배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Developmental Biology

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Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z. Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (95), e52047, doi:10.3791/52047 (2015).

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Abstract

Introduction

심장 질환은 세계에서 가장 주요 원인 오늘날 남아 사망률은 지난 20 년 (미국 심장 협회)에서 이뤄지지 않고있다. 효과적으로 방지 또는 심부전를 취소하는 신규 한 치료 전략의 개발에 대한 중요한 필요가있다. 한가지 유망한 전략은 줄기 세포 생물학 (1)의 급속한 발전 다음 세포 기반 치료이다. 이와 관련, 다 능성 클릭당 비용 (CPC)으로 인해 증식하지만 심장 혈통 차별화하기 위해 최선을 다하고 자신의 능력으로 치료를위한 우수한 셀 소스 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 강력한 방법은 생성과 심장 세포 치료제 연구를위한 매우 중요하다 클릭당 비용 (CPC)을 분리합니다.

이 프로토콜은 초기 배 발생 및 방법는 ESC에서 자신의 세대에서 확인 된 배아 클릭당 비용 (CPC)에 초점을 맞추고있다. 다양한 클릭당 비용 (CPC)에도 뼈 된 marrows 2에서, 배아와 성인 마음에서 고립되었다. 배아 개발하는 동안, 뼈 morphoge마그네틱 단백질 (BMP 형식)은, 날개 형 MMTV 통합 사이트 가족 (Wnts)와 마디 신호는 Mesp1 + 능성 중배엽 3의 헌신을 유도한다. Mesp1 + 세포는 배아의 CPC 사로 분화. 이 클릭당 비용 (CPC)은 일반적으로 NK2의 호 메오 박스 (5) (Nkx2-5가), ISL LIM의 호 메오 박스 (1) (Isl1가), T-상자 5 (Tbx5) 및 심근 증강 인자 2C (Mef2c가), 차 및 제 마음 필드를 형성, HCN4으로 표시하고 있습니다 cardiogenesis ~ 10시 심장의 주요 부분에 기여하고 있습니다. Nkx2-5 + 및 Isl1 + / Mef2c + 두 클릭당 비용 (CPC)가 심근 세포로 분화 할 수있는, 평활근 세포 (SMCs) 및 내피 세포 5-8. 따라서 이들의 CPC 심장 혈관계뿐만 아니라 심장 조직을 야기하고 심장 세포 기반 치료를위한 이상적인 셀 소스있는 것이다. 결과적으로, 시험 관내에서 CPC를 생성하는 심혈관 연구에서 주요 연구 초점이되어왔다. 는 ESC 무제한 확장 용량을 가지고 있기 때문에ND 포배기에서 ICM 세포를 나타내고, 천연 배아 배아 다음의 CPC는 ESC로의 분화는 CPC를 획득하기 위해 논리적이고 효과적인 방법으로 간주된다.

는 ESC에서 클릭당 비용 (CPC)을 얻을 수있는 한 넓게 적용 방법은 사채 11로는 ESC를 집계하는 것입니다. 분화 효율을 향상시키기 위해, 심장 개발 기술에 기초하여 정의 화학적 및 성장 인자 12-14 사용되고있다. 그러나, 현장에서 널리 허용되는 명확한 CPC 마커, 특히 아니 세포 표면 마커는 없다. 이 문제를 해결하기는 ESC는 Isl1 + 또는 Mef2c + 클릭당 비용 (CPC) 및 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 사용하여 형광 기자들과 이들의 유도체를 표시하도록 설계되었습니다. CRE 재조합 효소는 Isl1 / Mef2c 프로모터 / 인핸서의 제어에 노크한다. 구성 적 프로모터에 의해 구동되는 형광 단백질의 변성 또는 RFP YFP 유전자 CRE 재조합 효소와 플록스 정지 코돈의 절단에 의해 활성화 될 수있다(ISL1 : CRE;-pCAG - 플록스-STOP-플록스 GFP 또는 RFP / Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) 5,6. 는 ESC가 두 번째 심장 필드 클릭당 비용 (CPC)로 분화되면, Isl1 / Mef2c 프로모터 / 증강 구동 CRE는 형광 기자를 활성화하고 클릭당 비용 (CPC)은 FACS 정화에 의해 강화 될 수있다. 간략하게, EB 집계 방법은 ESC의 분화를 시작하는 데 사용된다. 분화 효율을 향상시키기 위해, 분화 세포는 아스코르브 산 (AA) 및 BMP4, 티빈 13,15 VEGF와 같은 성장 인자로 처리된다. 이 프로토콜은 마우스와 인간는 ESC를 모두 사용하여 강력하고 효율적인 CPC 차별화 할 수 있습니다.

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Protocol

마우스는 ESC에서 마우스 배아 클릭당 비용 (CPC) 1. 유도

  1. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs) 세포층을 준비합니다.
    1. 따뜻한 MEF 매체 37 ° C에 (DMEM에 10 % FBS).
    2. 젤라틴 코팅 된 플레이트를 준비합니다.
      1. 10cm 접시에 6 웰 플레이트의 우물 또는 5 ㎖에 물에 0.1 % 젤라틴의 1 ML을 추가합니다.
      2. 적어도 30 분 동안 판 또는 요리 37 ° C에서 또는 실내 온도를 남겨주세요. 사용하기 전에 젤라틴을 열망.
    3. 해동은 부드러운 흔들림으로, 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 MEFs에를 조사.
    4. 15 ml의 50 ML 원뿔 튜브에 부드럽게 세포를 전송합니다. 예열 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. 천천히 세포를 소용돌이 및 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
    5. MEF 매체에서 세포를 재현 탁하고 가능한 세포를 계산합니다. 10cm 접시에서 세포를 2 ml를 6 웰 플레이트에서 웰 당 세포 및 10 ml의 다음 MEF 매체의 볼륨을 사용합니다.
    6. 6 웰 플레이트에 플레이트 세포 또는 1-2에서 10cm 요리플레이트 / 접시 당 × 10 (6).
    7. 37 ° C에서 MEF 플레이트 / 접시를 품어, 5 % CO 2 최소 24 시간 이전에 사용할 수 있습니다.
      주 : 주보다 오래된 MEF 판 / 요리를 폐기하십시오.
  2. 마우스는 ESC를 준비
    1. 문화 Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; 90 %의 합류까지 MEFs에에 Rosa26YFP 마우스는 ESC. 사용 ES 세포 배지 410 ml의 DMEM, 75 ㎖의 FBS, 0.1 mM의 MEM NEAA, 2 mM L- 글루타민, 0.1 mM의 피루브산 펜 100 U / 스트렙토 마이신, 및 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올로 구성.
    2. 1.1.2에 설명 된대로 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다.
    3. 접시에서 대기음 매체와는 DPBS로 세포를 씻어.
      1. 기음 DPBS 6 웰 플레이트 잘 하나에 0.4 ml의 0.25 % 트립신을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. 트립신 반응을 중단 1 ml의 예열 ES 매체를 추가합니다.
    4. 수확 세포와 원심 분리기 세포 200 XG와 대기음 매체에서. 재현 탁 된 1 ml의 ES 세포 배지에서 세포와 세포를 카운트. </ 리>
    5. 3 × 104 / ㎠의 밀도에 젤라틴 코팅 플레이트 플레이트는 ESC. 는 ESC는 약 90 % 합류에 도달했을 때 약 2 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. 매체 일상을 변경합니다.
    6. 는 ESC가 90 % 합류 경우, 반복 완전히 MEF 피더를 제거하는 1.2.2-1.2.5 단계.
  3. EB 형성에 의해 CPC 분화를 유도
    1. 다음으로 분화 배지 준비 : 36 ml의 IMDM, 12 ml의 햄 F12, 2 mM L- 글루타민, 0.34 ml의 BSA (7.5 %), 0.25 ml의 N2, 0.5 ㎖의 B27, 50 ㎍ / ㎖의 AA, 및 0.45 mM의 1- 티오 글리세롤.
    2. 기음 세포로부터 중간 DPBS 씻어. 기음 DPBS 6 웰 플레이트 잘 하나에 0.4 ml의 0.25 % 트립신을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
    3. 하나의 세포로 세포 클러스터를 분산 아래로 반응 및 피펫 업을 중단하고 1 ml의에게 차별화 매체를 추가합니다.
    4. 원심 분리기는 ESC 5 분 200 XG에와 매체를 폐기합니다.
      1. 재현 탁 1 × 6 </ SUP> 1 ml의 차별화 매체는 ESC. 제 EB 응집 37 ° C에서 분화 배지에서 1 × 105 세포 / ml의 낮은 농도에서 분리 배양 접시에서 세포를 세포 수 및 배양.
    5. 이틀 EB 형성 한 후, 50 ㎖ 튜브에 요리에서 사채를 전송할 수 있습니다. 1 분 동안 200 XG에 스핀. 매체를 제거하고 칼슘과 마그네슘 2+없이 10 ML의 DPBS로 사채를 씻어.
    6. 기음 DPBS 1 ml의를 0.25 % 트립신을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 반응을 정지 4.5 ml의 차별화 매체를 추가합니다. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다.
    7. 5 분 동안 200 XG에 세포를 원심 분리기. 1 ml의 분화 배지에서 대기음 매체에 resuspend 세포.
    8. 세포 수 및 분화 배지에서 1 × 105 세포 / ㎖로 2 × 106 세포를 희석. 5 NG / ㎖, 0.8 ng를 / ㎖의 최종 농도 매체에 VEGF, BMP4과를 Activin이 추가, 5 NG / ㎖, 각각. Cultu37 ° C에서 두 번째 EB 형성을위한 배양 접시에 세포 재.
    9. 두 번째 EB 형성 후 40 시간은 50 ㎖ 튜브에 사채를 전송할 수 있습니다. 5 분 동안 37 ° C에서 1 ml의 0.25 % 트립신과 EBS을 (를) 해리, DPBS로 한번 씻어. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다.
    10. 5 NG / ㎖ VEGF, 10 NG / ㎖의 bFGF 12.5 NG / ㎖로 FGF10 Stempro-34 배지에서 세포를 재현 탁. 젤라틴 - 코팅 된 플레이트에서 2 × 105 / cm 2에서 셀을 접시. CPC 분리하기 전에 약 32 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 문화.
  4. mCPCs를 분리
    1. 대기음 매체와 DPBS 씻어. 5 분 동안 37 ℃에서 배양 플레이트에 0.5 ml의 0.25 % 트립신을 추가합니다. 반응을 정지 4.5 ml의 차별화 매체를 추가합니다. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다. FACS 정화 2 % FBS / PBS에서 원심 분리기에 resuspend 세포에 의한 세포를 수집합니다.
    2. 음성 대조군으로 정렬에 미분화는 ESC를 실행합니다. 변경 전압은 앞으로 배설물을 조정합니다터 (FSC)와 측면 산란 (SSC)를 원하는 인구를 선택합니다. 파편과 이중를 제외 측면 분산과 폭 대 앞으로 분산 높이 대 흩어 앞으로 사용합니다. 선택한 하위 집단에서, ESC 컨트롤의 분포에 따라, 세포의자가 형광을 제거하기 히스토그램에 긍정적 인 YFP의 게이트를 그립니다. YFP + 게이팅에서 YFP + CPC를 수집합니다.
    3. 차별화 매체 (1.3.1) 6 웰 플레이트에서 정제 된 클릭당 비용 (CPC) (YFP + 셀) 플레이트. 심근 및 SMCs에 클릭당 비용 (CPC)의 차별화를위한 37 ° C에서 문화 추가 3~5일.

인간는 ESC에서 인간 배아 클릭당 비용 (CPC) 2. 유도

  1. 공급기를 준비
    1. 2 × 104 / ㎠의 밀도로 상기 한 바와 같이 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에) 세포층을 준비한다.
  2. 인간는 ESC를 유지
    1. CRE; M에 정기적으로 pCAG - 플록스-STOP-플록스-GFP 또는 RFP는 ESC : 인간 ISL1 유지정규 hESC의 매체 (녹아웃 DMEM / F-12 385 ㎖, 넉 아웃 SR 100 ㎖, 2 mM L- 글루타민, 0.1 mM의 NEAA, 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 NG / ㎖ 염기성 FGF)을 사용 EF. 심장 분화 이전에, 적어도 2 개의 통로의 피더 자유로운 상태는 ESC 인간 옮긴다.
  3. 피더 무료 조건에서 인간는 ESC를 준비
    1. 인간는 ESC 문화 코팅 된 플레이트를 준비합니다.
      1. 4 ° C에서 하룻밤 리겔을 녹여. 얼음에 50 ML 튜브를 넣고 튜브에 30 ml의 차가운 DMEM / F12 배지를 추가합니다.
      2. 차가운 매체에 1 ml의 마트 리겔을 넣고 잘 섞는다. 10cm 접시에 6 웰 플레이트의 우물 또는 5 ㎖에 1 ml의 차가운 리겔 - DMEM / 12 매체를 추가합니다.
      3. 2 시간 동안 판 / 4 ° C에서 하룻밤 요리 또는 실내 온도를 남겨주세요. 대기음 매체를 사용하기 전에.
    2. MEF 플레이트에서 대기음 미디어와 DPBS 인간의는 ESC를 씻어 : 인간 플레이트 상에는 ESC를 분할합니다. 이어서 6- 웰 플레이트의 웰에 1 ㎖의 디스 파제 (1 mg / ㎖)을 추가한다. 37 ° C에서 세포를 품어인큐베이터는 식민지의 가장자리가 분리 시작할 때까지.
    3. 디스 파제 솔루션을 제거합니다. 다음 2.5 ml에 추가 / 잘 mTeSR 매체 또는 MEF-조정 배지 당 판에 두 번 DPBS 씻어.
    4. 작은 덩어​​리로 인간의 ESC 식민지 아래 휴식을 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁고 조심스럽게 피펫합니다.
    5. ESC 덩어리를 전송하고 1을 희석 : 3 코팅 된 판에.
    6. 2 ㎖ / 잘 mTeSR 매체 또는 MEF 에어컨 매체를 추가하고 매일 매체를 변경합니다.
    7. mTeSR 매체 또는 적어도 두 구절 코팅 접시에 MEF 에어컨 매체 문화 인류는 ESC.
  4. 인간는 ESC에서 CPC의 분화를 유도
    1. 세포가 ~ 90 % 컨 플루 언트 될 때, 배지를 흡인하고 DPBS로 헹군다. 그런 다음 20 분 동안 37 ℃에서 0.5 ㎎ / ㎖의 인간 배아 줄기 스파 아제 (Dispase)를 배양한다.
    2. 셀 리프터와 접시에서 세포를 제거, 두 번 DPBS와 인간 배아 줄기 린스, 다음 DMEM / F12는 18 % FBS, 0.1 mM의 NEAA, 2 mM의를 포함하는 (분화 배지에서 세포 클램프를 재현 탁L- 글루타민, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올 및 50 ㎍ / ml의 아스 코르 빈산 산).
    3. EB 형성을위한 6 자 초저 부착 판에 세포를 전송합니다.
    4. 다음날 차별화 매체를 변경합니다.
    5. 3 일마다 중간 교체 및 현탁 배양에 사채을 유지한다.
  5. HCPCS를 분리
    1. 더 이상 인간의 CPC 격리를위한 차별화의 날 (9)보다 사채를 수집하지 않습니다.
    2. 대기음은 중간 두 번 DPBS로 사채를 씻어. 5 분 동안 37 ° C에서 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 0.25 % 트립신을 추가한다.
    3. 반응을 정지 분화 배지의 동일한 볼륨. 피펫 위아래로 하나의 세포로 사채를 해리합니다. 2 % FBS / DPBS에 5 분에 resuspend 세포 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 40 μm의 셀 스트레이너 및 FACS 정제 RFP + CPC 세포와 필터 세포로 1.4.3에 설명.
    4. 플레이트 geltin 코팅 된 플레이트 상에 HCPCS 정렬. 7 분화 배지에서 배양 HCPCS-9 일 심근 세포 및 평활근 세포로 분화한다. 칠일 도금 후, 문화 DMEM / F12 배지에서 5 % 녹아웃 SR과 세포를 분화.

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Representative Results

이 프로토콜은 여러 ES 세포주에서 클릭당 비용 (CPC)의 유도를 보여줍니다. 는 ESC는 클릭당 비용 (CPC)로 분화하는 교환 사채를 형성하기 위해 집계됩니다. 는 ESC 정기적으로 MEF 피더 (그림 1A, F)가 유지 관리 및 공급 장치는 차별화 전에 제거됩니다. 분화 배지에서 EB를 (도 1b, G)는 ESC에 응집하면, EB를 형성 제는 마우스 세포주 (도 1C)에서 중배엽 분화를 향상 BMP4 티빈과 함께 처리된다. 형광 단백질 YFP / RFP (그림 1D)에 의해 식별는 ESC는 심장 계보로 분화된다. 클릭당 비용 (CPC) (그림 1H) FACS 정제 및 심근 세포 및 평활근 세포로 분화하는 것이 더 배양 하였다. cTnT의 MHC-SM과의 염색 심근 및 평활근 세포 (그림 1 E, I, J)의 CPC로의 분화 능력을 보여 주었다. 일반적으로 80-90 %의 클릭당 비용 (CPC) 마우스 ESC 차별화 제자에서 얻을 수 있습니다ocol와 0.5 % 클릭당 비용 (CPC)은 인간의 ESC 분화 프로토콜에서 얻을 수 있습니다.

그림 1
그림 1 : 다 능성 클릭당 비용 (CPC)으로는 ESC의 차별화. (AE) 마우스 ESC 차별화. 피더 세포의 마우스 ESC의 (A) 형태학. (B) 마우스는 ESC 먼저 EB 형성. (C) 성장 인자 분화 배지에서 둘째 EB 형성. (D)의 CPC는 YFP을 표현한다. (E) 심근 (cTnT의 +) FACS - 정제 클릭당 비용 (CPC)에서 유래. 인간는 ESC의 (FJ)의 분화. 인간 ESC의 (F) 형태학 피더 세포에서 유지. 인간 ES 세포 (G) EB 형성. (H) FACS 정제 클릭당 비용 (CPC)의. (IJ) 클릭당 비용 (CPC) 심근 (cTnT의 +) 및 평활근 세포로 분화 (SM-MHC + 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
FBS Thermo scentific SH30070.03E
Knockout SR Life technology 10828028
Knockout DMEM Life technology 10829018
DMEM Life technology 11965118
NEAA Life technology 11140050
GlutaMAX Life technology 35050061
N2 Life technology 17502048
B27 Life technology 12587010
Ham’s F12 Life technology 11765062
IMDM Life technology 12440061
Pen/Strep Life technology 15140122
Pyruvate Life technology 11360070
Dispase Life technology 17105041
Stempro-34 Life technology 10639011
DMEM/F12 Life technology 11330032
BSA  Life technology 15260037
Trypsin  Life technology 25200056
Ascobic Acid  Sigma A5960
1-Thioglycerol Sigma M1753
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
VEGF R&D 293-VE
Bmp4 R&D 314-BP
ActivinA R&D 338-AC
bFgf R&D 233-FB
Fgf10 R&D 345-FG
mTeSR Stemcell technologies 5850
Matrigel BD Biosciences 354277

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 08/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

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