Afledning af Cardiac progenitorceller af embryonale stamceller

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z. Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (95), e52047, doi:10.3791/52047 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hjertesygdom er den hyppigste årsag i verden i dag, og dødeligheden er forblevet stort set uændret i de seneste to årtier (American Heart Association). Der er et kritisk behov for udvikling af nye terapeutiske strategier til effektivt forebygge eller reversere hjertesvigt. En lovende strategi er celle-baseret behandling efter den hurtige udvikling af stamceller biologi 1. I denne henseende kunne multipotente CPC være en fremragende cellekilde til terapi på grund af deres evne til at formere sig, men kun forpligtet til hjerte- afstamning differentiering. Derfor er effektiv og robust metode generere og isolere CPC'er er af stor betydning for studier hjerte celleterapi.

Denne protokol fokuserer på embryonale CPC'er identificeret under tidlig embryogenese og hvordan deres produktion fra økonomiske og sociale råd. Forskellige CPC'er er blevet isoleret fra embryonale og voksne hjerter, selv fra knoglemarv 2. Under udviklingen embryo, ben morphogetiske proteiner (BMP'er), vingeløse-type MMTV integrationssted familiemedlemmer (Wnts) og Nodal signaler inducerer engagement Mesp1 + multipotent mesoderm 3. Mesp1 + celler derefter differentiere til de embryonale CPC'er 4. Disse CPC'er typisk præget af HCN4, NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), og myocyt forstærker faktor 2C (Mef2c), danner primære og andet hjerte felter, og bidrage til de store dele af hjertet under cardiogenese 5-10. Både Nkx2-5 + og Isl1 + / Mef2c + CPC er i stand til at differentiere til cardiomyocytter, glatte muskelceller (SMC'er), og endotelceller 5-8. Således disse CPC'er vil give anledning til hjerte-kar samt hjertevæv og er en ideel celle kilde til cellebaserede hjerte terapi. Derfor genererer CPC'er in vitro har været et stort forskningsfokus i hjerte-kar-studier. Da økonomiske og sociale råd har ubegrænset ekspansion kapacitet and repræsenterer ICM celler ved blastocyststadiet, er differentiering af økonomiske og sociale råd i embryonale CPC'er efter den naturlige embryogenese betragtes som en logisk og effektiv tilgang til at opnå priser pr.

En almindelig anvendt metode til at opnå CPC'er fra økonomiske og sociale råd er at samle økonomiske og sociale råd i EB'er 11. For at forbedre differentiering effektivitet, har defineret kemiske og vækstfaktorer baseret på viden om hjerte-udvikling blevet brugt 12-14. Men der er ingen endelige CPC markører, især ingen celle-overflade markører, der er almindeligt accepteret i marken. For at løse dette problem, er økonomiske og sociale råd manipuleret til at markere Isl1 + eller Mef2c + CPC'er og deres derivater med fluorescerende reportere ved hjælp Cre / loxP-systemet. Cre-rekombinase er slået i under kontrol af Isl1 / Mef2c promotor / enhancer. Modificeret fluorescerende protein RFP eller YFP-genet drevet af en konstitutiv promotor kan aktiveres ved udskæring af flox stopkodon med Cre-rekombinase(ISL1: cre; pCAG-FLOX-STOP-FLOX-GFP eller RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) 5,6. Når økonomiske og sociale råd er differentieret i andet hjerte felt CPC'er vil Isl1 / Mef2c promotor / enhancer drevet CRE aktivere de fluorescerende reportere og CPC'er kan beriges ved FACS-oprensning. Kort fortalt EB sammenlægning metode anvendes til at initiere ESC differentiering. For at øge differentiering effektivitet er de differentierede celler behandlet med ascorbinsyre (AA) og vækstfaktorer, såsom BMP4, Activin A og VEGF 13,15. Denne protokol giver robust og effektivt CPC differentiering ved hjælp af både mus og menneskelige økonomiske og sociale råd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udledning af mus embryonale CPC'er fra Mouse økonomiske og sociale råd

  1. Forbered muse embryonale fibroblaster (MEF) fødelag.
    1. Varm MEF medium (10% FBS i DMEM) til 37 ° C.
    2. Forbered gelatineovertrukne plader.
      1. Der tilsættes 1 ml 0,1% gelatine i vand i en brønd på 6-brønds plade eller 5 ml i en 10 cm skål.
      2. Lad plader eller retter på 37 ° C eller stuetemperatur i mindst 30 min. Stræber gelatinen før brug.
    3. Thaw bestrålet MEF hurtigt i et 37 ° C vandbad, med forsigtig omrystning.
    4. Overfør cellerne forsigtigt til en 15 ml eller 50 ml konisk rør. Der tilsættes 5 ml forvarmet MEF medium. Swirl cellerne langsomt og der centrifugeres ved 200 xg i 5 min.
    5. Resuspender celler i MEF medium og tælle levedygtige celler. Brug følgende mængder MEF medium: 2 ml for celler per brønd fra en 6-brønds plade og 10 ml for celler fra en 10 cm skål.
    6. Plate celler i plader med 6 brønde eller 10 cm skåle 1-2x 10 6 pr plade / skål.
    7. Inkubér MEF plader / skåle ved 37 ° C, 5% CO 2 mindst 24 timer før brug.
      BEMÆRK: Smid MEF plader / tallerkener ældre end en uge.
  2. Forbered mus økonomiske og sociale råd
    1. Kultur Den Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP mus økonomiske og sociale råd om MEF'er indtil 90% sammenflydende. Brug ES-celle medium bestående af 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM pyruvat, 100 U Pen / Strep og 0,1 mM β-mercaptoethanol.
    2. Forbered gelatineovertrukne 6-brønds plader, som beskrevet i 1.1.2.
    3. Aspirer medium fra plader og skyl celler med DPBS.
      1. Aspirer DPBS og tilsæt 0,4 ml 0,25% trypsin i en brønd af 6-brønds plade. Cellerne inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 for 5 min. Tilsæt 1 ml forvarmet ES medium at ophøre Trypsin reaktion.
    4. Harvest celler og centrifuger celler ved 200 xg og aspirer medium. Resuspender celler i 1 ml ES-celle medium og tælle cellerne. </ Li>
    5. Plate ESC på gelatine-overtrukne plader ved densitet på 3 x 10 4 / cm2. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 til omkring 2 dage, når ESC nå op på omkring 90% sammenflydende. Skift medium hver dag.
    6. Når økonomiske og sociale råd er 90% sammenflydende, gentages trin 1.2.2-1.2.5 helt at fjerne MEF foderautomater.
  3. Fremkald CPC differentiering af EB-dannelse
    1. Forbered differentiering medium som følger: 36 ml IMDM, 12 ml Hams F12, 2 mM L-glutamin, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N2 0,5 ml B27, 50 ug / ml AA, og 0,45 mM 1-thioglycerol.
    2. Aspirer medium fra celler og skyl med DPBS. Aspirer DPBS og tilsæt 0,4 ml 0,25% trypsin i en brønd af 6-brønds plade. Der inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter.
    3. Tilsæt 1 ml differentiering medium at ophøre reaktionen og pipette op og ned for at sprede celleklynger i enkeltceller.
    4. Centrifuger økonomiske og sociale råd ved 200 xg i 5 min og kassér medium.
      1. Resuspender 1 x 10 6 </ Sup> økonomiske og sociale råd i 1 ml differentiering medium. Tæl celler og dyrke cellerne i lav løsgørelse petriskål ved en koncentration på 1 x 10 5 celler / ml i differentiering medium ved 37 ° C i første EB aggregering.
    5. To dage efter EB-dannelse, overføre EB'er fra skåle til 50 ml rør. Spin ved 200 xg i 1 min. Fjern medium og skyl EB'er med 10 ml DPBS uden Ca2 + og Mg2 +.
    6. Aspirer DPBS og tilsæt 1 ml 0,25% trypsin. Der inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter. Tilføj 4,5 ml differentiering medium for at standse reaktionen. Pipetter op og ned for at dissociere EB'er i enkeltceller.
    7. Centrifugeres cellerne ved 200 x g i 5 min. Aspirer medium og resuspender cellerne i 1 ml differentiering medium.
    8. Tæl celler og fortyndes 2 x 10 6 celler til 1 x 10 5 celler / ml i differentiering medium. Tilføj VEGF, BMP4 og activin A til mediet i en slutkoncentration på 5 ng / ml, 0,8 ng / ml og 5 ng / ml. Culture cellerne i petriskål i andet EB formation ved 37 ° C.
    9. 40 timer efter anden EB dannelse, overføre EB'er til 50 ml rør. Skyl med DPBS gang, dissociere EB'er med 1 ml 0,25% trypsin ved 37 ° C i 5 minutter. Pipetter op og ned for at dissociere EB'er i enkeltceller.
    10. Resuspender cellerne i Stempro-34-medium med 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF og 12,5 ng / ml FGF10. Plate cellerne ved 2 x 10 5 / cm 2 i gelatine-coatede plader. Kultur i 37 ° C inkubator i omkring 32 timer, før CPC isolation.
  4. Isoler mCPCs
    1. Aspirer medium og skyl med DPBS. Tilsæt 0,5 ml 0,25% trypsin til dyrkningsplader ved 37 ° C i 5 minutter. Tilføj 4,5 ml differentiering medium for at standse reaktionen. Pipetter op og ned for at dissociere EB'er i enkeltceller. Saml cellerne ved centrifuge og resuspender cellerne i 2% FBS / PBS for FACS-oprensning.
    2. Kør udifferentierede ESC på sorteringsanlæg som negativ kontrol. Skift spænding at justere fremad scatter (FSC) og sidespredning (SSC) for at vælge den ønskede population. Brug forward scatter versus side scatter og forward scatter højde versus bredde til at udelukke snavs og dublet. I det valgte delpopulation i henhold til fordelingen af ​​ØSU kontroller, tegne en port YFP positiv på histogram at fjerne celle autofluorescens. Saml YFP + CPC'er fra YFP + gating.
    3. Plate de oprensede CPC (YFP + celler) i 6-brønds plader med differentiering medium (1.3.1). Kultur yderligere 3-5 dage ved 37 ° C til differentiering af CPC i cardiomyocytter og SMC'er.

2. Afledning af humane embryonale CPC'er fra Human økonomiske og sociale råd

  1. Forbered Feeders
    1. Forbered muse embryonale fibroblaster (MEF) fødelag som beskrevet ovenfor med en densitet på 2 x 10 4 / cm2.
  2. Oprethold menneskelige økonomiske og sociale råd
    1. Vedligehold menneskelig ISL1: cre; pCAG-FLOX-STOP-FLOX-GFP eller RFP økonomiske og sociale råd rutinemæssigt på MEF hjælp regelmæssig embryonale medium (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 10 ng / ml basisk FGF). Forud for hjerte-differentiering, overføre menneskelige økonomiske og sociale råd i feeder fri tilstand i mindst 2 passager.
  3. Forbered menneskelige økonomiske og sociale råd i feeder fri tilstand
    1. Forbered coatede plader for menneskelige økonomiske og sociale råd kultur.
      1. Optø Matrigel ved 4 ° C natten over. Sæt en 50 ml rør på is, og der tilsættes 30 ml kold DMEM / F12-medium i røret.
      2. Tilsæt 1 ml matrigel i det kolde medium og bland godt. Tilsæt 1 ml kold Matrigel-DMEM / 12 medium i en brønd på 6-brønds plade eller 5 ml i en 10 cm skål.
      3. Lad plader / retter på 4 ° C natten eller stuetemperatur i 2 timer. Aspirer medium før brug.
    2. Split menneskelige økonomiske og sociale råd på pladerne: Aspirer medier fra MEF plade og skyl menneskelige økonomiske og sociale råd med DPBS. Derefter tilsættes 1 ml dispase (1 mg / ml) til en brønd i 6-brønds plade. Cellerne inkuberes i 37 ° Cinkubator indtil kanterne af kolonier begynder at løsne.
    3. Fjern dispase opløsning. Skyl med DPBS to gange, hvorefter der tilsættes 2,5 ml / per godt mTeSR medium eller MEF-medium til pladen.
    4. Skrabes celler under anvendelse af en celleskraber og omhyggeligt pipetteres op og ned for at bryde menneskelige kolonier ESC i små klumper.
    5. Overfør ESC klumper og fortyndes 1: 3 i de coatede plader.
    6. Tilsæt 2 ml / godt mTeSR medium eller MEF-medium og ændre medium dagligt.
    7. Kultur menneskelige økonomiske og sociale råd i mTeSR medium eller MEF-medium på coatede plader i mindst 2 passager.
  4. Fremkald CPC differentiering fra humane økonomiske og sociale råd
    1. Når cellerne er ~ 90% sammenflydende, suge mediet og skyl med DPBS. Derefter inkuberes hESCs i 0,5 mg / ml Dispase ved 37 ° C i 20 minutter.
    2. Skyl hESCs med DPBS to gange, fjerne celler fra plader med en celle løfteren, så resuspender celle klemmer i differentiering medium (DMEM / F12 indeholdende 18% FBS, 0,1 mM NEAA, 2 mML-glutamin, 0,1 mM β-mercaptoethanol og 50 ug / ml ascorbinsyre).
    3. Overfør celler i 6-brønds ultralave fastgørelsesplader for EB formation.
    4. Skift differentiering medium næste dag.
    5. Erstat medium hver 3 dage og vedligeholde EB'er i suspensionskultur.
  5. Isoler HCPCS
    1. Saml EB'er senest dag 9 af differentiering til human CPC isolation.
    2. Aspirer medium og skyl EB'er med DPBS to gange. Tilsæt 0,5 ml 0,25% trypsin til hver brønd i 6-brønds dyrkningsplader ved 37 ° C i 5 minutter.
    3. Tilføj lige volumen differentiering medium for at standse reaktionen. Pipetter op og ned for at dissociere EB'er i enkeltceller. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter, og resuspender cellerne i 2% FBS / DPBS. Filter celler med 40 pm cellefilter og FACS-oprensede RFP + CPC celler som beskrevet i 1.4.3.
    4. Plate sorteret HCPCS onto geltin-coatede plader. Kultur HCPCS i differentiering medium for 7-9 Dag at differentiere til cardiomyocyte og glatte muskelceller. 7 dage efter udpladning, kultur differentierede celler med 5% Knockout SR i DMEM / F12-medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen viser afledning af CPC fra flere ES-cellelinjer. Økonomiske og sociale råd er aggregerede at danne EB'er at differentiere til CPC'er. ESC rutinemæssigt vedligeholdes på MEF foderautomater (figur 1A, F) og foderautomater fjernes før differentiering. Ved sammenlægning af økonomiske og sociale råd i EB'er i differentiering medium (figur 1B, G), andet dannede EB'er behandlet med BMP4 og Activin A at øge mesoderm differentiering i mus cellelinjer (figur 1C). Økonomiske og sociale råd er differentieret i hjertets afstamning som identificeret ved fluorescerende protein YFP / RFP (figur 1D). CPC blev FACS-oprensede (figur 1H) og yderligere dyrket til at differentiere til cardiomyocytter og glatte muskelceller. Farvningen af cTnT og SM-MHC viste differentiering kapacitet CPC'er i cardiomyocytes og glatte muskelceller (Figur 1 E, I, J). Typisk er 80-90% CPC opnået fra mus ESC differentiering protocol og 0,5-5% CPC'er opnås fra det humane ESC differentiering protokol.

Figur 1
Figur 1: Differentiering af økonomiske og sociale råd i multipotente CPC'er. (AE) mus ESC differentiering. (A) Morfologi af muse ESC i feeder-celler. (B) Første EB dannelse af mus økonomiske og sociale råd. (C) Anden EB dannelse i differentiering medium med vækstfaktorer. (D) CPC'er udtrykker YFP. (E) Cardiomyocytter (cTnT +) afledt af FACS-oprensede CPC'er. (FJ) Differentiering af menneskelige økonomiske og sociale råd. (F) Morfologi af human ESC vedligeholdes på feeder-celler. (G) EB dannelse af humane ES-celler. (H) FACS-renset for CPC'er. (IJ) CPC'er differentieret i cardiomyocytter (cTnT +) og glatte muskelceller (SM-MHC + Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FBS Thermo scentific SH30070.03E
Knockout SR Life technology 10828028
Knockout DMEM Life technology 10829018
DMEM Life technology 11965118
NEAA Life technology 11140050
GlutaMAX Life technology 35050061
N2 Life technology 17502048
B27 Life technology 12587010
Ham’s F12 Life technology 11765062
IMDM Life technology 12440061
Pen/Strep Life technology 15140122
Pyruvate Life technology 11360070
Dispase Life technology 17105041
Stempro-34 Life technology 10639011
DMEM/F12 Life technology 11330032
BSA  Life technology 15260037
Trypsin  Life technology 25200056
Ascobic Acid  Sigma A5960
1-Thioglycerol Sigma M1753
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
VEGF R&D 293-VE
Bmp4 R&D 314-BP
ActivinA R&D 338-AC
bFgf R&D 233-FB
Fgf10 R&D 345-FG
mTeSR Stemcell technologies 5850
Matrigel BD Biosciences 354277

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, (6), 689-698 (2013).
  2. Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, (7193), 322-329 (2008).
  3. Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107, (12), 1414-1427 (2010).
  4. Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3, (1), 69-84 (2008).
  5. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460, (7251), 113-117 (2009).
  6. Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287, (29), 24255-24262 (2012).
  7. Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114, (11), 2437-2445 (2013).
  8. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127, (6), 1137-1150 (2006).
  9. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15, (9), 1098-1106 (2013).
  10. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287, (1), 134-145 (2005).
  11. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91, (3), 189-201 (2002).
  12. Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (31), 12667-12672 (2013).
  13. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, (2), 228-240 (2011).
  14. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, (14), 1912-1916 (2003).
  15. Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, (1), 206-220 (2012).
  16. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  17. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12, (4), 393-394 (2013).
  18. Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31, (7), 397-405 (2013).
  19. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14, (1), 49-55 (2013).
  20. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, (6121), 823-826 (2013).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25, (9), 1015-1024 (2007).
  23. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  24. Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (37), 13170-13175 (2005).
  25. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76, (9), 958-970 (2008).
  26. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-1857 (2012).
  27. Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11, (3), 1335-1347 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 08/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics