Author Produced

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hayvan modellerinde çeşitli moleküler ve hücresel düzeyde gelişim mekanizmaları incelemek için gelişim biyolojisi kullanılır. Örneğin, amfibi ve kuş türleri yaygın olarak bu embriyolar, annenin dışında geliştirmek için embriyo doğrudan manipülasyon için uygun olan klasik bir model hayvanları olarak kullanılmıştır. Bu hayvanların aksine, memeli embriyolar annenin rahmine büyür ve daha sonraki aşamalarda büyüme rahim fonksiyonu üzerinde en önemlisi bağlıdır. Bu nedenle, doğrudan bu tür erken aşamalarında, fare ve sıçandan gibi memeli embriyolar işlemek için, tipik olarak zordur. 1960 yılında, Denis Yeni bir sürekli oksijen kaynağı ve ısı kontrolü 1 ile WEC cihazları kullanarak bir memeli bütün embriyo kültürü (WEC) tekniği kurulmuştur. WEC, fare ve sıçan embriyolar ex vivo, (yani, rahim dışında) büyüyebilir. DEK teknik, çoğu zaman, çeşitli chemic eklenerek teratolojide kullanılmış olmasına rağmenal, kültür ortamı içine bileşikler bu teknik aynı zamanda, memelilerde 2-4 benzersiz gelişim mekanizmaları incelemek için çeşitli gelişim biyoloji çalışmalarda kullanılmıştır. Örneğin, DEK floresan boya 5, hücre nakli 6 ve 7 lipofeksiyon ve elektroporasyon 8-13 aracılığıyla gen giriş kullanarak, vahşi tip ve mutant embriyolar, hücre etiketleme gibi diğer tekniklerle ile birleştirilmiştir.

Son zamanlarda, utero manipülasyon sonraki aşamalarda kemirgen embriyo gelişim süreçlerini analiz etmek için kullanılır olmuştur ve elektroporasyon teknikleri 14-16 ile kombine edilmiştir. Ancak, bu teknikler erken aşamalarında embriyolara DNA solüsyonu doğru lokal enjeksiyonu elde zorluklar nedeniyle ve implantasyon sonrası midgestation embriyoların manipülasyonu için uygun değildir. Her ne kadar erken embriyo (içine ultrason eşliğinde hücre transplantasyonu ve viral vektörlerin enjeksiyon yani, E8.5-E-9.5 fare) rahimde daha önce 17,18, mükemmel becerileri yüksek bir başarı oranı ile bu deneyleri gerçekleştirmek için gerekli olan rapor edilmiştir. Bu nedenle, yüksek erişilebilirlik ex vivo DEK fare ve sıçan embriyo manipülasyonu ile ilgili avantajlara sahiptir.

Erkek sıçanlarda hazırlanabilir hemen santrifüje (IC) sıçan serum genellikle DEK ortamı için kullanılır. Embriyolar (sıçan, fare veya E10.0 E8.0 in daha önce, yani,) implantasyon sonrası aşamasında kültürlendiği zaman, sentetik orta ve IC sıçan serum oluşturduğu bir karışıma genellikle DEK 19 için bir araç olarak kullanılır. Hiçbir mevcut alternatif medya sağlar çünkü Ancak, orta-gebelikte kültür embriyoların (yani., E8.0-12.5 fare embriyoları veya sıçan embriyolarında E10.0-E14.5 in),% 100 serum aracı olarak kullanılması gerektiğini en fazla 2 gün boyunca in vitro olarak normal büyümeye embriyolar.

Yüksek kaliteli sıçan serum hazırlanmasıdırWEC deneylerde röprodüsibilitesini ulaşmak için kritik bir adımdır. Gecikmeli santrifüj ile karşılaştırıldığında, IC kırmızı kan hücrelerinin çoğu zaten fibrin pıhtısı ayrılmış çünkü serum fibrin pıhtısı sıkarak ulaşılınca hemoliz azaltma avantajına sahiptir. Hemolitik sıçan serum sıçan ve fare embriyo normal gelişimini desteklemek için başarısız olarak, hemen santrifüj kullanılarak serumun hazırlanması gecikmeli santrifüj kullanılarak hazırlanması tercih edilir. Bizim protokol diğer protokollere göre iki ek adımları içerir 18-20 (yani. Önce ilk santrifüj için buz üzerinde toplanan kan depolama ve ilk santrifüjlemeden sonra, 4 ° C 'de 2 saat boyunca, toplanan kan örnekleri bakımı). Eski adım kan pıhtısı oluşmasını geciktirebilir ve ikinci adım kolay sıkma için fibrin pıhtısının katılaşma teşvik etmektedir. Bu nedenle, bizim protokol başlayanlar tarafından kullanılabilir. Ancak, üreyen, kan toplama ve serumsadece protokol kitaplara bakarak doğru ekstraksiyon 19-21 derece zordur. Bu ekran yazıda, erkek farelerde ve santrifüj ile serum ekstraksiyon abdominal aort kan koleksiyonu içerir uygun IC sıçan serumu, hazırlanması için, standart protokol göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Hayvan deneyleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberi, National Institutes göre yapılmıştır. Tıp Tohoku Üniversitesi Hayvan Deneyleri için Komite, burada açıklanan deneysel prosedürleri onayladı.

1.. Anestezi ve laparotomi

  1. Kan toplama için, spesifik patojensiz, erkek Sprague-Dawley fareleri kullanır. Su sağlarken, en az 18 saat boyunca fareler Hızlı. Kan toplamak için yaş (550-650 gr) 6-8 ayda emekli erkek damızlık sıçanlar kullanın.
  2. 10 dakika boyunca 2.0-3.5 L / dk 'da anestezi tanıtmak için bir anestezi cihazına bağlanmış bir kutuya, bir anestezik% 2,5-4,0 olan izofluran, akış. Anestezi tanıtmak için kutunun içine sıçan aktarın.
    1. Forseps ile pençelerinde uyarılmasına tepki kaybı için kontrol ederek anesthetization onaylayın. Sıçanlar wi burun Kapakderinden kan toplama sırasında fareler uyutmak için bir anestezi cihazına bağlanmış bir maske inci. Konsantrasyon ve akış sırasıyla% 2.5-4.0 'de muhafaza ve 2.0-3.5 L / dakika edilir.
      NOT: Bu embriyolar reaktif sergi 22 izofluran ile anestezi sıçanlardan elde edilen serum içinde kültüre embriyolara kıyasla embriyo gelişiminde önemli bir gecikme ile anestezi altına alınan sıçanlarda toplanan serum içinde kültürlendi için Halothane inhalasyon anestezisi için kullanılmamalıdır.
  3. Kürk kirlenmesini önlemek için, anestezi sıçan karın üzerine% 70 etanol dökerek cildi dezenfekte. Forseps bir çift ile alt bölgede dezenfekte deri ve karın duvarı Pick up ve iç organların maruz büyük bir makas ile toraks bölgeye yönelik eş zamanlı olarak bu katmanları kesti. Forseps bir çift ile karın boşluğu dışında gut yansıtacak.
  4. Bir ile arka bacaklarda doğru cilt ve karın duvarı kestibüyük makas çifti daha posterior karın bölgesini açığa çıkarmak. Forseps bir çift ile karın boşluğu dışında ekstra yağ yansıtacak.
  5. Forseps iki çift kullanarak orta hatta viseral yağ Pick up ve abdominal aorta maruz paralel bir yönde dikkatlice yağ bölünmüş. Kolayca abdominal aortun çatallanma belirlemek için uzunlamasına bir doğrultuda visseral yağ bölmek için bu prosedürü yineleyin. Buna ek olarak, aort pulsatil ve bu özelliği ile bitişik vena kava ayırt edilebilir.
  6. Forseps iki çift ile dikkatlice abdominal aorta etrafında yağ ve çatallanma Pick up ve abdominal aort yağ ayrı.

2.. Kan Toplama

  1. Dikkatli bir şekilde aşağı doğru bir yönde konik aort çatallanma, hemen kafatası bir 20 ml şırınga bağlı bir 21 G iğne ucu yerleştirin. Bir şırınga ile tutunel ve bir erkek sıçan kan 15 ml toplamak için yavaş yavaş şırınga çekin.
  2. Şırıngadan iğne çıkarın ve iki buz soğukluğunda 10 ml steril test tüpleri (Şekil 1A) içine kan dökün. Santrifüj kan pıhtısı oluşmasını geciktirmek için kadar buz üzerinde tutun tüpler. Bir anda birkaç tüpler santrifüj ile santrifüj zamanı azaltın.
  3. Torakotomi ve kalp ya da işten çıkarma keserek anestezi sıçan Euthanize.

3.. Rat Serum hazırlanması

  1. Üst ve alt tabakalar (Şekil 1C) içine kan ayırmak için 1200 x g ve oda sıcaklığında (RT), 5 dakika boyunca toplanan kan santrifüjleyin.
  2. Fibrin pıhtısı düzeltmek için, 1.5-2 saat boyunca 4 ° C'de tüpler tutun.
  3. Kavisli bir forseps bir çift kullanarak üst tabakasında fibrin pıhtısı Pick up ve serum ayırmak için fibrin pıhtısı sıkmak. Sonra, do bakan kavisli bir forseps ile fibrin pıhtısı basıniki tabaka (Şekil 1D) arasındaki ara yakın wnwards.
  4. Bundan başka, fibrin pıhtısı ayırmak için bir adım 3.3 tekrarlayın.
  5. 1,200 xg ve oda sıcaklığında (Şekil 1 E) 5 dakika boyunca, test tüpleri santrifüjleyin.
  6. Dikkatli bir laminar hava akışı kabini içinde bir steril pipet kullanılarak 15 ml steril tüp içine serum aktarın.
  7. Kalan kırmızı hücreleri çıkarmak için 1200 x g'da ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca toplanmış sıçan serum santrifüjleyin.
  8. Tüpün (Şekil 1F) altındaki edilen kırmızı hücreleri tarafından kirlenmesini önlemek için steril bir pipet kullanarak steril bir tüp yeni bir 15 ml'lik dikkatle serum havuzu.
  9. Kompleman sistemi inaktive edilmesi, 30 dakika boyunca 56 ° C'de bir su banyosu içinde inkübe serum.
  10. Laminer hava akışı kabini içinde oda sıcaklığına kadar sıçan serum tüpleri soğutun. Serum ayrı steril tüplerde 10 ml aliquoted olmalıdır. Kullanım (Şekil 1 H) kadar -20 ° C'de tüpler saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1, kan hücreleri ve serumun ayrılması için açıklanan prosedürlere temsili sonuçlarını göstermektedir. Bu tipik olarak, emekli erkek fare (Şekil 1A) kan 15 ml elde edilir. Santrifüj ile, toplanan kan serumu ve bir okla belirtilir fibrin pıhtısı ve kan hücreleri (Şekil 1 C) ihtiva eden bir alt tabaka ihtiva eden bir üst tabaka halinde ayrılabilir. Önemli olarak, hemolitik kan örnekleri, serum ve kan tabakalar (Şekil 1B) içine ayrılamaz. 2 saat boyunca, 4 ° C'de tüp ayrıldıktan sonra, fibrin pıhtısı katı madde haline gelir. Bu katılaşma eğri forseps bir çift (Şekil 1D) kullanılarak fibrin pıhtısı gelen serumun ayrılması için uygundur. Test tüpü daha sonra santrifüjlenmiştir. Fibrin pıhtısı, serum ve kan hücre tabakalarının (Şekil 1 E) arasındaki ara yüzeyde görülebilir. İki test tüplerinden serum halinde elde edilmiştirtek kullanımlık bir pipet kullanarak yeni bir tüp. Bütün prosedür başarılı olursa biz erkek sıçan gelen serumun yaklaşık 6 ml elde edebilirsiniz. Bundan başka, kırmızı hücreleri uzaklaştırmak için, toplanan serum yeniden santrifüjlenmiştir. Geri kalan kırmızı hücreler, tüp (Şekil 1F) altındaki çökeltilmiştir. Biz, yeni bir tüpe aktarılmıştır ve süpernatan, santrifüj sonra üst tabakadan serum toplamak mümkün olsa bile hemoliz derecesini değerlendirmek için, saflaştırılmış serum rengini kontrol etti. Hafif hemoliz sıçan serum pembemsi bir renk (Şekil 1G sağ tube) sergiliyor WEC için ideal bir sıçan serum tipik haliyle, (Şekil 1 G'de boru sol) açık sarı bir renk sergiler. IC sıçan serum (Şekil 1 H sol) -20 ° C'de, en az 6-12 ay boyunca saklanabilir. Donmuş hafif hemoliz serum (Şekil 1 H sol) ideal serum daha derin bir renk göstermiştir.


Şekil 1. Kan, santrifüj ve erkek farelerde serum hazırlanması için prosedürler. A), bir erkek sıçanın toplanan kan örnekleri). Santrifüjleme için iki deney tüpleri içine eşit olarak bölünmüş B, C) ​​olmayan ayrılan numune (B) ve serum ve fibrin pıhtısı içeren üst tabaka içine doğru ayrılması (C ok edilir ve ilk santrifüj. D) sonra kan hücreleri içeren, alt tabaka, fibrin pıhtısı bir çift forseps kullanılarak sıkılır. E) serum ve kan hücre katmanları ikinci bir santrifüj işleminden sonra,. Kan hücrelerinin fibrin pıhtısı arabirimi (ok uçları) de görülmektedir. F) yağmur üçüncü santrifüj (ok). G) sonra, sol boru hafif sarımsı bir renk ile ideal bir sıçan serum gösterir. Doğru tüp hafif hemoliz ile sıçan serumu gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DEK deneylerde yeniden üretilebilir sonuçlar, yüksek kaliteli IC sıçan serumu ve doğru bir embriyo diseksiyon yönteminin 3 kullanımına bağlıdır. Açlık kan glukoz konsantrasyonları standardize etmek gerekli olduğundan kan toplama önce açlık süresini kısaltmak etmeyin. Hormon düzeyleri östrus döngüsü göre dişi hayvanlarda değiştirmek için dişi sıçanlar serum hazırlanması için kullanılmamalıdır, estradiol ve hormonlar gibi değişikliklerin embriyo kültürleri için uygun değildir. Buna ek olarak, son derece yağlı erkek sıçanlarda kandaki lipid kirlenme büyük miktarda önlemek için serum hazırlanması için kullanılmamalıdır.

Kan alırken, ilk arteriyel kan rengi anestezi altında normal solunuma yansıtan, parlak kırmızı bir renk olduğundan emin olun. Azalmış solunum toplanan kan miktarının bir azalmaya yol açar. Böyle durumlarda kurtarmak için, geçici şırınga pu hangi hızını azaltmaklled. Serum hazırlanmasında en kritik sorun hemoliz olduğunu. Toplanan kan örnekleri, şiddetli hemoliz sergiler ise, kan, santrifüj ile iki tabakaya ayrılabilir başarısız olur. Hafif hemolize serum sub-optimal gelişimini desteklemek olabilir, çünkü serum atılmalıdır. Hemoliz Zorla basıncının neden olma eğilimindedir olarak kan toplama sırasında, yavaş yavaş şırınga çekilmelidir. Bu toplanan kan örnekleri, hemoliz artar, test tüpleri içine döküldü zaman kan köpüren önlemek için önemlidir.

Kültür fare embriyoları için, erkek farelerden toplanan serum IC ideal olabilir; bir fare kan yeterince büyük bir hacim elde edilemez, çünkü ancak bu şart pratik değildir. Biz sıçan serum hazırlamak, biz en az 10 erkek fareleri üreme emekli hazırlamak. Laboratuvarda, kan toplama rutin olarak en az iki kişi tarafından yapılır: Bireysel kan ve bireysel anestezi toplama ve performansilk santrifüj.

Bugüne kadar, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam birleştirerek WEC ticari bir fare serum kullanılarak çeşitli çalışmalar 23-25 ​​bildirilmiştir. Örneğin, ticari olarak temin edilebilen% 50 fare serumu ve% 50 DMEM oluşan bir karışım 36 saat 23 ve 40 saat için 24 E9.75 fare embriyo normal büyüme için E8.5 fare embriyo normal gelişimini destekler. Başka bir protokol, N-2 ile takviye edilmiş başka bir şirket,% 50 F12 ortamı temin edilebilen% 50 sıçan serumu oluşan bir karışım da, 24 saat için 25 E7.5 ve E8.5 fare embriyo uygun gelişimini destekler. Ancak, bu kombinasyon ortamı, farelerde E11.5-E12.5 ve E13.5 sıçanlarda-E14.5 daha sonraki aşamalarda, en sıçan ve fare embriyo kültürü için uygun olup olmadığı açık değildir. Yerine sıçan serum çeşitli alternatif ortam kullanılarak DEK çalışmalar da 26-28 bildirilmiştir. Örneğin, DMEM/F12 ve% 20 fetal sığır serumu (FBS) bir arada devel destekler28 saat 26 için E11.5 sıçan embriyo opment. Bununla birlikte, bu ortam 28 saat için 26 ikinci E10.5 fare embriyo kültürü için uygun değildir. Bu nedenle, FBS ihtiva eden bir ortam içinde embriyo normal büyüme embriyoların embriyonik aşamada bağımlı olduğuna inanıyoruz.

Sadece ticari olarak temin edilebilir, embriyonik kök hücre ortamı, büyükbaş hayvan serum albümini, ve N-2 de dahil olmak üzere ek tanımlandığı reaktifler, oluşan serum-içermeyen kültür ortamı kullanılarak DEK bildirilmiştir. Bu ortam 16-40 saat boyunca 27 E10.5 fare embriyo kültürünü destekler 28. Morre-Scott, vd., 24 saat süre ile kültüre fare embriyo taç-to-kıç E11 boyutu önemli ölçüde daha küçük olduğunu göstermiştir utero yetiştirilen .5 embriyolar. Ancak, bu tür Somitlerin ve dorsal kök ganglionlar gibi başlıca yapılar, bu kültürlü embriyoların normal görünür. Öte yandan, Kalaskar ve Lauderdale bu ortamda test edilen embriyoların% 60 normunu sergilediğini raporal kalkınma 18 saat sonra, ancak ek bir 20-22 saat süre ile kültüre embriyolar iyi gelişme oranı% 30-40 düştü. Bu çalışmalarda aksine olarak, başarılı bir şekilde iki gün boyunca protokolü kullanılarak üretilen 100% IC sıçan serum içinde kültürlenmiş fare ve sıçan embriyo gelişimi iyi yeniden (yani., Yaklaşık olarak 48 saat) E12.5 sıçanlarda 6 veya E10.5 bölgesindeki 24 saat sonra bir kez ortam değiştirilerek farelerde 8'de. Bu sonuçlar, IC sıçan serum hazırlamak için bir yöntem, memeli embriyonik WECat farklı aşamalarını uygulamak bir çok deney için yararlı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bizim video protokol yeni araştırmacıların kendi laboratuvarlarına WEC kullanarak deneyler tanıtmaya yardımcı olacağını umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
  2. Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
  3. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
  4. New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
  5. Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
  6. Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
  7. Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
  8. Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
  9. Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
  10. Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
  11. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
  12. Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
  13. Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
  14. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  15. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  16. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  17. Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
  18. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
  19. Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
  20. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
  21. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
  22. Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
  23. Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
  24. Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
  25. Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
  26. Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
  27. Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
  28. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics