된 카스파은 절단과 같은 엔도 뉴 클레아 제 억제제 DFF45 / ICAD 29,30로서 셀룰러 철거 2,28의 주요 목적 구조적 및 기능적 구성 요소를 비활성화하여 아폽토시스를 조율. 카스파는 또한 31, 32 크롬 c의 미토콘드리아 방출을 촉진하는 미토콘드리아에 옭 BCL-2 가족의 BID, 같은 프로 세포 사멸 인자를 활성화합니다. 카스파 활동은 또한 탐식 33 대 식세포 또는 인접 세포에 의한 세포 죽음의 말림을 촉진하기위한 "날 먹고"신호로 포스파티딜 세린의 세포 표면에 노출되는 결과를 초래한다. 또한, 세포 사멸 이벤트는 세포 생체 에너지 대사의 34,35,36를 방해하는 역기능 미토콘드리아는, 렌더링합니다. 따라서, 이러한 파괴를 복구 직관적 아닌 것 같습니다.

원래는 달리 기대관리 포인트, 세포도 늦은 단계에서 사멸 세포 사멸 과정을 취소 할 수 있습니다. 지속적으로 배양 세포를 죽음의 운명을 모니터링함으로써, 우리는 일차 전지 및 세포주 12, 13의 범위에서 후기의 세포 사멸의 가역성을 관찰했다. 죽음의 자극의 제거는, 이러한 미토콘드리아의 분열, 염색질 응축, DNA 손상, 세포막에 blebbing, 포스파티딜 세린의 세포 표면에 노출, 미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스, 카스파 제 활성화, 핵 분열, 세포의 수축으로 세포 사멸의 명백한 기능에서 복구를 허용 세포 사멸 몸과 형성. 이러한 관찰은 아나스타시스의 기능, 결과, 및 메커니즘에 관한 대답없는 질문을 올립니다. 이러한 질문을 해결하기 위해, 전제 조건은 안정적 아나스타시스를받은 세포를 식별하는 것입니다. 여기서는 라이브 현미경 방법 및 이전 말기 아폽토시스 번째 반전 한 세포를 검출하기위한 바이오 센서를 카스파 서술욕실은 살아 남았다.

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Protocol

라이브 세포 이미징을위한 세포의 1. 준비

  1. 형태 학적 변화의 검출을 용이하게하기 위해, 예컨대 HeLa 세포 (인간 자궁 경부암)보다 세포막 및 세포 내 소기관의 변형을 시각화하는 기판 상에 편평 세포와 같은 부착 세포를 선택한다.
    참고 : 세포 사멸의 반전은 기본 마우스 간 세포, 기본 마우스 대 식세포, 차 쥐의 심근 세포 등 다양한 포유 동물 세포 12, 13, 관찰하고, 또한 인간 배아 신장 HEK-293T 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 COS와 같은 라인 셀되었습니다 -7 세포, 마우스 심근 HL-1 세포는 마우스 NIH 3T3 섬유 아세포, 색출 뇌 CRL1656 세포, 인간의 피부 암 A375 세포, 인간 고환암 CRL1973 세포, 인간 소세포 암종 H446 세포, 인간 간암 (Mustela는 푸로을 putoris) 인 HepG2 세포, 인간 유방암 MCF7 세포, 인간 전립선 암 PC3 세포, 및 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포.
  2. 청소 및 살균 무수 에탄올과 유리 바닥 세포 배양 접시의 사전 세척 커버 글라스.
    주 1 : 유리 바닥 요리를 사용하는 높은 품질의 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경, 높은 배율 공 촛점 또는 에피 형광 현미경 (토론 참조)을 권장합니다.
    주 2 : 높은 배율 (40 배, 60 / 63X 또는 100X 목표와 높은 개구 1.3 또는 1.4)의 경우, 얇은 유리 바닥 (두께 0.085-0.16 mm)와 세포 배양 접시의 사용이 영상에 대한 거리를 작동 이상 제공 (프로토콜 3 참조 ).
  3. 세포 유형에 따라, 유리 바닥 배양 접시 폴리 -D- 라이신 (0.1 ㎎ / ㎖), 콜라겐 (0.01 M 아세트산 0.01 % 용액) 및 / 또는 피브로넥틴 (5 ㎍ / ㎖) 전에 시딩으로 코팅 필요할 수도 세포.
    주 : 유형 및 코팅제의 농도의 최적화가 다른 세포주에서 요구된다. HeLa 세포는 않고 코팅 된 유리 상에 직접 부착 할 수있다. 그러나, 일부 셀, SU채널 마우스 심장 근육 HL-1 세포로, 유리 표면에 직접 부착하지만, 특정 문화 및 코팅 프로토콜 37을 필요로 할 수 없습니다.
  4. 씨앗 ~ 35mm 사전 코팅 유리 바닥 세포 배양 접시에 2 ~ 3 × 10 5 세포와 80 %의 포화 상태를 달성하기 위해 하루에 5 % CO 2 (° C) 37도 섭씨 부화.
    주 1 : 세포 밀도, 배양 시간 및 배양 조건을 최적의 조건은 세포 유형에 따라 다양 할 수있다. 셀 컨 플루 셀 (프로토콜 2 참조)의 세포 사멸 반응에 영향을 줄 수 있습니다. 높은 포화 상태에서, 세포는 세포 사멸 자극의 동일한 농도에 덜 민감 할 수 있습니다.
    높은 세포 밀도는 각각의 세포 및 세포 소기관의 형태 학적 변화를 가릴 수, 융합 세포를 통해 피하십시오 : 주 2.

2. 응용 프로그램 및 사멸 세포 자극의 제거

  1. 사용 직전에, 37 ° C 세포 배양 배지와 세포 자멸 유도제를 미리 혼합한다. 에탄올 (3.6-4.5%의 부피 / 부피)은 본 데모에 고사 유발 역임했다.
    주 1 : 우리의 출판되지 않은 데이터가 세포 또한 디메틸 설폭 사이드 (DMSO, 24 시간 동안 8 % 부피 / 용적), 스타 우로 스포린 (STS, 0.5 μM에 관해서는, 다른 세포 사멸 자극 (12, 13)에 의해 유발되는 세포 사멸을 취소 할 수 있음을 입증 1 시간) 및 탁솔 (12 시간 1 μM). 세포 자멸 유발을위한 투여 량의 최적화는 세포 사멸을 겪는 세포의 집단에서 대부분을 트리거 할 수있는 최소 투여 량을 달성하기 위해 서로 다른 종류의 세포에 대해 요구된다.
    주 2 : 세포 배양 배지와 세포 자멸 유도제를 미리 혼합하여 아포토시스를 자극하는 세포의 불균일 한 노광을 방지하는 것이 중요하다.
  2. 이미지 기준 모폴로지를 확립 아폽토시스 유도제를 적용하기 전에 세포 배양 접시에 세포의 건강 군.
  3. 세포 배양 접시에서 원래 매체를 제거한 다음에 접시에 미리 혼합 세포 사멸 유도제 2 ㎖를 적용세포 사멸을 받아야하는 세포를 트리거합니다. 5 % CO 2 (또는 다른 통상의 배양 조건)으로 37 ℃에서 세포를 배양한다.
  4. 인큐베이션 후, 세포 자멸 기능의 진행을 모니터링하는 광, 또는 에피 형광 공 초점 현미경으로 세포를 관찰한다.
    주 1 : 아폽토시스를받은 세포를 현미경 및 형광 기반의 바이오 센서에 의해 검출 될 수 아폽토시스의 형태 학적, 생화학 적 및 분자 적 특징을 표시하는 것이다 (참조 :도 3 및 4 프로토콜).
    주 2 : 다른 세포 사멸 유도 물질과 세포의 배양 시간은 세포 유형 (예 : 포화 상태와 영양 상태와 같은) 세포 조건 및 적용 죽음 자극의 용량에 따라 달라집니다. 주의 적정이 필요할 수 있습니다.
  5. 세포 아폽토시스의 특징을 표시 할 때, 따뜻한 (37 ° C, 또는 기타 통상의 배양 온도) 새로운 세포 배양 배지로 한번 세척하여 세포를 세포 자멸 유도제를 제거한다.
    주 1 : 사멸 세포가 더 느슨하게에 부착되면배양 접시, 그것은 적용하고 세포 씻겨되지 않도록 부드럽게 매체를 제거하는 것이 중요하다.
    주 2 : 라이브 중단 세포는 부드러운 원심 분리 (160 XG 1 분)하여 상층 액을 회수하고 다시 배양 접시에 추가 할 수 있습니다.
  6. 2 ㎖ / 5 % CO 2에서 신선한 세포 배양 배지의 35mm 접시에 37 ° C에서 세포를 배양한다. 대안 적으로, 사용 된 배지 (건강한 세포로부터 수집 된 무 세포 배양 배지) 상기 사멸 세포의 생존을 개선한다.
    주의 : 세척하고 신선한 배지로 배양 한 세포가 세포의 대부분이 에탄올에 노출 12,13 후 에탄올 - 유도 아폽토시스를 반전 할 수있다. 그러나, 다른 세포가 아폽토시스 자극에 노출 될 때이 세정 공정이 요구 될 수있다 반복 (설명 참조).

3. 라이브 세포 현미경

  1. 우리는 환경 제어와 반전 공 촛점 또는 에피 형광 현미경 (37 ° C를 사용하는 것이 좋습니다생균 현미경 5 % CO 2).
    참고 : 또한 물 담금 목적으로 직립 현미경을 사용하여 세포 이미지에 가능하다. 화상 세포 배양 배지로 직접 대물 담근다. 그러나, 세포 초점 동안 침지 목적에 의해 분쇄 할 수있다.
  2. 사전 예열 (예 : 환경 제어 챔버, 무대 인큐베이터, 객관적 히터 등) 현미경 이미징 전에 적어도 2 시간을.
    주의 : 이것은 포커스 및 XY 평면의 시프트의 편차를 방지 할 수 있도록 현미경 성분으로 인해 부품의 열팽창 및 수축에, 열 평형에 도달 할 수있다.
  3. 배양 된 세포의 35mm 유리 바닥 접시를 놓고 거꾸로 현미경의 무대에 (프로토콜 1 참조)에서 세포 이미징을위한 개구 수 (NA) 1.3 또는 1.4 40X 또는 63X 계획 - 고차 색지움 목표를 사용하여 셀 이미지를 캡처 커버 글라스를 통해 요리의 바닥.
    주 : 매체의 2 이상 ml에 적용하지 마십시오매질의 중량을 동일 초점면에 영상을 힘들게 세포의 제조 분야, 유리 바닥의 곡률을 일으킬 수 35mm 유리 접시 바닥에.
  4. 전체 화상 형성 공정 동안 또는 37 ° C의 온도에서 대응하는 정상 세포를 유지한다.
    참고 : 세포 사멸의 과정, 세포 사멸의 가능성 반전, 온도에 민감한 효소 활동에 따라 달라집니다. 따라서, (스테이지 현미경 가기 인큐베이터 예) 37 ° C에서 세포를 유지하는 실험을하는 것이 중요하다. 감소 온도는 세포 사멸 반응과 세포 사멸 자극의 제거 후 복구 응답 속도를 느리게 할 수있다.
  5. 매체로부터 증발에 의해 수분 손실을 감소시키기 위해 배양 접시에 투명한 호 (참고 물질) 습도 장치를 사용 또는 누워.
    주 : 호일 DIC 현미경 용의 광의 극성을 방해 할 수있다. 빛의 경로에 편광판을 조정하여 극성을 복원합니다.
  6. 의 pH를 유지현미경 환경 제어 챔버와 5 % CO 2에서 배양함으로써 세포 배양 배지 (PH 6.8 -7.3).
    주 : 배지의 pH가 또한 HEPES 완충액을 첨가함으로써 달성 될 수있는 유지 보수 또는 상업적 CO 2 -independent 매체를 이용하여 (원료 참조). 최적의 조건은 세포 유형에 따라 다양 할 수있다.
  7. 세포 / 세포 이하의 구조 또는 발현 바이오 센서 (프로토콜 4의 상세)의 고품질 화상을 얻기 위해 필요한 최저 형광 강도를 감소시킴으로써 광독성을 피하기 위해 화상 형성 공정 동안 세포에 형광 / 레이저 (여기 광 강도)의 노출을 최소화.

동안과 사멸 이벤트 후 검색 및 추적 아나스타시스 4. 전략

  1. 세포막에 blebbing, 세포질의 응축, 세포의 수축 및 세포 자멸 체 형성 (도 1a 참조 - C, E)를.
    1. 시간 경과 라이브 셀 diffe를 수행rential 간섭 대비 (DIC) 또는 위상차 현미경 건강 셀의 그룹을 추적하는 자신의 세포 형태를 (생균 현미경 프로토콜 3을 참조하고 설명 참조) 관찰.
      주 1 : 셀에 광독성을 방지하기 위해 DIC / 상 계약 이미징을위한 광원의 강도를 줄일 수 있습니다.
      주 2 : DIC 및 위상차 현미경을 사용할 수없는 경우, 또는 공 촛점 에피 형광 현미경 생균의 윤곽 형태 및 세포 형태를 모니터링하는 세포질 얼룩이 CellTracker를 사용한다.
    2. (응용 프로그램 및 세포 사멸 자극의 제거를위한 프로토콜 2 참조) 세포 사멸을 받아야하는 세포를 트리거하기 위해 세포 사멸 자극을 적용합니다.
    3. 이러한 세포막에 blebbing, 세포질 응축, 세포의 수축 및 세포 자멸 형성 체 (도 1A, 1B, 1C, 1E)와 같은 아폽토시스의 형태 학적 특징에 대해 처리 된 세포를 관찰한다.
    4. 신선한 매체 세포 죽음 자극, 재 공급 세포를 씻어 표시세포 사멸의 Y 형태 학적 특징.
      주 1 : 세포 사멸 자극을 주거나 관류 세포 배양 챔버를 사용하여 달성 될 수 경과 생균 촬상 중에 현미경 스테이지 세포 배양 배지를 변경하거나 신중 건드리지 않고 피펫 팅하여 세포 배양 접시에서 직접 수행 될 수있다 이미지 사이의 간격 동안 요리.
      주 2 : 사용 포커스 드리프트 보상 시스템은 세포 배양 배지를 (설명 참조)을 변경 한 후 현미경 시스템의 열 균형의 손실로 인한 세포의 초점 피하기.
    5. 연속 시간 경과 이미징은 세포 사멸의 특징을 표시 세포의 운명을 추적 할 수 있습니다. 세포 사멸을 반대로 세포는 손상을 복구하고 일반 평판 형태 (그림 1A, 1B, 1C, 1E)를 회복 할 수 있습니다.
  2. 미토콘드리아 분열, DNA / 염색질 응축, 핵 분열 (그림 1D, 1 층, 1G 참조).
    1. mitochond를 시각화RIA, 50 nM의 MitoTracker 레드 / 깊은 적색 / 녹색 형광 염료로 염색 세포, 동시에 5 % CO 2, 37 ℃에서 20 분 동안 배지에서 훽스트 33342 청색 핵 염료의 10 ㎍ / mL를 핵을 염색.
      주 1 : 세포 독성을 피하고 필요시 배경 형광 염료를 감소시키기 위해 배양 기간의 농도를 감소. 염색 용 염료 및 인큐베이션 시간의 최소량 잡음비 양호한 신호를 얻는 염색 조건을 최적화한다.
      2 주 : 이러한 세포 사멸 동안 미토콘드리아에서 밖으로 누출되지 않습니다 MitoTracker 레드 CMXRos, MitoTracker 딥 레드 FM, 또는 MitoTracker 녹색 FM, 같은 미토콘드리아에 대한 형광 얼룩을 사용합니다. 이 세포 사멸과 아나스타시스 동안 미토콘드리아 형태를 시각화 할 수 있습니다. 이러한 얼룩에 대한 자세한 내용은 재료 및 장비의 표를 참조하십시오.
    2. 광표백을 피하기 위해 어둠 속에서 염색 된 세포를 보관하십시오.
    3. 세포를 세척하여 과잉 얼룩 제거다음, 1 분마다 세척 사이의 신선한 배지에서 배양하고, 37 ° C 인산 완충 식염수 (PBS) 용액 또는 새로운 세포 배양 배지로 3 회 더 과도한 있도록 최종 세척하기 전에 20 분 동안 신선한 배지에서 인큐베이션 얼룩 이미징을위한 비 특정 신호 배경을 줄이기 위해 세포를 종료합니다.
      참고 : 염색이 영상에 대한 높은 배경이 발생할 수 있습니다 후 세포 배지와 배양 시간을 줄이십시오.
    4. 아폽토시스 유도가 적용되기 전에 화상 건강한 세포 실시간에게 생균 촛점 또는 에피 형광 현미경을 수행 (생균 현미경 프로토콜 3 참조).
      참고 : 건강한 세포는 대부분의 세포 유형에 (그림 1D, 1 층, 1G)를 관 미토콘드리아 둥근 핵을 표시합니다.
    5. (세포 응용 프로그램 및 세포 사멸 자극의 제거를위한 프로토콜 2 참조) 세포 사멸을 받아야하는 세포를 트리거.
    6. 미토콘드리아와 핵 morpholog의 변화를 관찰하는 라이브 세포 현미경 시간 경과 계속죽음의 자극이 세포에 적용 직후 이거 야. 관상 미토콘드리아 둥근 핵을 표시하는 건강한 세포는 대조적으로, 이러한 미토콘드리아 분열과 부종, 염색질 응축 핵 분열로 세포 사멸의 특징을 표시하는 세포를 관찰합니다.
    7. 세포가 세포 사멸의 특징을 표시 할 때, 씻어 신선한 배지로 세포를 공급하고, 세포의 운명을 추적하기 위해 시간 경과 영상을 계속합니다. 세포 사멸을 역 세포는 정상적인 미토콘드리아 및 핵 형태 (그림 1D, 1 층, 1G)를 회복.
      주 : 세포 (DIC 현미경 용 프로토콜 4.1 참조)의 동일한 그룹에 세포 형태의 변화를 관찰함으로써 아폽토시스의 스테이지들을 액세스하기위한 추가 정보를 얻기 위해 가능하면 병렬 DIC 현미경을 수행한다.
  3. 안정적으로 사이토 크롬 C -GFP 융합 홍보를 발현하는 세포를 사용하여 C 사이토 크롬의 미토콘드리아 릴리스의 검출otein (그림 2 참조).
    1. 안정적으로 MitoTracker 레드와 -GFP 23, 24 C의 사이토 크롬을 표현 얼룩 세포 편광 세포 미토콘드리아가 (라이브 세포 미토콘드리아 염색을 위해 4.2.3 단계 4.2.1 참조) 레이블을.
    2. 건강한 세포 (라이브 세포 이미징을위한 프로토콜 3의 세부 사항)을 추적하는 실시간 라이브 세포 공 촛점 또는 에피 형광 현미경을 수행합니다.
      주 : 사이토 크롬 C -GFP 신호가 주로 건강한 세포 (도 2a I, 2B)의 미토콘드리아에 편재.
    3. (세포 응용 프로그램 및 세포 사멸 자극의 제거를위한 프로토콜 2 참조) 세포 사멸을 받아야하는 세포를 트리거. 세포질로 미토콘드리아에서 시토크롬 C의 -GFP의 전위를 관찰 할 시간 경과 현미경을 계속합니다 (그림 2Aii-III, 2B).
      참고 : 세포질에 시토크롬 C의 미토콘드리아 자료는 미토콘드리아 외막 투과성으로의 마커 (MOMP)4 미토콘드리아 의존성 사멸 21,22에서 중요한 단계
    4. 세포의 세포질 내에 사이토 크롬 C -GFP 신호를 표시 할 때, 세포 사멸 자극을 제거하고 세포를 공급 신선한 배지로 (2 프로토콜 참조). 세포질 GFP와 세포의 운명을 추적하기 위해 시간 경과 영상을 계속합니다.
      참고 : 정상 세포의 형태를 회복 세포 사멸 역 셀, 미토콘드리아로 다시 아마도 저하 또는 전위를 통해 세포질 사이토 크롬 C -GFP 신호를 감소 (그림 2Aiv-VII, 2B).
    5. 단일 세포 또는 세포 그룹 (DIC 현미경 용 프로토콜 4.1 참조) 세포 형태의 변화를 관찰함으로써 아폽토시스의 스테이지들을 액세스하기위한 추가 정보를 얻기 위해 병렬로 DIC 이미지 캡처.
  4. 카스파 바이오 센서를 사용하여 카스파 제 활성의 검출은 (도 3 참조)
    1. 대한 카스파 바이오 센서 NES-DEVD-YFP-NLS와 형질 세포16 사멸 자극 (13)에 쓰는 전에 시간 24.
    2. (라이브 세포 핵 염색을위한 단계를 4.2.3에 4.2.1 참조) 세포 핵에 라벨을 훽스트 33342로 형질 전환 된 문화를 얼룩.
    3. 건강한 세포 (라이브 세포 이미징을위한 프로토콜 3의 세부 사항)을 추적하는 실시간 라이브 세포 공 촛점 또는 에피 형광 현미경을 수행합니다.
      참고 : NES-DEVD-YFP-NLS 바이오 센서 신호는 주로 핵 수출 신호 (NES) (그림은 3A, 3Bi 및 3C는, 토론 참조)로 인해 건강한 세포의 세포질에서 지역화합니다.
    4. (세포 응용 프로그램 및 세포 사멸 자극의 제거를위한 프로토콜 2 참조) 세포 사멸을 받아야하는 세포를 트리거. YFP의 핵 전위를 관찰 할 시간 경과 현미경을 계속합니다.
      참고 : 카스파 절단의 활성화 핵 세포질에서 YFP-NLS 전위의 결과로 카스파 바이오 센서 NES-DEVD-YFP-NLS의 DEVD 모티브 (그림 3A, 3Bii-IV는, 토론 참조).
    5. 세포 자멸은 정상 세포 형태를 회복 역방향 셀이지만 핵 YFP 신호 (도 3Bv-X, 셀 1과 2, 및 3D)를 유지 참고.
    6. 핵 YFP를 표시 세포의 운명을 추적하기 위해 시간 경과 영상을 계속합니다.
      참고 : 핵 YFP 신호가 세포 사멸 반전 한 후 (그림 3B, VI-X, 셀 1을, 결과 및 고찰 참조) 저하 몇 시간이 될 아마도 같은 프로 테아 좀 저하로 정상 세포 통관 메커니즘을 통해 것입니다.
    7. 셀 형태의 단일 셀 또는 셀들의 그룹의 변화를 관찰함으로써 아폽토시스의 스테이지들을 액세스하기위한 추가 정보를 얻기 위해 병렬로 DIC 이미지 캡처. (DIC 현미경을위한 프로토콜 4.1 참조).
  5. 포스파티딜 세린의 세포 표면 노출 (도 4 참조)
    1. GL에 종자 세포엉덩이는 80 %의 세포 포화 상태 (프로토콜 1 참조) 달성 된 커버.
    2. (살아있는 세포의 미토콘드리아와 핵 염색을위한 단계를 4.2.3에 4.2.1 참조) 각각 미토콘드리아 및 핵에 대한-적색 형광 MitoTracker과 파란색의 Hoechst 33342 얼룩 세포를 공동 얼룩.
    3. 고사 유발 인자를 사용하여 아폽토시스를 겪게에 셀을 트리거 (이 프로토콜 참조).
    4. 사멸 세포의 표면에 노출되는 포스파티딜 검출하는 고사 유발 인자를 제거하기 전에 37 ℃에서 세포 자멸사를 10 분 염색하는 형광 표지 된 아 넥신 V를 (원료 참조) 적용한다.
      주 1 : 포스파티딜 정상적으로 세포 원형질막 (38)의 내부 - 상 전단지 압수되므로 건강한 세포는 아 넥신 V 염색되지 않는다. 세포 사멸은 세포 표면 (도 4a 및도 4b)에 포스파티딜 세린에 결합 넥신 V, 염색된다.
      주 2 : 형광 표지 된 아 넥신 V는 세포 사멸 IMM 염색 적용될 수있다ediately 10 분 배양과 세포 사멸 유도 물질의 제거, 후.
    5. , 세포 사멸 자극을 제거 한 번 따뜻한 PBS 또는 새로운 배지로 염색 된 세포를 세척 한 후 5 % CO 2 (프로토콜 2 참조)와 37 ° C에서 2 시간 동안 신선한 배지로 세포를 제공합니다.
      주 1 : 세포 사멸이 정상 형태를 회복하고 정상적인 형태를 회복 후 형광 표지 넥신 V 신호를 유지 반전 세포 (도 4A, 그리고 (b)).
      주 2 : 넥신 V 신호를 복구 세포 (토론 참조)에 시간이 감소한다.
    6. 실온에서 어두운 곳에서 20 분 동안 1X PBS로 8 %의 자당을 함유하는 4 % 파라 포름 알데하이드 선택된 시간 지점에서 세포를 고정하고, 유리 슬라이드 상에 세포를 부착하기 전에, 파라 포름 알데히드를 제거하기 위해 PBS로 3 회 고정 된 세포를 세척하는 antifade mountant와 커버 슬립 공 촛점 또는 에피 형광 현미경 (자료 참조) 및 고사 유발 인자의 제거 후 세포에 넥신 V를 관찰합니다.
      주 1 : 고정액에 자당 고정 동안 세포막 구조를 유지합니다.
      주 2 : 저하를 방지하기 위해 4 ° C에서 어둠 속에서 파라 포름 알데히드 용액을 저장합니다.
      주 3 : 세포에 감기 충격을 방지하기 위해 고정 용 셀에 적용하기 전에 실온까지 파라 포름 알데히드 용액을 워밍업.

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Representative Results

세포 사멸의 반전을 연구하기 위해, 조직 배양 세포를 처음으로 세포 사멸을 유발하는 죽음의 자극에 노출되어있다. 세포가 세포 사멸의 특징을 표시 할 때, 신선한 배양액 후 자극을 씻어 후 복구 (그림 1A)를 허용하도록 죽어가는 세포를 배양 적용됩니다. 여기서 다루고있는 핵심 문제는 개별 죽어 배양 된 세포가 세포 사멸을 향해 진행 여전히 아나스타시스을받을 수있는 방법까지입니다. 이 질문은 명확하게 설명 된 방법을 이용하여 세포의 운명을 추적 할 수있는 바이오 마커 연속 모니터링함으로써 응답 할 수있다.

우리는 먼저 동안 추적에 필요한 시간 경과 생균 현미경을 사용 전에 개별 세포의 반응을 기록함으로써, 조직 배양 세포에서 아폽토시스의 역전을 검출하도록 우리의 전략을 설명하고 아폽토시스 자극 (12, 13)에 노출 된 후. 여기에 장착 된 기판에 확산 건강 부착 세포 (그림 1Bi) 12, 13, 그리고 사상 미토콘드리아 및 치료 이전에 둥근 핵을 표시 (그림 1Ci, 디, 에이, 인터넷, 승기) 12, 13. 세포 배양 배지 (용적 / 용적)의 3.8-4.5 % 에탄올을 노출시킨 후, DIC 또는 위상차 현미경 세포 세포질 축합, 세포막에 blebbing 및 셀 수축 (도 1Bii, 1Cii- 포함 아폽토시스의 형태 학적 특징을 나타내 밝혀 3, 1Eii-VI) (12, 13). 같은 세포 사멸에 의한 체 형성이 용이 DIC으로 관찰하면 (도 1Eii-VI). MitoTracker 표지 미토콘드리아의 분열은 12, 13뿐만 아니라 훽스트 염색 핵 DNA의 응축 (그림 1Dii-III, FII-III, GII) 12, 13, 및 핵의 분열 (1Dii-III, 1Fii-VI 피규어) (그림을 마련해 1Evi 및 FVI, 흰색 화살표)을, 공 촛점 또는 에피 형광 현미경으로 동시에 검출되었다. 성공적으로 세포 사멸을 반전 세포는 이후 분명히 자신의 피해 복구, 정상적인 형태를 회복하기 위해 관찰되었다 (그림 1Biii, C 및 사업부-VI, E 및 FVII-XII 및 GIII) 12, 13. 이러한 조건에서 세포는 형광 발광 양자 점과 세포 분열 (13)의 섭취에 따라 세포 기관의 운동성, 세포 이동 및 기능 엔도 시토 시스를 회복하기 위해 표시했다. 흥미롭게도, 존경 세포 사멸이 불규칙한 핵 형태 (그림 1Fxii), 또한 비정상적인 세포 분열 소핵 형성을 표시 일부 세포는 13 분할 세포에서 DNA 손상, 염색체 파손 및 전체 염색체 손실의 바이오 마커 인 (1Giv-VII 피규어) 39, 40. 난민 Chromosomes 또는 염색체 단편 외부 핵막 (39) (40)에 의해 둘러싸 딸 세포 핵에 포함하지 못한다. 따라서, 아나스타시스의 결과는 종양과 암의 진행을 선도, 중단 된 세포 사멸하는 동안 손상되​​었다 게놈의 은닉 될 수 있습니다. 소핵의 존재는 또한 암세포 40, 41에서 일반적이다.

미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스는 중재 또는 카스파 제에 의존하는 세포 사멸 20-22를 증폭 할 수있는 중요한 단계입니다. 안정적 GFP 표지 된 시토크롬 C를 발현 HeLa 세포를 사용하여, 우리는 공 초점 현미경으로 세포 사멸과 아나스타시스 중 시토크롬 C의 세포 내 재배치를 모니터링. 죽음의 자극이 2Aii (그림을 적용했다 후보고 23, 24, 그런 다음 (그림 2AI 및 B) 치료 전에 미토콘드리아로 지역화하지만, 사이토 크롬 C -GFP는 세포질에 출시 된2Aiii 및 B). 이러한 미토콘드리아 분열과 세포막과 같은 다른 특성에 blebbing 모폴로지가 또한 사이토 크롬 C -GFP (도 2Aiii)를 발표 한 세포에서 관찰되었다. 이 세포는 사이토 크롬 C 23 ~ 27의 출시 직후 세포 죽음을 받아야보고되었다. 그러나, 데스 자극을 제거한 후, 우리는 세포질 시토크롬 C의 -GFP 레벨 미토콘드리아 필라멘트 구조를 회복하고, 세포막은 정상적인 모양을 회복 거절 관찰 (도 2Aiv-VII, B). 따라서, 사멸 세포는 사이토 크롬 C의 미토콘드리아 출시 후 아나스타시스를받을 수 있습니다.

다운 스트림 DEVD-절단 카스파의 증폭은 일반적으로 세포 사멸 2,5에서 "니나"로 간주됩니다. 따라서, 우리는 카스파 바이오 센서 NES-DEVD-YFP-NLS의 EXPR을 사용가능 이전 카스파 제 활성 (도 3A)을 경험 한 살아남은 세포를 검출 할 수있게, (13)로부터 ESSID와 플라스미드. 이것은 카스파 바이오 센서는 N 말단 핵 제외 신호 (NES)를 가진 링커 카스파 제 -3 옐로우 형광 단백질 (YFP) 뒤에 / 7 컨센서스 절단 부위 (DEVD) 26,42,43과 함께 폴리펩티드 C 말단 핵 지역화 신​​호 (NLS). 건강한 세포,이 바이오 센서는 주로 NES의 함수로서 세포질에 편재도 13 (3Bi, CI-Ⅳ, 및 D를 도시한다). 세포 사멸하는 동안 활성화 된 카스파 효율적 동시에, 또는 이후에, 같은 DNA / 염색질 응축 및 세포 수축 (그림 3B II와 같은 세포 사멸의 다른 기능을 표시 세포에서 핵 세포질에서 옭 YFP-NLS를 해제 DEVD 모티브를 절단 -IV, 및 D) 13. 따라서,자체 세포는 카스파 제 활성화 다음 핵 가져 오기 기능을 유지합니다. 고사 유발 인자를 제거한 후, 카스파 제 활성화는 (발생한 후에도 아나스타시스 표시 형태 학적 회복을 겪는 세포 3Bv-X 피규어 D) (13)는 외관상 후기 아폽토시스 반전. 그들은 죽음의 자극 (그림 3Bv-X, 셀 1) (13)의 제거 후 세포 사멸을 반대로 시작하면 정상적인 형태의 복구하는 동안, 핵 YFP 신호는 세포가 가능하여, 카스파 절단 바이오 센서를 저하시킬 것을 제안, 일부 세포에서 강도 감소 사용되는 것과 동일한 메커니즘은시와 아나스타시스 후 다른 카스파 절단 된 제품을 제거합니다.

아나스타시스 또한 생균 현미경없이 검출 할 수있다. 이 결합하고, 마크 아폽토시스에 이른 단계 (AT 포스파티딜 세린 (PS)을 구체화하는 형광 표지 넥신 V 38,44을 이용함으로써 달성 될 수있다 (38)의 세포막의 내부 전단에 한정되는 바와 같이 예를 들면, 건강 및 미처리 된 쥐의 신생아 심장 차 심실 근세포를, 아 넥신 V (도 4b) (13)로 표지 될 수 없다. 반면, 에탄올 - 유도 세포 사멸 죽는 세포 표면 (도 4b) (13) 포스파티딜 세린 노출되므로, 형광 넥신 V 38,44으로 표지 될 수있다. 눈에 띄게, 아 넥신 V 표지 세포는 차 심근 세포 (그림 4B) 13 사멸을 반전 것을 제안, 죽음의 자극을 제거한 후 정상적인 형태를 회복 할 수 있습니다. 다른 사람들은 이전에 생체 내에서 발생할 수있는 세포 사멸로부터의 회복을 제안하는 비슷한 전략을 적용했습니다. 일과성 허혈 손상의 생체 모델에서, 토끼의 심근 세포와 마우스의 카스파 의존 넥신 V 라벨은 분명히 다시살아있는 동물에서 발생할 수있는 아나스타시스을 제안, 일시적인 허혈 (45) 후 세포 생존에 의해 넥신 V의 국제화에 sulted. 또한, 두 개의 다른 연구 (BCL .3B3에서 아폽토시스를 유도하는 항 면역 글로불린 항체에 노출) .3B3 B 림프종 세포는 아 넥신 V 표지 된 마우스 BCL 분획 및 마우스 유방 암종 온도를 발현 MOD 셀을 식별하는 세포 분류를 사용 에 민감한 p53의 (즉 후 허용 온도 이하로 배양 세포 사멸의 원인)가 정상 배양 조건 (14, 15)에 반환 된 후 증식을 계속했다. 종합적으로, 이러한 연구는 아 넥신 V 라이브 세포 현미경 이미징없이 세포 사멸을 반전 한 세포의 운명을 결정하는 데 유용하는 것이 좋습니다. 아 넥신 V의 형광 있도록, 죽음의 자극의 제거 후 몇 시간 동안 검출 나머지 (그림 4B) (13), 영구되지 않습니다 그러나,이 전략과주의 사항이있다이 방법은 세포 사멸을 반전 세포의 장기 추적을 제공 할 수 없습니다.

그림 1
그림 1 : 라이브 세포 이미징에 의해 세포 사멸의 반전을 추적. (- D, 및 G.도 1a에 대해, 탕 등, MBoC 23 2240년에서 2252년까지 (13)으로부터 허가 재판). 아폽토시스를 유도 및 배양 된 세포 고사 유발 인자를 씻어 후에 복구 할 수 있도록 (A) 어프로치. (미처리) 건강한 마우스 기본 간세포 (B) 저속 생균 위상차 현미경, 처리 한 세포의 동일한 그룹 5 시간 (처리)하고 세척 및 추가 (세척) 24 시간 신선한 배양액으로 배양 용 배지 (부피 / 부피)의 4.5 % 에탄올. 스케일 바, 100 μm의. (C) etha 이전과 같은 기본 마우스 간 세포의 연속 시간 경과 라이브 셀 에피 형광 현미경NOL 2.5 시간 (II 및 III), 및 세탁 후의위한 세포 배양 배지에 4.5 % 에탄올 처리 후 표시된 시간에 처리 (Ⅰ) 및 1 시간 동안 복구를 허용하는 새로운 배지로 배양 (IV - VI). MitoTracker 염색 미토콘드리아 (적색)과 훽스트 염색 핵 (파란색)의 병합 된 이미지는 DIC 현미경에 의한 에피 형광 현미경 및 세포 형태로 시각화 하였다. 스케일 바는, 패널 C에서 10 μm의. (D) 합병 형광 이미지 만 (DIC없이)는 세포 기관 모폴로지를 알 수있다. (E)를 에탄올 처리하기 전에 인간의 작은 세포 폐암 암 H446 세포의 연속 시간 경과 라이브 셀 공 초점 현미경 (i)를 2 시간 28 분 (II-VI)을위한 세포 배양 배지에 3.8 % 에탄올로 처리 한 후, 세척 후 및 복구 (VII-XII)을 허용하는 신선한 배지로 배양. MitoTracker 염색 미토콘드리아 (적색)과 훽스트 염색 핵 (파란색)의 병합 된 이미지는 공 초점 현미경 및 c 시각화했다 DIC 현미경으로 엘 형태. 흰색 화살표는 세포 사멸 기관 (VI)의 조각 핵을 나타냅니다. 스케일 바, 10 μm의. (F) 합병 만 (DIC)없이 형광 이미지 패널 E에서이 세포 기관 형태학을 알 수있다. (G)를 연속 부정확 한 세포 분열을 거쳐 하나의 헬라 세포의 흑백 훽스트 염색 핵 이미징을위한 시간 경과 라이브 셀 에피 형광 현미경. 5 시간 동안 세포 배양 배지에 4.3 % 에탄올 처리 에탄올 (I)의 처리 전 (II) 및 에탄올 제거 후 (세척하고, III-VI). 패널 IV는 비정상적인 세포 분열을 보여준다. 빨간색 화살표는 분할 셀 (IV-VI)의 주요 핵을 나타냅니다. 스케일 바, 30 μm의. 시간은 시간으로 표시됩니다. 분 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 :시 시토크롬 C의 미토콘드리아 릴리스 (A) 안정 (I) 전에 사이토 크롬 c -GFP (사이토 C -GFP)을 표현 헬라 세포의 연속 시간 경과 라이브 셀 공 초점 현미경, 후 세포 사멸의 반전 감지 (II-III) 및 세포 배양 배지에 3.9 % 에탄올로 (III-VII) 노광 후의. CytoC-GFP (녹색), MitoTracker 염색 미토콘드리아 (빨간색) 및 훽스트 염색 핵 (파란색)의 합병 공 초점 이미지는 DIC 이미지 (왼쪽 패널)와 결합된다. 병합되지 않은 버전의 신호 강도의 열지도 (왼쪽 가운데 패널), CytoC-GFP (가운데 패널)의 흑백 이미지 및 미토콘드리아의 흑백 이미지 (오른쪽 가운데 패널)로 제시, CytoC-GFP에 대해 개별적으로 표시됩니다. CytoC-GFP 및 미토콘드리아 (오른쪽 패널)의 병합 된 이미지. (B) 세포, Cel에의 세포질 시토크롬 C-GFP 신호 강도의 변화패널 아이의 흑백 CytoC-GFP 이미지에 표시된대로 리터 1 셀 2. 시간은 시간으로 표시됩니다. 분 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : (그림 3A에 대한 탕 등, MBoC (23), 2240-2252 (13)으로부터 허가 재판, - D.) 카스파 제 활성화 후 세포 사멸의 반전을 감지. 라이브 핵 수출 신호 (NES) DEVD의 카스파 제 절단 부위, 옐로우 형광 단백질 (YFP)과 핵 이행 시그널 (NLS)로 이루어지는 카스파 바이오 센서 융합 단백질의 (A)의 다이어그램. (B) 연속 경과 동안 카스파 바이오 센서 NES-DEVD-NLS-YFP (I)을하기 전에, 발현 HeLa 세포의 세포 초점 현미경 (ⅱ -IV) 및 세포 배양 배지에 4.3 % 에탄올로 (VX) 노광 후의. 카스파 바이오 센서 (녹색)의 합병 공 초점 이미지, 훽스트 염색 핵 (파란색)과 DIC 이미지 (왼쪽 패널), YFP 신호 (가운데 패널)의 흑백 이미지, YFP 신호 강도를 나타내는 열지도 (오른쪽 패널) . (C) 비 처리시 전에 패널 B. (D) (패널 양방향으로 1과 2 번째의) 개개의 ​​세포에서 활성화 된 핵 카스파 바이오 센서에 대한 형광 강도를 정량 동일하게하여 분석 제어부, 및 에탄올의 노출 후, 미처리 대조군 (CI 패널 3, 4 번째)의 핵 (핵 / 총 세포 YFP 신호 강도 × 100 %)에 존재 YFP의 백분율로 계산 하였다. 시간은 시간으로 표시됩니다 분. 스케일 바, 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

AYS "> 그림 4
그림 4 : 형광 표지 넥신 V에 의해 세포 사멸의 반전을 감지은 (. - B도 4a에 대해, 탕 등, MBoC 23 2240년부터 2252년까지 (13)으로부터 허가 재판). 패널 B. (B) 주 심장 심실 근세포 5 시간 동안 세포 배양 배지에 4.5 % 에탄올에 노출 후 10 넥신 V-FITC와 함께 인큐베이션 하였다 신생아 래트에서 사용 넥신 V-FITC의 아나스타시스 분석법 (A) 다이어그램 분 에탄올 매체의 제거 전에. 세포 중 하나를 즉시 해결 (처리), 또는 추가로 2 시간 복구를 위해 신선한 배지로 재 이송 후 고정시켰다 (세척). 아 넥신 V-FITC를 노출 처리되지 않은 세포 제어 (처리되지 않은)의 역할을한다. MitoTracker 염색 미토콘드리아 (적색), 훽스트 염색 핵 (파란색)과 아 넥신 V-FITC (녹색)은 공 초점 현미경으로 시각화하고, 세포 형태는 DIC 현미경으로 시각화했다. 사우스 캐롤라이나맥주 바, 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

아나스타시스는 세포 사멸 경로를 활성화 한 세포가 계속해서 죽어가는 과정을 역 생존 현상을 의미한다. 여기서는 생균 촬상 사실 동일인 셀 늦은 단계에서 아폽토시스 세포 사멸의 과정을 역으로 한 후 생존 및 재생을 계속할 수 있음을 확인하기 위해 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 우리 프로토콜은 아폽토시스를 유도 및 확인을위한 여러 가지 바이오 마커와 세포 사멸의 모니터링 반전 겪는 세포의 큰 비율을 허용하도록 최적화 여러 세포 유형 특정 처리 조건을 설명한다. 기술적 인 문제에 관해서는, 유리 바닥 요리 때문에 높은 배율에서 높은 품질의 촛점 또는 에피 형광 현미경을위한 긴 작동 거리를 수있는 세포와 현미경 목적의 투명성이 높은 얇은 유리,의, 영상 (12, 13)에 대한 배양 세포를 사용 하였다, 미토콘드리아의 분열을 포함하여 고전적인 세포 사멸의 관찰을 용이하게사이토 크롬 c 및 핵 응축과 분열의 릴리스. 유리는 또한 아폽토시스 동안 막에 blebbing, 세포의 세포 수축 및 세포 자멸 체 형성의 모니터링을위한 고품질 DIC 현미경을 허용하도록, 광의 극성을 왜곡하지 않는다. DIC는 셀 모폴로지의 검출 개선, 흠 및 투명 세포 샘플의 콘트라스트를 향상으로 DIC 현미경, 아폽토시스의 형태 학적 특징이 관찰을 위상차 현미경에 비해 많은 장점을 갖는다. DIC 및 위상차 현미경을 사용할 수 없으면, CellTracker 공 초점 또는 에피 형광 현미경 생균의 윤곽 형태 및 세포 형태를 모니터링하는 세포질 염색을 위해 사용될 수있다.

죽음의 자극의 적절한 용량의 응용 프로그램과 자극의 제거의 전략은 아나스타시스의 검출을위한 중요한 단계이다. 우리는 실험 대하여 descr에 대한 죽음의 자극으로 에탄올의 낮은 농도를 사용하기로 선택한여기 ibed 처리 된 세포의 많은 퍼센트 균일 아폽토시스를 겪을 수 있고 잠재적으로이 온화한로부터 복구 할 수 있기 때문에, 데스 자극. 우리는 12, 13 신고되었습니다 그럼에도 불구하고, 이러한 접근 방식은 또한, 다른 죽음의 자극에 성공적으로 적용 할 수 있습니다. 그러나 일부 죽음의 자극은 스타 우로 스포린 (STS), 일반적으로 사용되는 세포 사멸 유도제 등 다른 사람보다 본질적으로 더 많은 도전이다. 이 선호도가 높은 46 ~ 48과의 기판을 결합 아마도 때문에, 반복 세척이 필수적이지만 여전히 효율적으로 세포에서 STS를 제거 할 수 없습니다. 이 경우, 여전히 세포 사멸 죽어가는 과정을 활성화 할 수 있습니다 낮은 약물 농도와 짧은 약물 배양 시간을 사용하여 더 많은 세포가 사멸을 취소 할 수 있도록 허용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 재 급지 또한 신선한 세포 배양 배지보다 아폽토시스의 반전을 향상시킬 수있는 컨디셔닝 된 세포 배양 배지와 세포. 사멸 세포는 일반적으로 느슨하게 특히 유리 SUR에 배양 접시 표면에 부착된다얼굴, 따라서 그것은 세포를 분리하지 않도록 부드럽게 세포 사멸 유도 물질을 씻어하는 것이 중요합니다. 구체적으로 세포에 노출 한 후, 세포 배양 접시의 유리 표면에 적절하게 부착하기 위해, 예컨대 심근 (37)과 같은 특정 유형의 세포를 허용하는 세포 접착 성을 높일 수있는 폴리 -D- 라이신, 콜라겐 및 / 또는 피브로넥틴 유리 접시를 도포 죽음의 자극.

세포 사멸의 과정, 세포 사멸의 가능성이 반전은 온도에 의해 영향을받을 수 효소 활동에 따라 달라집니다. 따라서, 37 ° C에서 또는 정상 배양 조건에서 세포를 유지하는 것은 실험 결과의 재현성을 보장하기 위해 라이브 영상 과정에서 중요하다. 생균 촬상을 시작하기 전에 미리 따뜻한 현미경은 현미경 성분이 열 평형에 도달 할 수 있도록하는 중요한 단계이다. 이는의 열 팽창 및 수축에 포커스 및 XY 평면의 시프트의 편차를 방지 할 수 있습니다라이브 세포 이미징 동안 구성 요소. 적용 또는 인해 온도 또​​는 매체의 볼륨의 변화에​​ 여전히 초점 드리프트를 일으킬 수 시간 경과 영상 중 하나 피펫 또는 미리 예열 현미경 시스템에서 관류하여 매체를 배양 접시를 변경하여 죽음의 자극을 제거하는 단계를 포함한다. Z 스택 인수 정확한 초점면에서 화상 세포 것을 도울 수 있지만, 레이저에 의한 형광 세포의 추가적인 노출 광독성의 위험을 증가시킬 것이다. 대안 적으로, 적외선 레이저 기반 자동 초점 보정 시스템 포커스가 드리프트 보정 시스템의 사용은, 추가없이 세포 / 유리과 대물 간의 거리를 유지하면서 시간 경과 생균 촬상 동안 동일한 초점 평면에서 세포를 유지할 수 단파장 광독성에 형광 세포의 노출.

미토콘드리아 사이토 크롬 C와 같은 apoptogenic 단백질의 방출 및 다운 스트림 / 효과 등의 이펙터 카스파의 활성화또는 caspase-3와 caspase-7은 일반적으로 세포 사멸 세포 사멸 과정 2,5,6에서 "니나"로 간주되고있다. 웨스턴 블롯은 카스파 제 -3의 절단 (활성화) 및 세포 사멸 유도시 전체 세포 집단에서 폴리 (ADP) -ribose 폴리머 -1- (PARP) 및 DFF45 / ICAD 같은 자멸사의 제거 후의 기판을 검출하기 위해 사용되어왔다 자극하고, 쪼개진가 카스파 제 -3, ICAD 및 PARP 죽음의 자극에 노출시 세포에서 나타났다 밝혀,하지만 신선한 배양액 (13)와 세포가 된 후 다시 피드를 사라졌다. 그러나 이러한 방법은 세포 인구의 일반 조건을 공개하지만, 궁극적으로 생존 후 세포 사멸 리버스 것이다 것과 죽을 개별 세포를 구분하지 않습니다. 미토콘드리아 시토크롬 C의 자료를 분석하는 생물 분류 비슷한주의 사항이 있습니다. 따라서, 사이토 크롬 C의 방출 및 카스파 AC 후 개별 세포의 운명을 추적tivation, 세포 사멸 2,5,6의 가장 잘 알려진 특징 중 두, 라이브 세포와 결합 NES-DEVD-YFP-NLS 여기에 사용 된 것과 같은 GFP - 태그 시토크롬 C (사이토 C -GFP)와 카스파 바이오 센서, 형태학 현미경 직접 복구와 같은 세포에서 사이토 C -GFP 바이오 센서의 전위를 관찰함으로써 이러한 문제를 회피. 이러한 결과는 미토콘드리아 시토크롬 C 릴리스 및 카스파 제 활성화 후 세포 사멸의 가역성을 나타냅니다.

아나스타시스 연구를위한 현재의 과제는 생체 내 또는 시험관 내에서 그들의 수명 전반에 걸쳐 어느 지점에서 아나스타시스를받은 세포를 검출하기 위해 표지 기술의 부족이다. 카스파 바이오 센서 NES-DEVD-YFP-NLS의 안정적 발현은 카스파가 나중에 다시 활성화되는 경우 또한 카스파 제 활성의 검출을 허용하지만 활성 바이오 센서 susta 않고 떨어질 수 영구적으로 카스파 제 활성을 기록하지 않는다이네 카스파 활동 (13). 이러한 FRET 기반 SCAT 바이오 센서와 같은 다른 이전에보고 된 카스파 바이오 센서 (예 ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49뿐만 아니라 형광 기자 Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 CPV (예 : CD8 - [DEVD] -Venus) (51,52), 및 전체 동물에서 배양 된 세포에서 카스파 제 활성을 검출하기 위해 사용되지만, 유사한 제한을 가질 수있다. 마찬가지로, 사이토 C -GFP 그것이 아폽토시스 동안 세포질로 미토콘드리아로부터 방출되고이어서 열화 같이, 장기적으로 아폽토시스를 반전 세포를 추적 할 수 없다. 아 넥신 V 라벨링은 아폽토시스 세포를 역 추적하는 데 사용하지만, 신호 강도는 시간에 따라 감소되므로 아나스타시스 13,45 장기간 추적하는 데 유용하지 않다되었다. 생체 내 이미징 지속적인 장기 죽음 자극의 노출 후 동일한 세포의 운명을 추적하는 데 사용될 수있다. 그러나 생체 내 이미징의 장기는 여전히 t에 도전한다오 가장 살아있는 동물에서 수행합니다. 따라서 추가적인 접근법이 전체 동물 연구에, 촉진 또는 조직 배양 세포를 사용을 억제 할 수 아나스타시스 약물 스크리닝 아나스타시스 연구를 확장 할 필요

미래에, 장기 세포의 운명을 추적 새로운 프로토콜 및 기술은 개발 아나스타시스의 생리 병리학 및 치료 영향을 테스트하기 위해 필요하다. 우리는 아나스타시스는 성숙한 신경 세포와 심장 세포 (13)로 교체하기 어려운 손상 세포를 구출하기 위해 일반적으로 세포 생존 메커니즘이 될 수 있다고 제안했다. 그러나, 화학 요법 치료 후 세포 사멸 암 세포의 아나스타시스 내성 종양 12, 13의 재발로 이어지는 위험한 세포의 회복이 발생할 수 있습니다. 그들은 세포 사멸 (13)을 반전 한 후 일부 세포가 종양 변환을 표시로 아나스타시스 또한, 종양 발생의 중요한 메커니즘이 될 수 있습니다. 따라서, 아나스타시스을 강화하는 새로운 THERA 수암을 예방 또는 치료하기위한 새로운 방법으로 아나스타시스을 억제하면서, 신경 퇴행 및 심부전의 억제 효과를 나타내는 전략. 바이오 센서를 개발하는 것은 아나스타시스를 변조함으로써 난치성 질환 세포 생존 아나스타시스 메커니즘, 잠재적 치료제의 이해를 사전 것이다 질병 모델 시스템에서 세포 사멸의 반전을 추적.

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Acknowledgments

우리는 단어 "아나스타시스"세포 사멸의 반전을 설명하는 제안에 대해 목사 랄프 Bohlmann와 목사 제임스 Voelz 감사합니다; 안정적으로 시토크롬 C -GFP을 표현 헬라 세포에 대한 더글라스 R. 녹색; H446 세포 찰스 M. 루딘 에릭 E. 가드너; 비디오에서 만화 그리기에 도움을 헤더 어린 양; 이 원고의 가치있는 토론을위한 유 후이 여진. 이 작품은 선생님 에드워드 Youde 기념 원정대 (HLT), 박사 월터 제토 기념 장학금 (HLT), 풀 브라이트 부여 007-2009 (HLT), 생명 과학 연구 재단의 교제 (HLT)에 의해 지원되었다, NIH는 NS037402 (JMH) 부여 및 NS083373 (JMH), 그리고 홍콩의 대학 보조금위원회 광역 / B-07 / 99 (MCF). 호 램 당나라는 생명 과학 연구 재단의 Shurl와 케이 쿠 르치 재단 연구원이다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

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