השימוש בMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ומסד נתונים מותאמים אישית לאפיון חיידקים ילידים למערת סביבה ייחודית (Kartchner מערות, AZ, ארה"ב)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, L., Vranckx, K., Janssens, K., Sandrin, T. R. Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA). J. Vis. Exp. (95), e52064, doi:10.3791/52064 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

זהירות: חיידקים לא מזוהים מכל סביבה עשויים להיות פתוגניים ויש לטפל בם בזהירות תוך שימוש בפרוטוקולי בטיחות ביולוגי מתאימים. עבודה עם תרבויות חיות חייבת להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II באמצעות בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2) נהלים. מידע נוסף על-2 BSL נהלים נגיש במדריך CDC / NIH שכותרתו, "הבטיחות הביולוגית במיקרוביולוגים ויו-רפואיים מעבדות," דפים 33-38. המסמך זמין באופן מקוון http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf. ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כוללים חלוקי מעבדה / שמלות, משקפי מגן, כפפות וnitrile או לטקס, חייב להיות משוחק. שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטית ואמצעי זהירות יש אחריו, ופסולת ביולוגית מסוכנת חייבת להיות מושלכת כראוי.

חיידקים המשמשים בהפגנה זו היו מבודדים ממערות Kartchner,AZ, ארצות הברית, מארבע סביבות, כולל speleothem היבש, זרימת אבן, speleothem הלח וטפטוף נטיפים (טבלת 1). כל הבידודים זוהו על ידי רצף 16S rDNA והמשיכו ב -80 מעלות צלזיוס ב -25% גליצרול-R 2 B בינוניים. כל הניסויים הושלמו בRT.

הערה: אנו ממליצים על השימוש באותה שיטת הכנת מדגם לרכוש ספקטרה ההמונית לבניית מסד נתונים וספקטרה ההמונית של אלמונים. שיטת הכנת מדגם הוכחה בעבר להשפיע על איכות ספקטרום ושחזור 3. באמצעות מדגם שיטת הכנה שונה עלול לגרום לזיהוי שגוי של אלמונים, רזולוציה הטקסונומית במיוחד כאשר גבוהה יותר (לדוגמא, ברמת המתח) הוא רצוי.

1. הפקדת ביעד MALDI

זהירות: מספר פרוטוקולים להשיג תמציות חלבון דורשות שימוש בחומצות וממסים אורגניים שחייבים להיות מנוצל בהתאם לguidelines ומידע כלול בגיליונות שלהם בהתאמה חומרי בטיחות (MSDS). PPE המתאים חייב להיות משוחק וישתנה בהתאם לסוג ונפח של כימיקלים המשמש (למשל, חלוקי מעבדה / שמלות, כפפות, משקפי מגן, ויש להשתמש בציוד להגנת נשימה בעת עבודה עם כמויות משמעותיות של ממסים רעילים, דליקים, כגון אצטוניטריל, וחומצות המאכלות, כגון חומצות פורמית וtrifluoroacetic).

  1. הפקדת 1 μl תמצית חלבון המכילה לא תאי קיימא (שהושגו תוך שימוש בפרוטוקולים מתאימים, שתוארו קודם לכן 11-13) על צלחת יעד MALDI נירוסטה ולאפשר לו להתייבש. כיסוי תמצית החלבון המיובש עם פתרון מטריצת μl 1 (α-cyano-4-הידרוקסי-cinnamic פתרון חומצה), ולאפשר לו להתייבש.
  2. עבור כל לשכפל ביולוגי, במקום מספר מתאים של משכפל טכני (5 עד 20 חזרות טכניות). כאן, במקום 10 חזרות טכניות לכל לשכפל ביולוגי ו -3 משכפל ביולוגי were מוכן.
    הערה: אנו ממליצים על שימוש בצלחת יעד פלדת MALDI מלוטש בעת השימוש בשיטת הכנת מדגם מיצוי חלבון. שימוש בצלחות יעד פלדת קרקע עלולה לגרום להתפשטות וערבוב מכוון של המדגמים השונים מחוץ לבארות מדגם בודדות.
  3. פיקדון סטנדרטי μl 1 calibrant לצלחת היעד ולאפשר לו להתייבש. שכבה עם פתרון מטריצת μl 1 ולאפשר לו להתייבש.
  4. פתרון הפקדה 2 μl מטריצה ​​לצלחת היעד כביקורת שלילית.

2. Mass ספקטרה רכישה

  1. השתמש בספקטרומטר מסת MALDI-TOF מצויד בליזר חנקן (ננומטר = λ 337) ומופעל באמצעות תוכנת הברוקר FlexControl.
  2. לאסוף כל ספקטרום המוני במצב ליניארי חיובי על ידי הצטברות של 500 יריות לייזר ב -100 מרווחי זריקה. הגדר את מתח מקור יון 1 עד 20 קילו וולט; מקור יון 2 מתח ל18.15 קילו וולט; ומתח העדשה 9.05 קילו וולט. שים לב שהפרמטרים אלה הם מכשיר-ספציפייםפיק ועשוי לחייב את התאמה במכשירים אחרים כדי לקבל תוצאות אופטימליות.
  3. הגדר את טווח מסה לתשלום עבור הערכת ספקטרום אוטומטית 2-20 kDa לכל תשלום. השתמש באלגוריתם זיהוי שיא centroid. הגדר את סף הרזולוציה המינימאלי של 100 Da. הגדר את יחס האות לרעש (S: N) סף ב2. הגדרת סף עוצמת המינימום ב -100.

בניית מסד נתונים 3.

  1. עיצוב מסד נתונים
    1. ליצור מסד נתונים חדשים בBioNumerics 7.1 באמצעות "אשף מסד הנתונים החדש".
    2. צור סוג ספקטרום ניסוי, למשל, MALDI, באמצעות פקודות בלוח "סוגי הניסוי".
    3. צור הרמות באמצעות "פנל עיצוב מסד נתונים". להוסיף רמות חדשות באמצעות "הרמה> הוסף רמה חדשה ..." הפקודה בתפריט "מאגר המידע". כאן, ליצור רמה, רמה "מינים" "לשכפל ביולוגי" "ו" לשכפל טכני "רמה, respectivאיליי.
  2. יבוא ועיבוד מקדים ספקטרה ההמונית גלם
    1. לייצא את הספקטרום המוני גלם כקבצי txt באמצעות FlexAnalysis על ידי לחיצה על הפקודה "יצוא> ספקטרום המוני" בתפריט "הקובץ".
    2. ייבא את ספקטרום הגלם ההמוני (קבצי txt) לתוך מסד הנתונים ברמה הטכנית משכפל.
    3. Preprocess ספקטרה ההמונית הגלם.
      1. יבוא ודגימה מחדש (באמצעות אלגוריתם מתאים ריבועית).
      2. לבצע חיסור בסיסי (עם דיסק מתגלגל עם גודל של 50 נקודות).
      3. לחשב רעש [Transformation אדוה הרציף (CWT)], חלקה (Kaiser חלון עם גודל חלון של 20 נקודות ובטא של 10 נקודות), ולבצע חיסור שני בנקודת ההתחלה (מתגלגל דיסק עם גודל של 200 נקודות).
      4. זיהוי פסגות [CWT עם אות מינימום יחס רעש (S: N) של 10].
    4. לאחר העיבוד מקדים, להציל את הדפוסים אופייניים של כל ספקטרום המוני, כגון רשימות שיא המכילות שיאגדלים, עוצמות שיא, S: N, וכו ', במסד הנתונים.
  3. יצירת ספקטרה ההמונית מרוכבים
    1. צור ספקטרום מורכב מ ספקטרום עיבוד מקדים באמצעות הפקודה "סכם ..." בתפריט "ניתוח". בחר "לשכפל הביולוגי" כרמת יעד.
    2. כאן, לשלב ספקטרה ההמונית של 10 חזרות טכניות של אותו המושבה להניב ספקטרום המוני מרוכבים למושבה ש, וכתוצאה מכך שלוש ספקטרה ההמונית מרוכבים לבודד שברמה "לשכפל ביולוגי".
    3. כאן, לסכם את הספקטרום מרוכבים שלוש כדי ליצור ספקטרום מרוכבים אחד הלמבודד ברמת "המינים".
      הערה: ספקטרום מרוכבים הוא ממוצע נקודה-by-נקודה הטכנית משכפל. משכפל עם דמיון (מתאם פירסון) לממוצע נמוך מ 95% (ברירת מחדל) אינם נכללים במרוכבים. פסגות על ספקטרום מרוכבים נקראות רק אם הם קיימים ב -75% (הגדרת ברירת מחדל) של משכפל הכלול. למשכפל הביולוגי, הגדרות אלה היו 90 ו -60%, בהתאמה.

ניתוח 4. Mass ספקטרום נתונים

  1. בחר את הערכים במסד הנתונים וליצור השוואה על ידי לחיצה על הפקודה "צור השוואה חדשה" בפנל "השוואות".
  2. כאן, להשתמש בספקטרום ההמוני ב" לשכפל טכניים "ו / או רמות" לשכפל ביולוגי "להראות השוואות וניתוחים.
  3. ניתוח אשכולות מבוסס דמיון ואת קנה מידה רב ממדית (MDS)
    1. ליצור קבוצות עם צבעים. בחר שלוש ספקטרה ההמונית מרוכבים הביולוגית ולחץ על "הקבוצה החדשה צור מבחירה" הפקודה בתפריט "קבוצות" כדי ליצור קבוצה לבודד המקביל. לייעד צבע באופן אוטומטי המשמש לשלוש ספקטרה ההמונית אלה.
    2. לחלופין, להגדיר מדינות שדה עם צבעים מקביל באמצעות הפקודות ב"ערכי פנל מסד הנתונים, "כך שכל קבוצה המבוססת על תחום המוגדר הזה משתמש באותו הצבע שהוגדר עבור קבוצה זו.
    3. לבצע ניתוח אשכולות. לחץ על הפקודה "חשב ניתוח אשכולות" בתפריט "Clustering". בדף הגדרות השוואת 1, בחר את "מתאם פירסון" ולהשאיר את פרמטרים אחרים כברירת מחדל. בעמוד 2, בחר "UPGMA". לאחר מכן לחץ על "סיום".
    4. להשיג עלילת MDS באמצעות "קנה המידה רב-ממדית ..." פקודת בתפריט "סטטיסטיקה".
  4. התאמת שיא
    1. לחץ על סוג הקשת "MALDI" בפנל "ניסויים". לאחר מכן בחר "פריסה '> תמונת הצג". ספקטרום מוצג כלהקות ג'ל.
    2. לבצע התאמת שיא באמצעות הפקודה "האם התאמת שיא" בתפריט "ספקטרה".
  5. זיהוי של שיעורי שיא
    1. ביצוע ניתוח עיקרי רכיב (PCA). סמן את ""סוג הניסוי ב" MALDI הניסויי" הפנל ולהשתמש "ניתוח המרכיבים עיקריים ..." הפקודה בתפריט "סטטיסטי" לבצע PCA.
    2. בצע אשכולות דו-כיווניים. לחץ על "סטטיסטיקה> כריית מטריקס" ... בחלון "ההשוואה". העצמה של הפסגות המותאמות לכיתות השיא מיוצגת באמצעות צבעים שונים (מפת חום).

זיהוי 5. חיידקים עם מסד נתונים מותאמים אישית

  1. שיטה מבוססת מקדם דמיון
    1. צור השוואה וליצור dendrogram מבוסס על ספקטרום המוני ברמה "לשכפל טכני" כמתואר בשלב 4.3.3. שמור את dendrogram להשוואה של דמיון.
    2. בחר ספקטרום מסה לא ידוע, ולחץ על "ניתוח> זהה את הערכים שנבחרו". תיבת הדו-שיח זיהוי מופיעה.
    3. בחר ", המבוסס ההשוואה" הסוג מסווג (או classif מאוחסןIER) ולחץ על "הבא". בעמוד הבא, לבחור את dendrogram נשמר כהשוואת התייחסות ולאחר מכן לחץ על "הבא".
    4. בחר "דמיון בסיסי" כשיטת זיהוי ולאחר מכן לחץ על "הבא".
    5. בחר "דמיון המרבי" כשיטת ניקוד. הקלד בערכי סף מתאימים וערכי הבדל מזערי לכל פרמטר ולאחר מכן לחץ על "הבא".
    6. ברגע שהחישובים הושלמו, חלון ההזדהות מופיע. בפנל "תוצאות", החברים של מסד הנתונים המתאימים ביותר ללא ידוע מופיעים ברשימה.
    7. שמור את פרויקט זיהוי ולאמת את זיהוי באמצעות הפקודה "אימות צולבת ניתוח" בפנל "פרויקט זיהוי".
  2. שיטה מבוססת סמן ביולוגי פוטנציאלית
    1. להגדיר שיעורי שיא. בחלון "מטריקס כרייה", בוחר בקבוצה של פסגות שיתוף מאפיינים משותפים ולהגדיר פסגות אלה כספציפייםשיעורי שיא הפיק (סמנים ביולוגיים פוטנציאליים) באמצעות "ספקטרה> ניהול סוגי מעמד שיא ..." ב" חלון ההשוואה ".
    2. כאן, להגדיר שיעורי שיא ספציפיים לכל בודד לכל 15 הבידודים.
    3. בחר את הספקטרום ההמוני של אלמונים ולהתאים את הפסגות של ספקטרום אלה לשיעורי שיא המוגדרים כפי שתואר לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מסדי נתונים שנבנו בהפגנה זו היו ארבע רמות, מגבוה ביותר לנמוך ביותר, הכולל את "כל הרמות",, "לשכפל ביולוגי" "מינים" ו- "לשכפל טכני", בהתאמה (איור 1 א). הרמה "הטכנית לשכפל" הכילה את כל ספקטרום העיבוד המקדים של משכפל טכני. "לשכפל הביולוגי" והרמות "מינים" הכילו את מרוכבים הספקטרום (סיכום). "כל הרמות" הכילו את כל הספקטרום לשכפל הטכני, כמו גם את כל הספקטרום המורכב.

נהלי סיכום ספקטרום מוצגים באיור 1 באמצעות פסגות נציג. כל ספקטרום המוני חבר מופיע כקו אפור דק. ספקטרום מרוכבים מיוצג כקו בצבע אדום. פסגות סמוכות מסומנות בצבע שונה, כדי לאפשר בדיקה ויזואלית קלה יותר (איור 1).

= "Jove_content"> שחזור של ספקטרה ההמונית של 30 חזרות (שלושה משכפל ביולוגי, כל אחד עם 10 חזרות טכניות) חושבו ומוצגת בלוח 1. שחזור הגבוה ביותר היה 98.0 ± 1.4 למיני Bacillus B, והנמוך ביותר שחזור היה 89.4 ± 7.8 למיני Curvibacter (טבלה 1).

ניתוח אשכולות ברמת ההדמיה לשכפל ביולוגית הקלה של המבנה ההיררכי בנתונים ספקטרה ההמוניים המורכבים. כפי שניתן לראות באיור 2, משכפל ביולוגי התקבץ יחד, ו -15 מינים של חיידקים נוצרו 15 אשכולות. מינים קרובים, למשל, sp ב. A, B, D, ו- E, נטה להתקבץ יחדיו. עם זאת, חריגים, למשל, sp ב. C ו- F, נצפו גם. חלקות MDS מבוססות על הספקטרום ההמוני ברמות "הטכנית והביולוגיות" מוצגות באיור 3. p MDSהרבה הניב להדמיה של הדמיון בין הספקטרום של חיידקים אלה ברורים, 3-D. שני חזרות טכניות ומשכפל ביולוגי הראו קיבוץ דומה (איור 3 A ו- B).

התאמת שיא הייתה בשימוש להבחין סטים של פסגות בספקטרום המוני. פרמטרים התאמת שיא, כוללים סובלנות קבועה (נקודות על ציר x), סובלנות ליניארי (ppm) ושיעור גילוי שיא צריכים להיות מוגדרים על ידי המשתמש. סובלנות מתמדת וסובלנות ליניארי הם הגורמים המשמשים לחישוב סובלנות העמדה של הפסגות באמצעות המשוואה: סובלנות עמדה = סובלנות קבועה + סובלנות ליניארי × מ '/ z. עם m / z הגדלת, את החשיבות של הסובלנות הקבועה מפחיתה. שיעור שיא גילוי משמעות הדבר היא כי רק אם הוא נמצא בשיא תנוחה זו במשך יותר מהשיעור המוגדר של הספקטרום, ברמת שיא הוא עשה. שיא על דפוסים אחד או יותר מייצג מעמד שיא. לדוגמא, אם equa שיעור זיהוי שיאls 10%, ברמת שיא יכולה להתבצע רק אם יותר מ -10% מהספקטרום יש לי פסגות בעמדה. זה אינו כולל פסגות שכיחות נמוכה (בדרך כלל פסגות רעש) בקבוצה עם משכפל טכני. אם הערכה מבוססת על הספקטרום המורכב של משכפל ביולוגי, מספר זה יכול צריך להיות נמוך יותר כמו פסגות שכיחות נמוכות כבר סוננו במהלך היצירה של הספקטרום המורכב. בהפגנה זו, התאמת שיא בוצעה באמצעות ספקטרום המוני ברמה "לשכפל טכני" ואת הערכים של פרמטרים אלה היו 1.9, 550 ו -10%, בהתאמה. בהתבסס על פרמטרים שנבחרו, פסגות נחשבו כהתאמה או לא תואם, וכתוצאה מכך קבוצות שיא שונות. דוגמא לתוצאות תואמות שיא מוצגת באיור 4 באמצעות 30 חזרות של בודד בודד (מיני Bacillus). התוצאות התואמות היו דמיינו כשולחן שבו עוצמות הגלם נמצאים כצבעים. כחול מציין בעצימות נמוכות ואדומים מציין גבוהה intensity. בהתבסס על התוצאות התואמות לשיא, משתמשים יכולים להגדיר שיעורי שיא המאפשרים מעקב הניתוחים.

שניהם הניתוח העיקרי הרכיב (PCA) (איור משלים 1) וקיבוץ באשכולות דו-כיווני ניתן להשתמש כדי לנתח את שיעורי שיא המורכבים. תוצאת אשכולות נציג דו-כיוונית באמצעות ספקטרום המוני ברמה "לשכפל טכני" מוצגת באיור 5. שתי dendrograms מוצג. אחת מהן הוא בסמוך לערכים / z מ ', והשני הוא מעל לערכי החיידקים (איור 5). עוצמת שיא הייתה מיוצגת על ידי צבעים שבי ירוקים מציין בעצימות נמוכות ואדומים מציין בעוצמה גבוהה. לדוגמא, sp ב. וF לשתף מעט מאוד שיעורי שיא עם sp ב. B ו- D (איור 5). בחינה מדוקדקת הראתה כי sp ב. B ו- D יש גם קבוצות של כיתות מינים ספציפיים שיא (איור 5). תוצאות אלו מצביעות על כך שקבוצות מסוימות שיא שיתוף CERT ניתן להגדיר מאפייני עין כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים ברמת מין. לדוגמא, שלוש עשרה סטי שיא השייך לsp ב. D נבחרו והוגדר כשיעורי שיא (סמנים ביולוגיים פוטנציאליים) של sp ב. D, כולל 2,152.5, 2,894.9, 3,420.8, 4,302.0, 4,339.9, 4,629.2, 5,189.4, 5,448.4, 5,878.7, 6,388.8, 6,838.8, 6,931.1, ו7,849.1 (טבלה 2). שיעורי שיא של בידודים שונים ניתן לראות בצבעים שונים (איור משלים 2). שיעורי שיא ספציפיים לכל לבודדם נספרו בטבלה 2. שיעורי שיא מוגדרים נבדקו נוספים באופן ידני כדי לוודא שהם הופיעו בכל משכפל הטכני בעוצמה מינימאלית של 100 au יתר על כן, תת קבוצות של שיעורי שיא עשויים גם להיות מאוחסנות כדי להקל על אפיון של חיידקים בתת-המין ו / או רמות מתח, למשל, להבחין זנים פתוגניים מזנים שאינם פתוגניים ו / או לבחון התנגדות / רגישות לאנטיביוטיקה.

אף אוזן גרון "> לגבי זיהוי, ספקטרה ההמונית של בידודים מקודדים עיוורים נאספו ומעובד באותו אופן כמו ספקטרה המוני התייחסות במאגרי המידע. לזיהוי המבוסס על השוואה של מקדמי דמיון, ערכי פרמטרים שצוינו, כוללים הדמיון המרבי 95.0% ובדמיון הממוצע ב-87%. דמיון מזערי לא צוין (כלומר, נותר מסומן). ערכי הבדל המינימום נקבעו כ5 עבור שניהם דמיון המרבי והדמיון ממוצע. ערכים אלה ייתכן שיהיו הצורך להיות מותאמים יותר להגדלה שיעור זיהוי נכון. איור 6 מציג את תוצאות זיהוי המבוססות על השוואות של מקדמי דמיון (איור 6). תוצאת ההתאמה הציעה כי חיידק מקודד עיוור זה היה sp B. הסביר ביותר. א פרויקט זיהוי זה מבוסס על ההשוואה של מקדם דמיון קבל תוקף נוסף על ידי אימות צולבת (איור משלים 3 (איור משלים 3). מעניין, אימות צולבת לפרויקטי זיהוי המבוססים על ההשוואה של שיעורי שיא היא הרבה יותר מהר מאשר אלה המבוססים על ההשוואה של מקדם דמיון.

זיהוי יכול גם להסתיים מבוסס על שיא התאמת כיתה (איור משלים 4). עם זאת חוסר התאמה של פסגות נצפו (איור משלים 4). חוסר ההתאמה יכולה להיות בגלל שינוי מסה כתוצאה מחילופי חומצת אמינו בחלבונים המתאימים. הפסגות אינם מתאימות יכולות להיות גם פסגות שאינן מפלים, ברמת המין, אבל הם ספציפיים לזן זה או לבודד. יחדיו, oתוצאות ur מראות כי שתי שיטות זיהוי - מקדם דמיון ומבוסס סמן ביולוגי - יכולות בקלות לזהות חיידקים ברמת המין מסביבות קרסטיות באמצעות הכנת המדגם, רכישת ספקטרום, ועבודת ניתוח נתונים שתוארה כאן.

איור 1
איור 1. בניית מסד נתונים וסיכום ספקטרה המונית מבנה של מסדי נתונים שנבנו בהפגנה זו ().; איור של סיכום שיא באמצעות פסגות מ 10 חזרות טכניות של Aminobacter מינים (B).

איור 2
איור 2. Dendrogram של מרוכביםספקטרה ההמונית ברמה לשכפל הביולוגית. ערכת נתונים מכילה ספקטרום של 15 מינים שונים עם שלושה ספקטרום מרוכבים עבור כל מין. כל מין היה מקודד בצבע.

איור 3
איור 3. קנה מידה רב-ממדי (MDS) ייצוגים של ספקטרה ההמונית ברמה לשכפל הטכנית עם 30 ספקטרום עבור כל מין () ורמה לשכפל ביולוגית עם שלושה ספקטרום מרוכבים עבור כל מין (B). צבעים קודדו כבאותם צבעים כפי שבאיור 2.

איור 4
איור 4. איור של שולחן תואם שיא. טבלה נוצרה על בסיס ספקטרום המוני של מיני Bacillus בleve לשכפל הטכני l. הערכים של פרמטרים התאמת שיא היו 1.9 לסובלנות מתמדת, 550 לסובלנות ליניארי ו -10% לשיעור זיהוי שיא, בהתאמה. כחולים מציין עוצמת שיא נמוכה ואדומים מציין עוצמת שיא גבוהה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 5
איור 5. איור של אשכולות דו-כיווניים. איור נוצר באמצעות ספקטרום המוני ברמה לשכפל הטכנית. צבעים של בידודים קודדו כבאותם צבעים כמו בשימוש באיור 2. עוצמת שיא מיוצגת על ידי צבעים, עוצמת ירוקה משמעות נמוכה ומשמעות אדומה בעוצמה גבוהה. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

fo: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 6
זיהוי חיידק 6. איור המבוסס על השוואה של מקדם דמיון באמצעות מסד נתונים מותאמים אישית.

זיהוי מקור הקרובים b / פילוס / מחלקה היחסית # הצטרפות יחסי הקרוב ביותר) דמיון% מפתח BioNumerics שחזור (%)
D2 speleothem יבש sp Bacillus. E-257 / Firmicutes FJ764776.1 98.8 מיני Bacillus 94.9 ± 4.0
D7 speleot יבשמכפלת sp Bacillus. GGC-P3 / Firmicutes FJ348039.1 99.0 מיני Bacillus B 98.0 ± 1.4
F1 אבן זרימה ניאצין Bacillus להתאמץ M27 / Firmicutes KC315764.1 99.2 מיני Bacillus C 96.5 ± 2.4
F4 אבן זרימה sp Bacillus. GGC-P5A1 / Firmicutes FJ348046.1 99.1 מיני Bacillus D 89.8 ± 8.8
F9 אבן זרימה sp Bacillus. OSS 19 / Firmicutes EU124558.1 99.4 מיני Bacillus E 96.5 ± 1.9
R10 טפטוף נטיפים sp Bacillus. K1 / Firmicutes GU968734.1 99.8 מיני Bacillus F 95.4 ± 3.9
D11 speleothem יבש IMAU80218 מתח brevis Brevibacillus / Firmicutes GU125635.1 99.5 מיני Brevibacillus 94.3 ± 5.8
F14 אבן זרימה sp Exiguobacterium. ZWU0009 / Firmicutes JX292087.1 99.3 מיני Exiguobacterium 96.5 ± 2.5
M7 speleothem הלח sp Brevibacterium. N78 / Actinobacteria HQ188605 97.6 מיני Brevibacterium 97.5 ± 2.0
M14 speleothem הלח זן Kocuria rhizophila Ag09 / Actinobacteria EU554435.1 100 מיני Kocuria 95.2 ± 4.1
M15 speleothem הלח sp Brevibacterium. MN3-3 / Actinobacteria JQ396535.1 99.5 Brevibacterium המינים B 92.1 ± 4.9
R4 טפטוף נטיפים sp Aminobacter. KC-EP-S4 / α-פרוטאובקטריה FJ711220.1 99.9 Aminobacter מינים 95.4 ± 2.7
F5 אבן זרימה Comamonas מתח testosteroni NBRC 12047 / β-פרוטאובקטריה AB680219 100 מיני Comamonas 96.4 ± 2.6
R8 טפטוף נטיפים כְּבִיסָה עֲדִינָה Curvibacter / β-פרוטאובקטריה AB680705 97.0 Curvibacter < / Em> מינים 89.4 ± 7.8
F8 אבן זרימה sp Moraxella. 19.2 KSS / γ-פרוטאובקטריה HE575924.1 99.9 מיני Moraxella 92.6 ± 4.9

חיידקים בודדו מKartchner מערות, AZ, ארה"ב ומזוהה באמצעות רצף 16S rDNA. שני פריימרים, 27 (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') ו1492r (5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3 "), שמשו להשגה כמעט 1,400 נקודות בסיס באורך 16S רצפי גני rRNA.
ב בהתבסס על חיפוש פיצוץ של מסד נתוני צמח השדה.
ג ערכים מדווחים מקדמי המתאם הממוצע של 30 חזרות (שלושה משכפל ביולוגי של כל עם 10 חזרות טכניות) ± סטיית תקן אחת.

חיידקים 1. שולחן מבודד המשמשים בהפגנה.

fo: דף-הפסקה-לפני = "תמיד">

מפתח BioNumerics שיעורי שיא / סמנים ביולוגיים פוטנציאליים (Da)
מיני Bacillus 2,152.5, 2,224.9, 2,595.8, 2,894.9, 2,921.3, 3,380.5, 3,496.3, 3,515.0, 3,733.5, 4,302.0, 4,340.0, 4385.8,4763.9, 4,910.6, 5,189.4, 5,227.0, 5,634.6, 5,769.6, 5,892.8, 6,301.4, 6,756.2, 6,789.4, 6,990.3, 7,029.5, 7,466.3
מיני Bacillus B 2,152.5, 2,941.2, 3,196.9, 3,262.7, 3,352.9, 3,420.8, 3,733.5, 3,925.2, 4302.0,4339.9, 4,629.2, 4,713.4, 4,859.3, 4,900.6, 5,189.4, 5,227.0, 5,541.8, 5,878.7, 6,388.8, 6,524.0, 6,704.5, 6,838.8, 7,142.7, 7,317.5, 7,466.3, 7,849.1, 9,263.9, 9,721.2
מיני Bacillus C 2,588.0, 3,361.8, 4,330.4, 5,173.0, 5,847.6, 6,332.0, 6,524.0, 6,720.3
מיני Bacillus D 2,152.5, 2,894.9, 3,420.8, 4,302.0, 4339.9, 4,629.2, 5,189.4, 5,448.4, 5,878.7, 6,388.8, 6,838.8, 6,931.1, 7,849.1
מיני Bacillus E 2,152.5, 2,224.9, 2,941.2, 3,180.1, 3,380.5, 4,302.0, 4,339.9, 4,705.3, 5,878.7, 6,356.6, 6,735.1, 6,756.2
מיני Bacillus F 3,308.6, 3,367.8, 3,567.5, 4,279.7, 4,489.2, 4,629.2, 4,727.9, 4,751.7, 5,067.7, 6,614.7, 6,919.7, 7,130.9
מיני Brevibacillus 2,133.3, 2,611.0, 4,263.3, 4,302.0, 4,859.3, 4,900.6, 5,080.2, 5,219.0, 5,847.6, 6,775.7, 7,529.4, 9,721.2
מיני Exiguobacterium 2,588.0, 3,053.3, 3,420.8, 3,695.5, 4,263.3, 5,133.1, 5,173.0, 5,248.8, 6,104.8, 6,605.3, 6,804.4, 6,838.8, 7,390.2
מיני Brevibacterium 3,053.3, 6,104.8, 6,146.5
מיני Kocuria 3,080.0, 4,366.6, 5,080.2, 5,163.8, 5,207.1, 5,892.8, 6,160.0, 6,197.5, 6,445.0, 7,433.7
Brevibacterium המינים B 3,222.8, 3,330.4, 3,367.8, 4,330.4, 4,350.4, 4,795.3, 4,995.7, 5,731.6, 6,445.0, 6735.1,7487.3
Aminobacter מינים 2,133.3, 2,562.4, 3,361.8, 3,410.4, 4,289.2, 4,629.2, 4,662.0, 4,869.8, 6,064.1, 6,221.0, 6,720.3, 6789.4,6818.8, 7,216.1, 7,447.4
מיני Comamonas 2,806.0, 2,921.4, 3,246.5, 4,350.4, 4,727.9, 5,607.5, 5,666.3, 6,221.0, 6,488.3, ​​7,317.5, 9,362.6
מיני Curvibacter 2,868.6, 3,453.2, 4,319.8, 5,133.1, 6,292.4, 6,903.4, 7,433.7
מיני Moraxella 3,011.2, 5,698.0, 6,720.3, 7,064.8, 7,366.6

2. שיעורי שולחן Peak (סמנים ביולוגיים פוטנציאליים) (Da) מוגדרים עבור כל מין.

איור משלים 1. ניתוח עיקרון רכיב (PCA) של ספקטרה ההמונית בהרמת e הטכנית לשכפל () ושיעורי השיא (B). צבעים קודדו כבאותם צבעים כמו בשימוש באיור 2.

איור משלים 2. איור של שיעורי שיא נבחרו על בסיס האשכולות דו-כיווניים. שיעורי שיא נתקל באותה התווית בצבע עם אותו הצבע.

איור משלים 3. תוצאות חוצה אימות של פרויקט זיהוי המבוסס על מאגרי המידע המותאם אישית בBioNumerics.

זיהוי 4. חיידק איור משלים המבוסס על התאמת שיא באמצעות מסדי נתונים מותאמים אישית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפגנה זו הראתה נהלים מפורטים של אפיון וזיהוי של חיידקים באמצעות MALDI-TOF MS ומסד נתונים מותאמים אישית. בהשוואה לשיטות מולקולריות מסורתיות, למשל, שיטות טביעת אצבע רצף 16S rDNA, מבוססות MS MALDI-TOF להקל זיהוי מהיר יותר של חיידקים שונים. בגלל חוסנה, בטכניקה זו נעשתה שימוש נרחב כדי לאפיין חיידקים, וירוסים, פטריות ושמרים מהסביבה ובהגדרות קליניות 1,14-16. יתר על כן, MALDI-TOF MS דווח להרשות לעצמם, ובמקרים מסוימים, ברזולוציה גבוהה הטקסונומית 1. לדוגמא, sp ב. A, B, D, ו- E, אם כי נוטה להתקבץ יחדיו (איור 2), היו ברור מופרדת והדמיון בין הספקטרום של sp B. שונה. היה פחות מ -80% (איור 2). בניגוד לכך, רצפי 16S rDNA של בידודים אלה היו גבוה דמיון, שלא ניתן הייתה להשתמש כדי לבדל מבודדים אלהברמת המין. רצפי 16S rDNA של sp ב. יש לי B ו- D דמיון 99% המבוססים על ניתוח יישור מרובה, בעוד שהרצפים של sp ב. A ו- E להראות 95% ו -96% דמיון, בהתאמה, לרצפים של sp ב. חריגי B ו- D. נצפו גם. לדוגמא, sp ב. C ו- F מקובצים מsp B. האחר. (איור 2). המראה של בידודים חריגים מצביע על כך שניתוח האשכולות של ספקטרה ההמונית לא בהכרח ליצור קשרי פילוגנטי. הסביבה שממנה מבודדת התקבלו גם עשוי להשפיע על אשכולות ספקטרה המוניים. לדוגמא, המינים B Brevibacterium ומיני Kocuria שבודדו מspeleothem הלח וsp ב. F אשר היה מבודד מטפטוף נטיפים נטה להתקבץ יחדיו (טבלה 1, איור 2), אך יש צורך במחקר נוסף כדי לבחון האם זה נצפה באוסף גדול יותר של Isolאטס.

טכניקה מבוססת ספרייה זו יש גם כמה מגבלות. אפיון מבוסס בדרך כלל על מסדי נתונים. מאגרי מידע מסחריים נוכחי מורכבים בעיקר מזני חיידקים, במיוחד פתוגניים אלה. מאגרי מידע המסחריים אלה שימושיים ביותר בהגדרות מעבדה מיקרוביולוגית קליניות. לאפיין מבודדים סביבתי, כמו גם וירוסים, פטריות ושמרים, מסדי נתונים מותאמים אישית צריכים להיות בנויים באמצעות אוספי מתח גדולים. הפרמטרים המשמשים בניתוחי המעקב עשויים גם צריכים להיות מותאמים כדי להגדיל את הרזולוציה הטקסונומית, במיוחד בתת-המין ורמות מתח. לדוגמא, S: N משמש לזיהוי שיא בהפגנה זו היה 10. ערך זה מתאים לזיהוי רמת מין, אבל לזיהוי רמת מתח, ערך זה ייתכן שיהיה הצורך הוריד. מאז פרמטרים עיבוד אלה, כמו גם עיבוד נתונים זרימות עבודה לעתים משתמש מוגדר בחבילות תוכנה רבות, למשל, ClinProTools וBionumerics, אופטימיזציה של ערכי פרמטרים ובחירה של זרימות עבודה מתאימות סביר להניח שתידרש כדי לייעל את ניתוח הנתונים. בהפגנה זו, פרמטרים התאמת שיא, ערכי סף המשמשים בפרויקט זיהוי, אימות וצלב כל נדרש אופטימיזציה כדי לשפר את שיעורי זיהוי נכונים. למצוא שיטה ו / או הליך כדי לייעל את הפרמטרים האלה הוא עניין רב למעבדה שלנו. לדוגמא, גישה אחת עלולה להיות כרוכה בעיצוב עצרת סטטיסטי, שבו השתמש לאחרונה כדי לייעל MALDI-TOF אוטומטי נתונים רכישה 17. יישומים עתידיים נוספים ושיפור של טביעת אצבע של חיידקים מבוססי MS MALDI-TOF כוללים בנייה זמינה באופן נרחב, מסדי נתונים גדולים יותר של חיידקים סביבתיים ו / או מיקרואורגניזמים שאינם בקטריאלי, כמו גם אפיון של תרבויות המעורבות 18 וקהילות חיידקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid ACROS Organics 163440050 ≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software Bruker Daltonics version 3.0
Bruker FlexAnalysis software Bruker Daltonics version 3.0
Bionumerics software Applied Maths version 7.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32, (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68, (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57, (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7, (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8, (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33, (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48, (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18, (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30, (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79, (2), 654-658 (2007).
  11. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4, (5), 732-742 (2009).
  12. Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55, (1), 40-46 (2012).
  13. Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80, (6), 2026-2034 (2008).
  14. Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36, (2), 379-387 (2013).
  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75, (11), 3314-3330 (2012).
  16. Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831, (4), 872-879 (2013).
  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9, (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48, (5), 1584-1591 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics