Author Produced

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

מגוון רחב של בעלי חיים משמשים מודל בביולוגיה התפתחותית לחקור מנגנוני התפתחות ברמות מולקולריות ותאיות. לדוגמא, מין דו חיים ועופות היה בשימוש נרחב כמו חיות מודל קלאסיות המתאימים למניפולציה ישירה של עוברים, כי העוברים האלה להתפתח מחוץ של האם. בניגוד לבעלי חיים אלה, עוברי יונקים גדלים ברחמה של האם, וצמיחה בשלבים מאוחר יותר היא מכריע תלויה בתפקוד של הרחם. לכן, קשה בדרך כלל כדי לתפעל ישירות עוברי יונקים כגון אלה מהעכבר והחולדה בשלבים מוקדמים. ב 1960s, דניס החדש הוקם תרבות עובר כל יונקים טכניקה (WEC) באמצעות מנגנוני WEC עם אספקת חמצן רציפה ובקרת חום 1. בWEC, עוברי עכבר וחולדה יכולים לגדול vivo לשעבר, (כלומר, מחוץ לרחם). למרות טכניקת WEC שימשה לעתים קרובות בטרטולוגיה ידי הוספת chemic השוניםאל תרכובות לתוך מדיום התרבות, טכניקה זו שימשה גם במחקרים בביולוגיה התפתחותית שונים לבחון מנגנוני התפתחות ייחודיים ביונקים 2-4. לדוגמא, WEC הוא בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון תיוג תא, בעוברי wild-type ו מוטציה באמצעות צבע פלואורסצנטי 5, תא השתלה 6, והכנסת גן באמצעות lipofection 7 וelectroporation 8-13.

לאחרונה, במניפולציה ברחם כבר בשימוש כדי לנתח תהליכים התפתחותיים בעוברי מכרסמים בשלבים מאוחר יותר וכבר בשילוב עם טכניקות electroporation 14-16. עם זאת, שיטות אלו אינן מתאימות למניפולציה של עוברי postimplantation וmidgestation בשל קשיי השגת הזרקה מקומית מדויקת של פתרון ה-DNA לעוברי בשלבים המוקדמים. למרות שהשתלת תאי אולטרסאונד מונחה והזרקה של וקטורים ויראליים לעוברי מוקדמים (כלומר, דווח E8.5-E-9.5 בעכבר) ברחם בעבר 17,18, כישורים מעולים נדרשים לבצע ניסויים אלה עם שיעור הצלחה גבוה. לכן, יש WEC עם נגישות גבוהה vivo לשעבר יתרונות ביחס למניפולציה של עוברי עכבר וחולדה.

סרום החולדה centrifuged מייד (IC) שהוכן מחולדות זכרים משמש לעתים קרובות למדיום WEC. כשהם עוברים בתרבית בשלב postimplantation (כלומר, מוקדם יותר מאשר E8.0 בעכבר או E10.0 בחולדה), תערובת של מדיום סינטטי וסרום עכברוש IC משמש לעתים קרובות כאמצעי לWEC 19. עם זאת, לעוברי תרבות באמצע ההריון (כלומר., E8.0-12.5 בעוברי עכבר או E10.0-E14.5 בעוברי עכברים), יש להשתמש בסרום 100% כמדיום כי אף מדיה חלופית זמינה כרגע מאפשרת עוברים לגדול בדרך כלל במבחנה במשך יותר מ 2 ימים.

הכנת סרום עכברים באיכות גבוהה היאצעד קריטי להשגת שחזור בניסויי WEC. בהשוואה לצנטריפוגה מתעכבת, IC יש את היתרון של הפחתת המוליזה כאשר הסרום נאסף על ידי סחיטת קריש הפיברין כי רוב תאי הדם האדומים כבר הופרדו מקריש הפיברין. כסרום חולדה המוליטית לא מצליח לתמוך בצמיחה התקינה של עוברי חולדה ועכבר, הכנת הסרום באמצעות צנטריפוגה המיידית עדיפה להכנה באמצעות צנטריפוגה מתעכבת. הפרוטוקול שלנו מכיל בהשוואה לפרוטוקולים אחרים שני צעדים נוספים 18-20 (כלומר., אחסון הדם שנאסף על קרח לפני צנטריפוגה הראשונה ושמירה על דגימות דם שנאספו במשך שעה 2 על 4 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה הראשונה). הצעד לשעבר יכול לעכב את היווצרותם של קרישי הדם, והצעד האחרון מקדם את ההתמצקות של קריש הפיברין לסחיטה קלה. לכן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות בשימוש על ידי מתחילים. עם זאת, איסוף דם להפקה או לסרוםמיצוי מדויק על ידי פשוט מתייחס לספרי פרוטוקול קשה מאוד 19-21. במאמר זה וידאו, אנחנו מדגימים הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו להכנת סרום האופטימלי IC חולדה, הכולל איסוף דם מאב העורקים בבטן של חולדות וחילוץ של הסרום על ידי צנטריפוגה גבריות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. הוועדה לניסויים בבעלי החיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת טוהוקו אישרה את הליכי הניסוי שתוארו במסמך זה.

1. ההרדמה וLaparotomy

  1. לאיסוף דם, להשתמש בחולדות הפתוגן ללא ספציפיות זכר ספראג-Dawley. לצום חולדות לפחות 18 שעה תוך מתן מים. השתמש בחולדות מגדל זכר פרשו ב6-8 חודשים של גיל (550-650 ז) לאיסוף דם.
  2. לזרום 2.5-4.0 isoflurane%, שהוא חומר הרדמה שאיפה, לתיבה מחוברת למנגנון הרדמה להציג את ההרדמה ב2.0-3.5 ליטר / דקה ל10 דקות. העבר את החולדות לתוך התיבה להציג את ההרדמה.
    1. לאשר הרדמה על ידי סימון על האובדן של התגובה לגירוי בכפות עם מלקחיים. כסה את האף של wi החולדותה מסכה מחוברת למנגנון הרדמה כדי להרדים עמוק החולדות במהלך איסוף דם. הריכוז והזרימה נשמרים ב2.5-4.0% ו2.0-3.5 ליטר / דקה, בהתאמה.
      הערה: אין להשתמש בHalothane עבור הרדמה משאיפת כי עוברים בתרבית בסרום שנאסף מהחולדות מורדמים עם תערוכה מגיב זה עיכוב בהתפתחות עוברית בהשוואה לעוברים בתרבית בסרום המתקבל מחולדות מורדמים עם isoflurane 22.
  3. כדי למנוע זיהום של הפרווה, לחטא את העור על ידי שפיכת 70% אתנול על הבטן של החולדה המורדמת. להרים את עור חיטוי ודופן בטן באזור התחתון עם זוג המלקחיים ולחתוך השכבות הללו בו זמנית לכיוון אזור בית החזה עם זוג מספריים גדול כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. משקף את המעיים מחוץ לחלל הבטן עם זוג המלקחיים.
  4. חותכים את העור ודופן בטן לכיוון הגפיים האחורי עםזוג מספריים גדול כדי לחשוף עוד יותר את אזור הבטן האחורי. משקף את השומן המיותר מחוץ לחלל הבטן עם זוג המלקחיים.
  5. להרים את השומן הקרביים על קו האמצע באמצעות שני זוגות מלקחיים ולפצל את השומן בזהירות בכיוון מקביל לחשוף את אב העורקים בבטן. חזור על הליך זה לפצל את השומן הקרביים בכיוון אורך כדי לזהות את הסתעפות של אב העורקים בבטן בקלות. בנוסף, אב העורקים הוא pulsatile וניתן להבחין מהווריד הנבוב הסמוך באמצעות מאפיין זה.
  6. להרים את השומן סביב אב העורקים בבטן וההסתעפות בזהירות עם שני זוגות מלקחיים ולהפריד את השומן באב העורקים בבטן.

2. איסוף דם

  1. בזהירות להכניס את קצה מחט 21 G מחוברת למזרק 20 מיליליטר מייד גולגולת להסתעפות של אב העורקים, עם השיפוע בכיוון מטה. החזק את המזרק עם אחדשני, ולמשוך את המזרק באיטיות כדי לאסוף 15 מיליליטר של דם מעכברים ממין זכר.
  2. הסר את המחט מהמזרק, ושופך את הדם לתוך שני צינורות קרים כקרח 10 מ"ל סטרילי בדיקה (איור 1 א). שמור צינורות על קרח עד צנטריפוגה כדי לעכב את היווצרות של קריש הדם. צמצם את זמן צנטריפוגה ידי צנטריפוגה כמה צינורות בפעם אחת.
  3. להרדים את העכברוש הרדים על ידי פתיחת בית החזה וחתכתי את הלב או עריפת הראש.

3. עכברוש סרום הכנה

  1. צנטריפוגה דם שנאסף במשך 5 דקות ב1,200 XG וטמפרטורת חדר (RT) על מנת להפריד בין הדם לשכבות העליונות ותחתונות (איור 1 ג).
  2. שמור את הצינורות ב C ° 4 ל1.5-2 שעות כדי לתקן את קריש הפיברין.
  3. להרים את קריש הפיברין בשכבה העליונה בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים, ולסחוט את קריש הפיברין להפריד את הסרום. לאחר מכן, לחץ על קריש הפיברין עם המלקחיים המעוקלים מול מטלותwnwards ליד הממשק בין שתי השכבות (איור 1D).
  4. חזור על שלב 3.3 לנתק את קריש הפיברין נוסף.
  5. צנטריפוגה מבחנות במשך 5 דקות ב1,200 XG וRT (איור 1E).
  6. להעביר בזהירות את הסרום לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית בזרימת אוויר למינרית קבינט.
  7. צנטריפוגה סרום העכברוש שנאסף במשך 5 דקות ב1,200 XG וRT כדי להסיר את כל תאים אדומים שנותרו.
  8. בריכה בסרום בזהירות לתוך 15 מיליליטר חדש מעוקר צינור באמצעות פיפטה סטרילית כדי למנוע זיהום על ידי תאים אדומים שיורית בחלק התחתון של הצינור (איור 1F).
  9. דגירה בסרום באמבט מים ב C ° 56 ל30 דקות כדי להשבית מערכת המשלימה.
  10. לקרר את הצינורות של סרום חולדה לRT בזרימת אוויר למינרית הקבינט. הסרום צריך להיות aliquoted ל10 מיליליטר בצינורות סטרילי בודדים. אחסן את הצינורות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש (איור 1H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג תוצאות נציג של ההליכים המתוארים להפרדת תאי דם ובסרום. אנחנו בדרך כלל להשיג 15 מיליליטר של דם מעכברוש בדימוס גברי (איור 1 א). על ידי צנטריפוגה, הדם שנאסף ניתן להפריד לשכבה עליונה המכילה סרום וקריש הפיברין, אשר מצוינים עם חץ, ושכבה תחתונה המכילה את תאי הדם (איור 1 ג). חשוב מכך, לא ניתן להפריד בין דגימות דם המוליטית לסרום ושכבות דם (איור 1). לאחר שעזב את הצינור ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, קריש הפיברין הופך להיות מוצק. התמצקות זה נוח להפרדת הסרום מקריש הפיברין באמצעות זוג מלקחיים מעוקלים (1D איור). המבחנה הייתה centrifuged לאחר מכן. קריש הפיברין גלוי בממשק שבין הסרום והשכבות של תאי דם (איור 1E). הסרום משתי המבחנות נאסף לתוך צינור חדש באמצעות פיפטה חד פעמית. אנחנו יכולים להשיג כ 6 מיליליטר של סרום מזכר חולדה אם ההליך כולו הוא מוצלח. כדי להסיר עוד יותר תאים אדומים, בסרום שנאסף centrifuged שוב. כל תאים אדומים שנותרו זירז בחלק התחתון של הצינור (איור 1F). העברנו את supernatant לצינור חדש ובדקתי את הצבע של הסרום מטוהר לשפוט את מידת המוליזה למרות שאנו יכולים לאסוף את הסרום מהשכבה העליונה לאחר צנטריפוגה. סרום החולדה האידיאלי עבור WEC בדרך כלל מפגין צבע צהוב בהיר (משמאל צינור באיור 1G), ואילו בסרום עכברוש עם המוליזה קלה מפגין צבע ורדרד (צינור ימני באיור 1G). סרום עכברוש IC יכול להיות מאוחסן במשך לפחות 6-12 חודשים ב-20 ° C (משמאל באיור 1H). הסרום עם המוליזה קלה הציג צבע עמוק יותר מהסרום האידיאלי כאשר קפוא (משמאל באיור 1H).

her.within-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. נהלים לצנטריפוגה דם והכנה של סרום מחולדות ממין זכר. א) דגימות הדם שנאספו מזכר חולדה מחולקות באופן שווה לשתי מבחנות לצנטריפוגה. B, מדגם C) לא נפרד (ב ') והפרדה אידיאלית לשכבה העליונה המכילה סרום וקריש הפיברין (חץ ב-C) והשכבה התחתונה המכילה את תאי הדם לאחר צנטריפוגה הראשונה. ד) קריש הפיברין הוא לחצה באמצעות זוג המלקחיים. E) שכבות הסרום ותאים דם לאחר צנטריפוגה השנייה. רטיבות קריש הפיברין הוא ציין בממשק (ראשי החץ). F) של תאי דם לאחר צנטריפוגה השלישית (חץ). G) הצינור השמאלי מציג סרום חולדה אידיאלי עם צבע צהבהב בהיר. הצינור הימני מראה סרום עכברוש עם המוליזה קלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תוצאות לשחזור בניסויי WEC תלויות בשימוש בסרום באיכות גבוהה IC חולדה וטכניקה לנתיחה עובר מדויק 3. לא לקצר את תקופת צום לפני איסוף דם בגלל הצום יש צורך לתקנן ריכוזי הגלוקוז בדם. אין להשתמש בחולדות נקבות להכנת הסרום כי רמות הורמונים משתנות אצל בעלי חיים נקבה על פי מחזור הייחום, וכגון שינויים בהורמוני אסטרדיול אינם מתאימים לתרבויות עובר. כמו כן, אין להשתמש בחולדות מאוד שומן זכר להכנת סרום כדי למנוע כמות גדולה של זיהום שומנים בדם.

בעת איסוף הדם, להבטיח ראשון שהצבע של דם העורקים הוא בצבע אדום בוהק, המשקף נשימה רגילה תחת הרדמה. נשימת ירד מובילה להפחתה של כמות הדם שנאסף. כדי לשחזר במקרים כאלה, באופן זמני להפחית את המהירות שבה המזרק הוא pulled. הבעיה הקריטית ביותר בהכנת סרום היא המוליזה. אם דגימות הדם שנאספו תערוכת המוליזה החמורה, הדם לא מצליח להיות מופרד לשתי שכבות על ידי צנטריפוגה. בגלל סרום hemolyzed המעטה עשוי לתמוך בהתפתחות תת אופטימלית, צריך להיות מושלך בסרום מסוג זה. כהמוליזה נוטה להיגרם על ידי לחץ כפוי, המזרק צריך להיות לאט לאט משך בעת איסוף הדם. זה חשוב כדי למנוע מבעבע הדם כאשר דגימות דם שנאספו הם שפכו לתוך מבחנות, אשר מגדילה המוליזה.

לעוברי עכברי התרבות, סרום IC נאסף מעכברי זכרים עשוי להיות אידיאלי; עם זאת, דרישה זו אינה מעשית, כי אנחנו לא יכולים לקבל מספיק נפח גדול של דם מעכבר. כאשר אנו מכינים סרום חולדה, אנו מכינים לפחות 10 בדימוס גידול חולדות ממין זכר. במעבדה שלנו, איסוף דם מבוצע באופן שגרתי על ידי לפחות שני אנשים: אדם איסוף הדם והרדמת הפרט וביצועצנטריפוגה הראשונה.

נכון להיום, מספר מחקרים תוך שימוש בסרום עכברים מסחרי בWEC על ידי שילוב של מדיום הגדרה כימית דווחו 23-25. לדוגמא, תערובת של 50% בסרום חולדה זמין מסחרי ו50% DMEM תומכת הצמיחה התקינה של עוברי עכברי E8.5 ל36 שעה 23 והצמיחה הנורמלית של עוברי עכברי E9.75 ל40 שעה 24. בפרוטוקול אחר, תערובת המורכבת מ50% בסרום חולדה זמין מחברה אחרת ו50% בינוניים F12 בתוספת N-2 תומכת גם בצמיחה התקינה של עוברי E7.5 ועכבר E8.5 ל24 שעות 25. עם זאת, עדיין לא ברור אם התקשורת קומבינטורית אלה מתאימות לתרבות של עוברי חולדה ועכבר בשלבים מאוחר יותר, כגון E11.5-E12.5 בעכברים וE13.5-E14.5 בחולדות. מחקרי WEC באמצעות תקשורת חלופית שונות במקום סרום חולדה כבר דיווחו גם 26-28. לדוגמא, שילוב של DMEM/F12 ו20% בסרום שור העובר (FBS) תומך development של עוברי עכברים מE11.5 ל28 שעות 26. עם זאת, המדיום הזה אינו מתאים לתרבות עובר חולדה מE10.5 ל28 שעות 26. לכן, אנו מאמינים כי הצמיחה הנורמלית של עוברים במדיום המכיל FBS תלויה בשלב העוברי של העוברים.

WEC באמצעות תקשורת ותרבות בסרום ללא היוותה רק של חומרים כימיים מוגדרים, כוללים מדיה זמינה מסחרי בתאי גזע עובריים, אלבומין בסרום שור, ו-N-2 תוספת כבר דיווח. בינוני זו תומכת בתרבות של עוברי עכברי E10.5 ל16-40 שעות 27, 28. Morre-סקוט, et al. הוכיח כי גודל כתר לעכוז של עוברי עכבר בתרבית למשך 24 שעות קטן באופן משמעותי מזה של E11 .5 עוברים גדלו ברחם. עם זאת, המבנים העיקריים, כגון somites וגרעיני שורש הגבי, נראים תקינים בעוברים בתרבית אלה. מצד השני, Kalaskar וודרדייל דיווחו כי 60% מעוברים שנבדקו במדיום הזה הציגו נורמהשעות 18 פיתוח אל מאוחר יותר, אבל קצב התפתחות טובה בעוברים בתרבית למשך 20-22 שעות נוספות ירד ל 30-40%. בניגוד למחקרים אלה, אנו יכולים להתרבות בהצלחה פיתוח טוב של עוברי עכבר וחולדה בתרבית 100% בסרום עכברוש IC הופק באמצעות הפרוטוקול שלנו במשך יומיים (כלומר., כ 48 hr) מE12.5 בחולדות 6 או E10.5 בעכברים 8 על ידי שינוי בינוני פעם אחת ב24 שעות. תוצאות אלו מצביעות על כך שהשיטה שלנו להכנת סרום עכברוש IC היא שימושית עבור מגוון רחב של ניסויי יישום שלבים עובריים שונים WECat יונקים. לכן, אנו מקווים כי פרוטוקול הווידאו שלנו יסייע לחוקרים חדשים להציג את הניסויים באמצעות WEC למעבדות שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
  2. Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
  3. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
  4. New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
  5. Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
  6. Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
  7. Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
  8. Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
  9. Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
  10. Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
  11. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
  12. Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
  13. Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
  14. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  15. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  16. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  17. Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
  18. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
  19. Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
  20. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
  21. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
  22. Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
  23. Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
  24. Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
  25. Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
  26. Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
  27. Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
  28. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics