Toksikologiske Analyser for Testing Virkninger av en epigenetisk Drug på Development, Fruktbarhet og overlevelses av malariamygg

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sharma, A., Anderson, T. D., Sharakhov, I. V. Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (95), e52041, doi:10.3791/52041 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Insekticid motstand utgjør et stort problem for malaria kontrollprogrammer. Mygg tilpasse seg til et bredt område av endringer i miljøet raskt, noe som gjør malaria styre et allestedsnærværende problem i tropiske land. Fremveksten av insektmiddel resistente populasjoner garanterer utforskning av nye medikament målet trasé og forbindelser for vektor mygg kontroll. Epigenetiske narkotika er godt etablert i kreftforskning, men ikke mye er kjent om deres virkninger på insekter. Denne studien gir en enkel protokoll for å undersøke de toksikologiske effekter av 3-Deazaneplanocin A (DZNep), en eksperimentell epigenetisk narkotika for kreftbehandling, på malaria vektor, Anopheles gambiae. En konsentrasjonsavhengig økning i dødelighet og reduksjon i størrelse ble observert hos umodne mygg utsatt for DZNep, mens forbindelsen reduseres fruktbarheten hos voksne mygg i forhold til kontrollbehandlinger. I tillegg var det en medikamentavhengig reduksjon i S -adenosylhomocystein (SAH) hydrolaseaktivitet i mygg etter eksponering for DZNep forhold til å kontrollere behandlinger. Disse protokollene gi forskeren med en enkel, steg-for-trinn prosedyre for å vurdere flere toksikologiske endepunkter for et eksperimentelt medikament og i sin tur viser en unik multi-spiss tilnærming for å utforske de toksikologiske effekter av vannløselige epigenetiske legemidler eller forbindelser av interesse mot vektor mygg og andre insekter.

Introduction

Malaria er ansvarlig for det høyeste antallet insektrelaterte dødsfall i verden. Anslagsvis 219 millioner tilfeller forekommer årlig på verdensbasis, noe som resulterer i ca 660 000 dødsfall, hovedsakelig i Afrika en. Til tross for felles innsats, malariaprogrammer møter en rekke utfordringer. Mens insekt behandlet myggnett og innendørs rest sprøyting skjema sentrale deler av programmet, motstand mot insektmidler i lokale bestander hindre dette arbeidet to. Den raske økningen i insektmiddel resistente myggbestanden er i stor grad tilskrives evnen til malariamygg for å tilpasse seg raskt til endringer i deres miljø og utnytte ulike nisjer 3,4,5. For å overvinne de eksisterende mekanismene for insektmiddel motstand, er utforskning av nye insektmiddel mål og neste generasjons forbindelser garantert. En enkel, steg-for-steg-protokoll for å fastslå effekten av eksperimentelle insektmidler på de ulike livsstadier av malaria mosquitoes vil i betydelig grad styrke dette arbeidet.

Farmakologiske studier av narkotika effekter på cellelinjer og dyremodeller har etablert bruk av epigenetiske narkotika som et nyttig verktøy for å modulere genetikk og fysiologi av celler og organismer. DNA metylering og histon modifikasjon er to epigenetiske mekanismer som påvirker genekspresjon i flercellede organismer uten å endre den underliggende DNA sekvens 6. Innlegg translasjonelle modifikasjoner som metylering spille en avgjørende rolle i å opprettholde cellular integritet og genuttrykk, og kan påvirke flere fundamentale prosesser 7,8,9. Forskning i noen insektarter har understreket betydningen av epigenetikk i prosesser som involverer oogenesen og stamcelle vedlikehold 10, samt dosering kompensasjon 11. Men slike aspekter i sykdoms vektorer er ennå å bli utforsket. Ved hjelp av en forbindelse til å modulere dette systemet på mygg kan gi oss iseverdighetene i romanen insektmiddel målet veier. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) er en kjent histone metylering hemmer, som innvirkning på ulike typer kreft har blitt studert 12,13,14,15,16. DZNep er en stabil vannløselig epigenetisk medikament som hemmer indirekte histon lysin N-metyltransferase (EZH2), en komponent av polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2) i pattedyrceller. PRC2 spiller en viktig rolle i å regulere veksten av stamceller i flercellede organismer, og histon metylering er en sentral del av PRC2 mediert genet demping. Hos immunkompromitterte mus, har cellene forbehandlet med DZNep vist seg å være mindre tumorigen 17. Dette stoffet blir brukt til å studere andre sykdommer, slik som ikke-alkoholisk fettleversykdom, hvori EZH2 er implisert 18. DZNep er en etablert S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) hydrolaseinhibitor 19, 20. Inhibering av SAH-hydrolase resulterer i enakkumulering av SAH og i sin tur fører til hemming av metyltransferase-aktivitet ved å begrense tilgjengelige metyl donorgrupper. SAH er en aminosyre-derivat benyttes av mange organismer, inklusive insekter, i deres metabolske veier. En fersk studie har vist at DZNep i lave doser kan påvirke Diapause og forsinke utviklingen i insekter 21.

Her blir en robust protokoll for å undersøke virkningene av en vannoppløselig forbindelse på ulike stadier av mygg utviklet. De tre deler av denne protokollen omfatter instruksjoner for å undersøke virkningene av en vannoppløselig forbindelse på umodne mygg, voksen blodforing hunner, og enzymaktiviteten av voksne mannlige og kvinnelige mygg. Først blir DZNep oppløst i vann for å studere umodne mygg utvikling og overlevelse. Dette er utført ved to konsentrasjoner å sammenligne eventuelle forskjeller som oppstår fra 10-ganger økning i legemiddeleksponering. Å utforske effekten av narkotika på voksen hunnmyggen, DZNeplegges til defibrillert saueblod og matet blod kunstig til kvinner. Deretter blir resultatet av stoffet på fruktbarhet undersøkt. Til slutt blir en enzymaktivitetsanalysen utføres ved hjelp av 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzosyre) (DTNB) som en indikator for å bestemme effekten av DZNep på SAH-hydrolase inhibering i voksne mannlige og kvinnelige mygg. Mens denne protokollen er utviklet med en malariamyggen, Anopheles gambiae, kan den lett tilpasses til å studere effektene av forbindelser av interesse på noen arter av mygg eller andre insekter. Teknikkene beskrevet i denne protokollen kan ikke effektivt anvendes på et stoff med begrenset eller ingen løselighet i vann eller vandige media.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: De tre deler av protokollen beskriver vandige eksponering av DZNep medikament til larve mygg, en blodbasert eksponering av DZNep til voksne hunner for å studere effekten av fruktbarhet, og SAH-hydrolase-hemming DZNep målt ved bruk av en enkel kolorimetrisk teknikk. En skjematisk fremstilling av disse analysene er vist i figur 1.

1. Umodne Mosquito Utvikling og survivor Analyser

MERK: Denne delen forklarer bruken av et vannløselig stoff som påvirker mygglarver utvikling og overlevelse.

  1. Hatch A. gambiae egg ved 28 ° C i destillert vann (dH 2 O) og bak dem til 2. instar larver.
  2. Ta en seks-brønns DNAse, RNAse fritt cellekulturplate og hell 10 ml dH 2 O til hver brønn.
  3. Velg mygglarver på 2. stadium og legge 15 larver per brønn. Før du legger til 2. stadium larver til plate, pút dem på kjøkkenpapir for 2-3 sek for å fjerne overflødig vann.
  4. Label brønner med fargekodede bånd å random eksperiment. Etikett to brønner per forsøkskonsentrasjon på hver plate (figur 2).
  5. Forberede en 1 mm DZNep hydroklorid (MW = 298,73) lager løsning ved å løse 0,3 mg DZNep i en ml dH 2 O. Legg stamløsning av DZNep.HCl til merkede brønner for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,5 uM og 5,0 uM.
    MERK: Aksjen løsning kan lagres ved 4 ° C for kort sikt (1 dag til en måned) eller -20 ° C for lang sikt (mer enn én måned).
    MERK: Tilsetting av stamløsningen for nevnte konsentrasjoner vil ikke endre volumet av vann i brønnene betydelig. Men i tilfelle av meget høyere konsentrasjoner, er det tilrådelig å oppløse forbindelsen i larve medium for å unngå unødvendig fortynning av forbindelsen.
  6. Legg lik mengde flak fiskefor til hver brønn. Dekk platens og ruge dem ved 28 ° C i en inkubator.
  7. Registrere dødelighet for de DZNep-behandlede og ubehandlede larve mygg etter en 24-timers eksponeringsperiode. Fjern og kast eventuelle døde larver. Gjenta denne innspillingen hver dag frem til alle larvene dør eller forpupper seg og fremstå som voksne. Registrere størrelsen på larver hver annen dag, det vil si, dag 0, 2, 4, 6, 8, inntil de forpuppes.
  8. Analyser larveutvikling og dødelighetsdata ved hjelp av et tilstrekkelig statistisk analyse programvare.
    MERK: Et søylediagram kan brukes til å representere dødelighetsdata i Microsoft Excel. Multivariat variansanalyse (MANOVA) utført med en programvare som JMP eller SPSS vil avdekke om ulike doser av stoffet føre til vesentlig forskjellig overlevelse av mygglarver.

2. Fruktbarhet analysen ved å administrere Drug Gjennom kunstig Feeder til hunnmyggen

MERK: Denne delen beskriver tillegg av stoffet til blod ennd spise det til voksne hunnmyggen hjelp av en kunstig matesystem.

  1. Sett opp voksen mygg bur med like mange mannlige og kvinnelige mygg for kontroll og test bur. Gi 10% sukker løsning dynket i bomull baller til begge burene till hunnene er klar for fôring (3-5 dager er optimal for Anopheles gambiae).
  2. 2 timer før blodet fôring, fjerne bomull baller for å sikre kvinner er sulten.
  3. Sett sammen to kunstige blod matere som består av en omvendt bred bunn glasstrakt (diameter = 50 mm, lengde = 70 mm) og en omgivende plast forseglet med industriell lim. Fest plastslanger (diameter = 7 mm) til to matere 'utsalgssteder (diameter = 10 mm) via kontakter for tilsig og strøm av vann. Merke de to matere som "Control" og "fem mikrometer DZNep."
  4. Ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig varmeelement, sette opp programmet for fôring. I "Meny" gå til "Innstillinger"og velg "Børverdier"; forhåndsinstallerte programmer som skal vises. Velg "SP1" og sette temperaturen til 37 ° C.
    MERK: Varmeelementet sikrer at blod administreres holdes ved en konstant temperatur. Andre programinnstillinger kan brukes til forskjellige mygg eller insektarter.
  5. Fyll en bøtte med vann og dypp varmeelementet i vannet.
  6. Skjær et firkantet stykke Parafilm (50 mm x 50 mm) og strekke den til å lage en tynn membran film. Dekke bunnen av de kunstige forer med Parafilm. Skjær et stykke Parafilm (50 mm x 10 mm), strekke det og forsegle kantene forer.
  7. Montere systemet, som forbinder de forer og varmeelement av rørene. Etter fullført, slå på systemet og velg "SP1". Trykk "Enter" for å starte systemet.
    MERK: Vannet vil bli oppvarmet til 37 ° C og opprettholdt ved den temperaturen.
  8. Overvåke the temperaturen i vannet ved hjelp av et termometer i vannet bøtte.
    MERK: Kontaktene og rør å opprettholde en konstant sirkulasjon av vann gjennom systemet slik at temperaturen av blodet forblir ved 37 ° C.
  9. Fyll en flat bunn brett med 10% blekemiddel løsning som vil bli brukt til å rense eventuelle blod søl.
  10. Tilsett 2 ml defibrillert saueblod til et mikrosentrifugerør. Merke dette som "Control". Gjenta prosessen for den eksperimentelle røret merket som "5 uM DZNep" .Add 6 ul av DZNep stamløsning (se trinn 1.5) til det eksperimentelle røret merket "5 uM DZNep" Bland forsiktig blodet og medikament ved å snu flere ganger. Inkuber røret 10 min ved RT.
  11. Ved hjelp av en pipette, tilsett 2 ml av kontroll og test blod til toppen av tilsvarende merket matere. Kast pipetten i kloroppløsning. Dekk til buret med en mørk pose og puste luft på buret med jevne mellomrom for å oppmuntre females for fôring.
  12. La myggen fôr til ca 30 min. Når fôring er ferdig, slå av varmeelementet, ta forer ut og kle Parafilm. Suge materen i blekemiddel løsning for ca 5 min og skyll godt i avionisert vann.
  13. Fjern de forer og sette bomull baller med sukkervann på burene i 48 timer. Plasser et egg fatet inneholder vann og filter papir i merdene over natten for å lette egglegging. Merk hver egg parabolen med den respektive test eller kontroll konsentrasjon.
  14. Fjerne egg parabolen neste dag og undersøke antall og struktur av egg under et stereo mikroskop. Få bilder ved hjelp av Q-colors5 programvare. Telle antall egg. Analyser forskjell i antall egg oppnådd fra test- og kontroll bur.
    MERK: En uparet t-test kan anvendes for å bestemme om antallet egg er signifikant forskjellige (p ≤0.05).

3. Biokjemisk analyse av Mosquito enzyminhiberingav Drug

MERK: Denne delen beskriver en enzymaktivitet analyse ved hjelp DTNB som en indikator for å fastslå effekten av DZNep på SAH hydrolaseinhibering i voksen hann og hunnmyggen.

  1. Forberede en 0,1 M Na 2 HPO 4 (dinatriumfosfatheptahydrat) løsning ved å legge til 14,19 g Na 2 HPO 4 til 1 L av dH 2 O. Deretter fremstille en 0,1 M NaH 2PO 4 (monobasisk natriumfosfat) løsning ved å tilsette 13,79 g av NaH 2PO 4 til 1 liter dH 2 O.
  2. Titrere 0,1 M Na HPO 2 4-løsningen med 0,1 M NaH 2PO 4-løsning til pH 8,5.
    MERK: Dette vil være arbeids lager løsning av 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
  3. Tilbered en homogenisering oppløsning av 0,1 M Na HPO 2 4 (pH 8,5) ved tilsetning av 0,3% Triton X-100.
    MERK: homogenisering løsning kan lagres ved 4 o C.
  4. Prepare en 1,6 mM SAH (MW = 384,4) oppløsning ved oppløsning av 6,15 mg av SAH i 10 ml 0,1 M Na HPO 2 4 (pH 8,5).
  5. Tilbered en 1,6 mM DTNB (MW = 396,4) løsning ved å oppløse 6,3 mg av DTNB i 10 ml 0,1 M Na HPO 2 4 (pH 8,5). Hold frisk DTNB løsning på is inntil bruk.
  6. Forberede en 1 mm DZNep.HCl (MW = 298,73) løsning ved å løse 0,3 mg DZNep i 1 ml dH 2 O. Deretter fortynnes 1 mM DZNep oppløsning i en serie av konsentrasjoner fra 1,000 uM til 0,002 uM i dH 2 O.
  7. Å måle SAH hydrolaseinhibering av DZNep, utarbeide en rå enzymekstrakt av mygg: Homogen 10 ikke-blodmatet voksen mygg i en ml iskald 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), som inneholder 0,3% Triton X- 100, ved anvendelse av en glassfiberduk homogenisator. Overfør homogenate til en 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  8. Sentrifugere homogenatet i 5 min ved 10000 x g ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et rent1,5 ml mikro tube. Bruk av supernatanten som enzymkilde for SAH biokjemisk analyse.
  9. For blind behandling (dvs. ingen DZNep, uten enzym), tilsett 50 ul 1,6 mM SAH, 50 pl 1,6 mM DTNB og 100 pl 0,1 M Na HPO 2 4 (pH 8,5) til de individuelle brønner i en 96-brønners, flat bunn mikro.
  10. For kontrollen (dvs. ingen DZNep), tilsett 50 ul 1,6 mM SAH, 50 pl 1,6 mM DTNB, 50 pl 0,1 M Na HPO 2 4 (pH 8,5) og 50 ul enzym (SAH-hydrolase oppnådd fra råekstrakt) til den enkelte brønner.
  11. For DZNep behandlinger, tilsett 50 mL 1,6 mm SAH, 50 mL 1,6 mm DTNB, 50 ul enzym og 50 pl valgt DZNep konsentrasjon til individuelle brønner. Forberede fire replikater per behandling og kontroll.
  12. Les av optisk tetthet (OD) av SAH enzymprøvene ved 405 nm i 5 minutter ved 20 sek intervaller ved hjelp av en 96-brønn mikroplateleser.
  13. Trekk fra det tomme OD fra kontroll ennd behandling OD oppnådd fra hver brønn. Beregne prosent gjenværende SAH-hydrolase-aktivitet ved hjelp av følgende ligning:% gjenværende aktivitet = (OD Behandling / kontroll OD) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 er en skjematisk representasjon av analysene; den beskriver de ulike stegene i prosedyren oppført i denne artikkelen. Som protokollen er basert på forskjellige stadier av mygg, er det ingen bestemt sekvens som skal følges for eksperimentene som er beskrevet her. Brukeren kan velge å utføre en eller flere tester samtidig, avhengig av prøve tilgjengelighet.

Figur 2 viser platen satt opp for umodne mygg utvikling og survivor analyser. Antall testkonsentrasjoner og replikater kan endres avhengig av brukerens krav og legemiddeltilgjengelighet. For det umodne mygg-analysen, ble 1 mM stamløsning av DZNep tilsatt til vann inneholdende mygg for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,5 uM og 5 uM sammen med en kontroll panne med brønner inneholdende et medikamentfritt populasjon. Eksperimentet viste at mer larver og pupper overlived i kontrollbrønnene enn i de DZNep-behandlede brønner.

Figur 3 viser effekten av DZNep på total overlevelse av malariamygg under eksperimentet. Resultatene viser at epigenetisk narkotika DZNep undertrykker vekst og utvikling og induserer dødeligheten av umodne mygg. Størstedelen av mygg eksponert til 0,5 pM døde etter dag 10 av forsøket, mens et stort antall individer som utsettes for 5 uM døde etter dag 8. I motsetning forble dødeligheten av mygg i kontrollbehandling (intet medikament) upåvirket og flere frem som voksne på dag 8 av eksperimentet. Et inverst forhold ble observert mellom medikamentkonsentrasjon og mygg kroppsstørrelse (figur 4).

Figur 5 illustrerer effekten av DZNep på mygg fruktbarhet. Voksen hunnmyggen matet med blod som inneholder DZNep viste en betydelig reduction i antall levedyktige egg. Figur 5A viser egg oppnådd fra styreburet (ingen medikament). Figur 5B viser eggene oppnådd fra testburet. Et stort antall egg oppnådd fra testburet var mørkere i farge og manglet flyter (luftfylte utvidelser av exochorion) sammenlignet med egg oppnådd fra normale blodmatet hunn mygg (figur 6). Fraværet av flyter sammen med mørkere fargede egg indikerer potensielle rolle epigenetikk i exochorion formasjon.

Figur 7 viser effekten av DZNep på SAH hydrolaseaktivitet i voksen hann og hunn malariamygg. En DZNep avhengig reduksjon i OD observeres for hver behandling, sammenlignet med kontrollbehandling (intet medikament) som indikerer at DZNep hemmer SAH-hydrolaseaktivitet.

Figur 1 Figur 1:. Skjematisk fremstilling av analyser ved hjelp av en epigenetisk narkotika på malariamygg Den venstre delen av ordningen viser utvikling og survivor analyser ved hjelp av umodne mygg. Den sentrale delen demonstrerer fecundity analysen via blod-fôring stoffet til voksne kvinner. Den høyre del viser den biokjemisk undersøkelse av enzym-hemming av medikamentet.

Figur 2
Figur 2: Plate skildrer umoden mygg utvikling og overlevelsesanalyse Label "C" merkene kontrollbrønner.. Label "0.5" viser brønner med 0,5 mikrometer DZNep. Label "5" indikerer brønner med 5 mikrometer DZNep.

Figur 3
Figur 3: Effekt av DZNep på overlevelses av malariamygg. observeres med umodne mygg.

Figur 4
Figur 4:... Effekt av DZNep på utvikling av umodne mygg (A) Larver fra kontrollbehandling (size = 5 mm) (B) Larver behandlet med 0,5 pM DZNep (size = 4 mm) (C) Larver behandlet med 5 uM DZNep (size = 3 mm). Alle larver ble målt på samme dag av eksperimentet.

Figur 5
Figur 5:. Effekt av DZNep på mygg fecundity Egg fatet fra styrebehandling (ikke narkotika) mygg inneholder mye større antall egg (A) selrød med egg parabolen av kvinner behandlet med fem mikrometer DZNep (B).

Figur 6
Figur 6: Effekt av DZNep på egg struktur i malariamygg sett under et mikroskop. (A) Egg fra styrebehandling (ingen narkotika) mygg vise flyter og rosett lignende forsamlinger. (B) egg fra mygg behandlet med fem mikrometer DZNep mangler flyter og rosett lignende forsamlinger.

Figur 7
Fig. 7: SAH-hydrolase-hemming DZNep i malariamygg DZNep fører til en reduksjon i utvendig diameter sammenlignet med kontrollbehandling (uten medikament).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere trinn som er avgjørende for vellykket bruk av denne protokollen. For larve analysen, bør man sørge for å riktig merke og kopiere hver forsøkskonsentrasjon. Randomisering testprøver og tilsetning av den angitte mengde av medikament til respektive testbrønner utgjør en viktig del av denne eksperimentelle oppstilling. Før du legger til 2. stadium mygglarver til en 96-brønns mikroplate, kan hver larve bli satt på et papirhåndkle for 2-3 sek for å fjerne overflødig vann. For å hindre uttørking, må larver umiddelbart overført til mikroplate brønnene ved hjelp av en sløv pinsett. Dette sikrer at mengden vann i hver mikro godt og konsentrasjon av medikamentet forblir som forutsatt. Ved overføring av larver for måling av kroppslengden, anbefales det å sette larvene på is i noen minutter for å holde dem i ro. Når tilpasse denne protokollen for en annen forbindelse, bør man sørge for å bestemme mengden av stamløsning lagt til hvervel. I slike tilfeller kan det være bedre å oppløse den beregnede mengde av en forbindelse i vann direkte før tilsetning av larver i hver mikro brønnen.

For blod fôring analyser, er det viktig at myggen er utsultet på riktig ved å fjerne sukker vann minst 2 timer før eksperiment. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i ufullstendig fôring og liten effekt på voksne kvinnelige eggproduksjon. Grundig blanding og jevn fordeling av stoffet i blodet er et viktig skritt i tillegg, som DZNep tar noen minutter å oppløse. Hvis stoffet behandlet blod tilføres umiddelbart, DZNep ikke blir jevnt fordelt i moskito-systemet. Det anbefales på det sterkeste at defibrillert blodet er friskt (dvs. mindre enn en uke siden utvinning dato) for bedre resultater.

Det er flere trinn kritiske for å lykkes med et biokjemisk analyse med en forbindelse av interesse. Konsentrasjoner av hver forrådsløsning brukes i denne proto col har blitt optimalisert for DZNep. Å tilpasse protokollen for en annen forbindelse, foreslår vi at du tester en rekke forskjellig pH, subaraknoidalblødning, DTNB konsentrasjoner og insektutvalgsstørrelser for å finne de mest pålitelige resultater. Fremstilling av rå enzymekstrakt er den mest tidskrevende trinn i denne fremgangsmåten. Under homogenate forberedelse er det anbefalt å bruke ikke mer enn 10 voksne mygg, som lipider stede i supernatanten kan hindre absorbans lesing. For å unngå dette problemet, kan det øverste laget av lipider i supernatanten (ved hjelp av en enkelt kanal mikropipette) fjernes etter trinn 3.8. Supernatanten må overføres til et rent mikrofugerør. Trinn 3.8 bør gjentas for å forkaste eventuelle gjenværende viskøse lipider. De resterende klar supernatant må samles fra alle rør og blandes forsiktig. En flerkanals pipette kan brukes til økt effektivitet for å legge SAH i brønnene. DTNB brukes som en indikator i analysen, og bør fremstilles sist og holdt på is.

nt "> Denne protokollen gir brukeren enkle trinnene for å teste effekten av en sammensatt på ulike livsstadier av mygg. Men det er noen begrensninger i bruken av denne protokollen. Denne teknikken avhenger først og fremst vannløselighet DZNep. Umodne larvene utsettes for medikamentet oppløses i sine omgivende media. Dersom forbindelsen som blir testet er uoppløselig i vandige medier, kan det gjengi denne protokollen mindre effektiv. For testing av fruktbarhet, vi kastes den voksne hunner til stoffet oppløst i defibrillert saueblod. Denne ville ikke være mulig hvis en lab steiler mygg kolonier på pattedyr blod direkte (dvs. bruker mus eller marsvin for fôring mygg).

Den kombinasjon av ulike analyser som er beskrevet i denne artikkelen gir brukeren en ny måte for å teste effekten av en vann-oppløselig forbindelse av insekter. DZNep er for det meste tilsatt til cellelinjer in vitro for kreftforskning; Men gjør denne protokollen user for å undersøke eventuelle effekter på ulike livsstadier av et insekt in vivo. I tillegg gir det også forskeren med trinn-for-trinn retningslinjer for toksikologiske analyser. I den aktuelle litteratur, er kunnskapen begrenset med hensyn til virkningene av epigenetiske medikamenter på insekter. Ved hjelp DZNep som et eksempel, gir vi en prosedyre som kan brukes som en forutsetning skritt mot å utforske andre epigenetiske medikamenter eller nye forbindelser som potensielle insekt kontroll agenter. Selv om denne protokollen er utviklet for malaria mygg, kan den være innrettet til å teste effekten av DZNep, eller en hvilken som helst vannoppløselig forbindelse av interesse, med andre mygg eller insektarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplate Fisher Scientific 12565561
Cell culture plate CytoOne CC7682-7506
Centrifuge Sorvall Fresco 76003758 A different centrifuge can be used
Colored tape rolls Fisher S68134
Dissection microscope Olympus SZ
DTNB Sigma Aldrich D8130
DZNep.HCl Sigma Aldrich SMLO305
Egg dish cups
Filter papers Fisher 09-795E
Glass feeders Virginia Tech
Glass tissue homogenizer
Heating element Fisher Scientific NC0520091
Incubator Percival scientific I36VLC8 A different incubator can be used
Microcentrifuge tube, 2 ml Axygen 22-283
Microcentrifuge tube, 1.5 ml Axygen MCT-150-C
Micropipette Eppendorf 4910 000.069
Na2HPO4 Fisher Scientific M-3154
NaH2PO4 Fisher Scientific M-8643
pH meter  Mettler Toledo 7easy S20
Plate reader Spectramax M2
SAH Sigma Aldrich A9384 store at -20 °C
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDC Report. Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
  2. Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
  3. Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. (2014).
  4. Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
  5. Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
  6. Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2, (4), 157-206 (2007).
  7. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
  8. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  9. Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
  10. Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
  11. Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
  12. Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
  13. Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99, (11), E962 (2014).
  14. Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. (2014).
  15. Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
  16. Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
  17. Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
  18. Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
  19. Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
  20. Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
  21. Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics