Раскрытие Незримым Игроки в океане - Руководство поле для химии воды и морской микробиологии

1Department of Biology, San Diego State University, 2Scripps Institution of Oceanography, University of California San Diego
Published 11/05/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Haas, A. F., Knowles, B., Lim, Y. W., McDole Somera, T., Kelly, L. W., Hatay, M., et al. Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology. J. Vis. Exp. (93), e52131, doi:10.3791/52131 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Здесь мы вводим ряд тщательно проверенных и хорошо стандартизированных протоколов исследований, адаптированных для использования в удаленных морских условиях. Протоколы отбора проб включают оценку ресурсов, имеющихся в микробного сообщества (растворенного органического углерода, твердых частиц органического вещества, неорганические питательные вещества), а также подробное описание вирусных и бактериальных сообществ (через прямые вирусных и микробных чисел, перечисление autofluorescent микробов, и Строительство вирусных и микробных метагеномов). Мы используем комбинацию методов, которые представляют собой дисперсную поле научных дисциплин, составляющих уже установленные протоколы и некоторые из самых последних методов, разработанных. Особенно метагеномных методы секвенирования, используемые для вирусной и бактериальной сообщества характеристик, были созданы лишь в последние годы, и, таким образом, по-прежнему подвергаются постоянному совершенствованию. Это привело к целому ряду проб и обработки образца процедур CurrenTLY в использовании. Набор методов, представленные здесь обеспечивает до даты подхода для сбора и обработки проб окружающей среды. Параметры рассмотрены с этими протоколами дают минимум на информации существенное для характеристики и понимания основных механизмов динамики вирусных и микробных сообществ. Это дает легко следовать по проведению комплексных обследований и обсуждает важные шаги и возможные подводные камни, имеющие отношение к каждой технике.

Introduction

Морские экосистемы подвергаются широком диапазоне возмущений, которые приводят к изменениям из питательной наличии в биомассе вершиной хищников. На протяжении последнего десятилетия, многочисленные исследования показали важность микробных сообществ в морских экосистемах 1-4. Очевидно, что изменения в бактериальной и вирусной сообщества тесно связаны с общей деградации морской среде 5. Эти изменения могут быть облегчена путем измененной геохимии в толще воды, таких, как наличие кислорода или углерода реминерализации 6,7. В результате взаимозависимости между макроорганизмов, химического состава воды и микробных петель обратной активности может ускорить темпы деградации экосистем 8.

В 1970-х и 80-х годов были сделаны многочисленные попытки разгадать биогеохимические циклы в морских экосистемах 9-11. Одной из главных проблем для этих ранних исследований было отсутствиестандартизированных подходов для измерения начисленные биогеохимические параметры. Хотя были протоколы, доступные, в первую очередь на морской питательных веществ 12,13, оценка динамики углерода и структура микробного сообщества были ограничены инструментов и методов, доступных. С сравнения методов СИПМО EqPac, Sharp и др. 14 предложил впервые надежным и стандартизированный протокол для оценки растворенного органического углерода (DOC) концентрации. В начале 2000-х годов аналитические задачи, чтобы определить ресурсы, доступные для микробного сообщества, таким образом, в значительной степени решены и подходов для характеристики микробных сообществ в контролируемых условиях культуры были созданы (см Делонг 15). Традиционные методы секвенирования в то время в основном полагались на культивируемых клоновых культур. В начале секвенирования генов окружающей природных образцов показало, однако, что большинство микробов биоразнообразия были пропущены cultivвания на основе методов 16. В 2002 году, Брейтбарт др. 17 используется Метод дробовика в первый раз, чтобы описать вирусной сообщество в пробах окружающей среды морской воды, устанавливающих метод определения последовательности всего генома некультурных морских вирусных сообществ.

В рамках существующих оценок микробных, вирусы остаются в частности в рамках изученной, как наиболее трудно культуры и им не хватает повсеместно консервативный маркер, такой как 16S рибосомальной РНК (рРНК) генов, как правило, используются для оценки разнообразия и сообщества профилирование. Метагеномных подход секвенирование предоставляет альтернативу культурно-зависимых и ген-направленных методов для анализа сложных вирусных сообществ. В то время как первые вирусные метагеномов, полученные от морской воды были упорядочены с помощью Sanger секвенирование 17, разработка технологий секвенирования следующего поколения и улучшенными молекулярными методами привело к быстрому росту метагеномных исследований 18 19-21.

Для дальнейшего существующих знаний о вирусных, микробных и биохимических функционирования водных экосистем, сравнивая наборов данных в различных системах по всему миру является существенным. Тем не менее, установленные протоколы были в основном разработаны для прибрежных сред с легко доступных лабораторных помещений. Таким образом, отсутствие стандартизированных методов полевых мешает эти сравнения между экосистемами. Здесь мы вводим тщательно протестированы и хорошо стандартизованы приспособления из состояния искусства исследовательских протоколов для использования в местах, удаленных местах. Эти методы, как было доказано успешными в нескольких исследованиях, охватывающих последнее десятилетие 5,22 и в настоящее время используется различными морских лабораторий, а также на NOAAОценка Риф и Программа мониторинга (RAMP) в течение всего Тихого океана 4. Протоколы отбора проб включают параметры воды химия (неорганические и органические концентрации углерода, концентрация неорганического питательных веществ), вирусной и микробной изобилие (прямые количество бактерий, прямые вирусные рассчитывает, и проточной цитометрии для оценки автотрофного против отношений гетеротрофов) и вирусной и микробной структура сообщества и метаболический потенциал через метагеномных анализа (обзор см рисунок 1). Результаты, полученные из способов, описанных здесь необходимы для того, чтобы выяснить ключевые биохимические фоновые параметры, необходимые для всестороннего характеризуют водных экосистем.

Protocol

1. Подготовка инструментов

  1. Подготовка установки фильтрации
    1. Приготовьте 5% кислоты (HCl) раствор соляной (0,5-0,6 м; добавить 250 мл 32-36% HCl до 4,75 л дистиллированной воды, чтобы сделать 5 л окончательного решения). Храните это решение в полиэтилена высокой плотности контейнера (HDPE) на срок до 2 недель.
    2. Оставьте все детали, которые будут в контакте с образцом (кроме фильтров) в течение 24 часов в 5% -ном растворе соляной кислоты, чтобы пиявки потенциальных растворенного органического углерода (DOC) загрязняющих веществ. После каждого события выборки промойте все детали и флеш линий с 30 мл 5% раствора HCl, чтобы не допустить загрязнения углерода (например, от паров бензина, масла, лодок, спрей от комаров).
    3. Хранить все элементы дискретизации, завернутые в предварительно сжигают алюминиевой фольги или не ограниченным до тех пор, чтобы непосредственно перед использованием.
    4. Precombust 25 мм GF / F фильтры, завернутые в алюминиевую фольгу в муфельной печи при температуре 550 ° С в течение 12 ч для испарения от весь углерод и хранить их в чистой, сухойне размещать до использования. Используйте кислоты мыть щипцы и стерильные, без порошкообразных перчатки для обработки precombusted фильтры на все времена.
  2. Получение вирусных метагенома отбора проб материалов
    1. Тщательно вымойте четыре 20 L разборные полиэтилен низкой плотности бутыли и четыре 20 L полиэтилена высокой плотности ведра и крышки с 10% отбеливателя.
    2. Впоследствии промыть все элементы 3x дистиллированной, а затем пробы воды и запечатать бутыли с концом.
    3. Фильтры Wash тангенциального потока (TFF) после каждого использования в соответствии со следующим протоколом, и чистый превентивно, если фильтр не использовался в течение последних 5 дней.
    4. Растворить 50 г NaOH в гранулах 5 л воды для стирки в ведре.
    5. Приложите влажную TFF к трубке и собрать в соответствии с рис.3.
    6. Запуск перистальтического насоса на ~ 30 оборотов в минуту без каких-либо противодавления, чтобы переместить некоторые из промывочного раствора NaOH через систему. После мытья течет из обратной линии, двигаться передачу мыть ведродля завершения циркуляцию раствора.
    7. Применение противодавление в системе путем размещения зажим на обратной линии ниже по потоку от TFF. Это заставит промывочного раствора из фильтрата линии. Чрезмерное время (5 мин), чтобы затопить пределами TFF и производить фильтрат свидетельствует о деградации TFF.
    8. Запуск системы до тех пор, весь раствор NaOH не в линиях. Затем снимите аэродинамического давления, запустите решение из системы и выбросить.
    9. Промыть TFF проточной водой при противодавлении до рН воды, текущей из обратных линий и фильтрата не является рН 7-8.
    10. Удаление трубки из перистальтического насоса и TFF. Reseal TFF для хранения. Убедитесь, что ПТФ остается влажным до следующего использования.

2. Сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время транспортировки все собранные образцы следует хранить хладнокровие (если это возможно 4 ° C) и не подвергаться воздействию прямых солнечных лучей, пока дальнейшей обработки.

  1. Выборкадля газа, питательных веществ, микроскопии, проточной цитометрии и микробных Метагеномика
    1. Возьмите две единицы Хатай Niskin за события выборки (в результате 4 л пробы воды). Откройте сосуды выборки непосредственно перед погружением (иначе попавший воздух будет препятствовать убыванию).
    2. В соответствующем месте, промыть внутреннюю поверхность сосуда для отбора проб с образцом воды, открыв оба конца и перемещение цилиндра вдоль полярной оси через воду.
    3. Возьмите образец и тщательно закройте контейнер выборки. Убедитесь, что сайт дискретизации выше по течению от лодки и водолазов, чтобы избежать загрязнения.
  2. Отбор проб для вирусных Метагеномика
    1. На сайте-мишени монтировать помпа на 20 л бутыли.
    2. Заполните бутыль с целью льяльных вход насоса в каждой целевой области и уплотнения бутыль с соответствующим концом.
    3. Соберите 4 бутыли нефильтрованного морской воды (все вместе 80 л) с каждого места отбора.

3. Sampподготовка ле

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс образцы в порядке, представленном здесь, начиная с DOC, чтобы минимизировать вероятность заражения. Используйте пудры перчатки для всей процедуры.

  1. Растворенного органического углерода (DOC)
    1. Крепление один из двух блоков с аликвотами Хатай Niskin в соответствующем пазу множества фильтрации. Подключите шланг на выходе, что приводит к соответствующему держателю фильтра. Подключите сжатый воздух (0,2 бар) трубки к блоку Хатай Niskin (рисунок 2).
    2. Промойте все линии с 100 мл пробы воды, прежде чем вставлять фильтры в фильтродержателями. Поместите 25 мм предварительно сгорает GF / F фильтр в держатель фильтра с помощью кислоты мыть щипцов. Промыть каждую бутылку DOC и колпачок 3 раза 20 мл с фильтром отбора проб воды.
    3. Заполните бутылку с 40 мл (~ 2/3 полностью) отбора проб воды. Соберите по крайней мере дубликатов проб DOC иметь резервную копию в случае возможного загрязнения или потери во время транспортировки.
    4. FБутылки для отбора проб reeze не в вертикальном положении при температуре от -20 ° С до анализа.
  2. Твердые Органическое вещество (POM)
    1. После того как образцы DOC были собраны продолжить фильтрацию до в общей сложности 500 мл не прошли GF / F фильтр, в том числе то, что прошло через время сбора образцов DOC.
    2. Отвинтите рядный держатель фильтра.
    3. Снимите фильтр для анализа POM, используя пинцет и место фильтр внутри квадрата заранее сжигается алюминиевой фольги, сложите верхняя сторона замкнулась в себе, и обернуть.
    4. Замораживание фильтры при -20 ° С для хранения, пока не подвергнут элементного и изотопного анализа.
  3. Неорганические Питательные вещества
    1. Поставьте трековых фильтр в каждом держателе фильтра 0,2 мкм. Повторно приложить кассеты фильтров.
    2. Промыть каждый 20 мл Пластиковая сцинтилляционных бутылку три раза отбора проб воды. Заполните каждую бутылку к плечу (~ 18 мл).
    3. Замораживание при -20 ° С до последующего анализа.
  4. Microscopу (SYBR Gold и DAPI)
    1. Сними держатель фильтра.
    2. Сбор 1 мл воды в каждом из двух микроцентрифужных пробирках.
    3. Добавить 66 мкл 32% параформальдегида в одном из аликвот (для последующего окрашивания SYBR Gold). Добавить 12 мкл 25% глутарового альдегида в соответствующий другой (для последующего окрашивания DAPI).
    4. Аккуратно перемешайте и дайте образцы "исправить" в течение не менее 15 мин при комнатной температуре в темноте.
  5. Проточной цитометрии
    1. Разместить поликарбонатный фильтр 8,0 мкм в одном из держателей фильтров, чтобы исключить мусор и большие эукариотические клетки.
    2. Передайте отбора проб воды до заполнения 2 криопробирки от каждого места отбора с 1 мл образца.
    3. Добавить 5 мкл 25% -ного глутарового альдегида в каждой криопробирку (конечная концентрация = 0,125%).
    4. Обратить флаконов смешать.
    5. Разрешить образец исправить в течение 15-30 мин при КТ. Не превышать 30 мин.
    6. Образцы Ледяная вспышка в жидком азоте.
    7. Магазин образцы при -80 ° С или в Liquid азота сухой грузоотправитель до анализа на проточной цитометрии.
  6. Микробная метагеномных Образец
    1. Удалить в фильтродержателями линии.
    2. Непосредственно крепление цилиндрический фильтр 0,22 мкм на соответствующей линии.
    3. Фильтр остальные пробы воды из обоих Хатай Niskin единиц из каждого сайта (на общую сумму 3-4 л на фильтр) через один фильтр.
    4. После фильтрации толкать оставшуюся воду из каждого фильтра с помощью чистой шприц 10 мл, заполненный воздухом.
    5. Поместите фильтр в оригинальной упаковке и запечатать пакет с лабораторной ленты.
    6. Хранить отдельно упакованные фильтры при температуре -20 ° C.
  7. Вирусный метагеномных Образец
    1. Трансфер образцы вирусов метагенома сразу в вымытых ведра для обеспечения не образец не будет потерян или загрязнены окружающей среды.
    2. Предварительный фильтр с использованием большой размер пор нейлоновую сетку (25-100 мкм), чтобы удалить мусор и клеточный материал до концентрации 19.
    3. Настройте TFF, как показано на рисунке 3, поместив доставки линию в образце ведро, и оставляя возврата и фильтрата линии, идущие в раковину.
    4. Включите перистальтического насоса и промыть линии с 1-2 л пробы воды.
    5. Поместите линию возврата в образце ведро, чтобы завершить цикл, добавить 0,7 бар противодавления.
    6. В то время как концентрации морской воды, долить водохранилище образец как уровень падает. Когда уровень воды падает ниже линии всасывания в ведре, передача концентрата в отбеливатель мыть, тройной промытой tripour стакан и продолжать концентрироваться.
    7. Если резервуар стакан пуст, удалить противодавление, увеличить скорость насоса и нажать весь образец через линии, восстановив ее в tripour.
    8. Пропустите концентрат через 0,45 мкм цилиндрических фильтров для удаления большинства бактерий в то время как не дискриминировать ни вирусных линий.
    9. Измените 0,45 мкм цилиндрические фильтры через каждые 150 мл. Соберите 0,45 мкм-филубито вирусный концентрат в 50 мл пробирки.
    10. Добавить 250 мкл хлороформа к каждому 50 мл аликвоты вирусной отфильтрованного концентрата для устранения остаточных бактерий. Invert, чтобы смешивать и хранить, в вертикальном положении при температуре 4 ° С до последующей обработки.
    11. Высушите фильтры 0,45 мкм и хранить их, как описано на этапах 3.6.5 и 3.6.6.

4. Обработка микроскопии образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Промыть фильтр башни с 10% хлорной последующим 95% этанола, чтобы предотвратить потенциальное пятно или биологические остатки между трасс. Образцы Процесс микроскоп в течение 1 часа и не подвергать пятна и окрашенных фильтров на свет, если это возможно.

  1. Крепление
    1. Добавить 100 мкл 10% аскорбиновой кислоты в 4,9 мл 1х PBS, и тщательно перемешать.
    2. Добавить 5 мл 100% глицерина, и тщательно перемешать.
    3. Фильтр монтировать с использованием 0,02 алюминия матрица мкм одноразовые шприцы фильтра, аликвоту и хранить при температуре -20 ° С.
  2. SYBRЗолото Окрашивание
    1. Пипетки 500 мкл аликвоты каждого образца фиксировали 2% окончательной концентрации параформальдегида в микроцентрифужных трубки.
    2. Добавить 0,5 мкл раствора 1,000x SYBR Gold, чтобы каждый из аликвот.
    3. Смешайте образец аккуратно и положил его в темноте в течение 10 мин.
    4. Разместите матрицу оксида алюминия фильтр 0,02 мкм с кольцевой опорной полипропилен кольца на каждой фильтра стенде вакуумной системы насоса и присоединить башен фильтр (рисунок 4). Убедитесь, что фильтр 0,02 мкм помещают на фильтр стенда пластиковой стороной вверх, так как эти фильтры имеют двойную пористость.
    5. С вакуумный насос выключен, добавьте 500 мкл образца окрашивали красителем SYBR, вместе с 2 мл 0,02 мкм фильтруют вируса свободной воды, чтобы обеспечить образец равномерно распределяется на фильтре.
    6. Включите вакуумный насос, чтобы создать отрицательное давление не более чем 1 бар, чтобы не повредить вирусы и микробы фильтруется.
    7. Разрешить весь образец пойтичерез.
    8. Использование щипцов (не та же пара, который используется для DOC), осторожно снимите каждый фильтр из фильтрующего башни, и передать тонкий задачу стереть обеспечить фильтр сухой.
    9. Пипеток 10 мкл горе на предметное стекло и поместите сухой фильтр, содержащий запятнанную образец на капли горе.
    10. Добавить 10 мкл крепление к верхней части каждого фильтра перед добавлением покровное.
    11. Аккуратно нажмите покровное вниз. Попробуйте устранить воздушные пузыри, если это возможно, и избежать боком движения покровного стекла.
    12. Место слайд в slidebox и хранить при температуре -20 ° C.
  3. DAPI окрашивание
    1. Разместите матрицу оксида алюминия фильтр 0,2 мкм с кольцевой опорной полипропилен кольца на каждом стенде фильтра и прикрепите башни фильтр.
    2. С вакуумный насос выключен, добавить 2 мл 0,02 мкм фильтрованной вируса свободной воды в каждой башне, используемой.
    3. Пипеток 1 мл глютаральдегиду фиксированной пробы в каждой башне, в результате чего общий объем Oе 3 мл в каждой башне фильтра.
    4. Включите вакуумный насос для создания отрицательного давления в течение не более чем 1 бар.
    5. Фильтр весь образец на матрице оксида алюминия 0,2 мкм фильтр.
    6. Осторожно снимите фильтр с фильтрующим башни с помощью щипцов (не то же самое пару, используемый для DOC).
    7. Поместите фильтр на 100 мкл капли раствора DAPI [25 мкг / мл] в чашку Петри, сохраняя фильтр правой стороной вверх и пусть образец пятно в течение 15 мин. Избегайте свет во время процесса окрашивания.
    8. После 15 мин, снять фильтр от пятна, передать его деликатной задачи салфетку, чтобы высушить и перенести к падению 100 мкл 0,02 мкм фильтруется вируса свободной воды, снова держа фильтр правой стороной вверх, чтобы смыть оставшийся DAPI пятно в течение 1 мин. Повторите эту мыть один раз.
    9. Крепление фильтра на предметном стекле микроскопа идентичный путь, как описано для образцов SYBR Gold.

5. ДНК Добыча

  1. Микробная метагеномных ДНК
    1. Оттепель цилиндрические фильтры, по крайней мере 20 минут при комнатной температуре.
    2. Удалите оставшееся морскую воду в фильтр, используя 10 мл шприц. Закрывают нижний конец цилиндрического фильтра с использованием беленой и обрабатывали в автоклаве колпачок.
    3. Для каждого фильтра, смешать 360 мкл t1 "до лизиса" буфера и 50 мкл протеиназы К, а затем пипеткой смесь в фильтре. Крышка открытый конец.
    4. Выдержите реакцию лизиса во вращающейся печи O / N (или, по крайней мере 2 ч) при температуре 55 ° С.
    5. Снимите один из крышки и добавить 200 мкл B3 "лизис" буфер в фильтр на образец предварительно лизирующего. Повторно крышкой фильтра и инкубировать смеси во вращающейся печи в течение 10-20 мин при температуре 70 ° С.
    6. Выписка весь объем из цилиндрического фильтра, используя 3 мл шприц, высасывая жидкость с фильтром с ног на голову.
    7. Извергните лизису образец в новой пробирке, и добавить 200 мкл 100% этанола.
    8. Все хорошо перемешать, загрузить весь образец на спинеколонка, и продолжить в соответствии с инструкциями протоколом производителя.
    9. Количественная ДНК с использованием флуоресцентного анализа на основе.
  2. Лодка Вирусный Метагеномика
    1. Очищающая-обогатительный фаговых частиц (редактировался Тербер др. 19)
      1. Растворите CsCl в морской воде, чтобы получить растворы 1,7 г / мл, 1,5 мкг / мл, 1,35 мкг / мл, 1,2 мкг / мл (откалиброван путем взвешивания 1 мл раствора). Фильтр каждую фракцию с 0,02 мкм фильтр перед использованием.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что плотность каждой фракции с точностью до трех значащих цифр, прежде чем использовать решения и фильтровать все решения с фильтром 0,02 мкм перед использованием. Использование морской воды или морской воды, насыщенного CsCl, чтобы снизить или увеличить плотность, соответственно.
      2. Сделайте микроскопа от 1 мл в сочетании реагентов, как описано в разделе 4.2, чтобы гарантировать, что все реагенты лишены вирусов, прежде чем приступить.
      3. Добавить 9 г CsCl с 45 мл вирусного концентрата TFFОкончательный плотность 1,12 г / мл. Охладите при настройке ступенчатый градиент CsCl.
      4. Начиная с г / мл раствора 1,7 последовательно добавляют 1 мл каждого последовательно менее плотная фракция медленно в каждую пробирку с помощью серологических пипеток. Отметить уровень каждого отдельного мениска и убедиться, что pycnoclines между фракциями не нарушается. Для более подробной информации см сопроводительном документе (Лим и др. 2014).
      5. С серологической пипетки нагрузке 7,5 мл образца в каждом из 6 пробирок и центрифуге при 83000 х г ~, 4 ° C в течение 2 часов.
      6. Не нарушая градиенты плотности разгрузить ротор и пробить трубу чуть ниже ранее отмеченной 1,5 г / мл плотности слоя (рисунок 5) с 18 G иглы на 3 мл шприц. Откачать 1,5 мл очищенной VLPs и перейти на новую пробирку микроцентрифуги. Повторите эти действия для всех образцов.
      7. Добавить 0,2 объема хлороформа, очищенных VLP, смешайте энергично, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
      8. Добавить 150 &# 181; л буфера 10х ДНКазы к каждой трубки микроцентрифужных.
      9. Спин при 16000 мкг в течение 5 мин, и собрать водную фазу. Если хлороформ не агрегирует в нижней части трубки микроцентрифужных, добавить больше ДНКазы буфер, перемешать и повторить.
      10. Добавить ДНКазы I (конечная концентрация = 2,5 ед / мкл) и инкубировали при 37 ° С в течение 2 ч, затем инактивации ДНКазы активность путем инкубации при 65 ° С в течение 15 мин.
    2. ДНК Извлечение из вирусных частиц (ВПЧ)
      1. Равномерно бассейн очищенные VLPs из каждого образца в двух очищенных и автоклавного Oak Ridge труб.
      2. Добавить 0,1 объема 2 М Трис-HCl (рН 8,5) с 0,2 М ЭДТА, 0,01 объема 0,5 М ЭДТА, 1 объем формамид, 10 мкл гликогена (10 мг / мл). Тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
      3. Ссылаясь на новом томе, добавить 2 тома RT 100% этанола. Смешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение более чем 30 мин.
      4. Осадок ДНК, крутя трубы Oak Ridge в 17200 мкг в течение 60 мин, при 4 & #176; С.
      5. Удалить супернатант. Промыть осадка ДНК дважды охлажденным на льду 70% -ного этанола с использованием серологических пипеток.
      6. Удалить все этанол (кратко повторно спиннинг при необходимости), накрыть крышкой, и дайте таблетку до воздушно-сухого при комнатной температуре в течение> 15 мин.
      7. Ресуспендируют гранул ДНК> 15 мин в 567 мкл ТЕ-буфера 1X (рН 8,0). Перенесите 567 мкл ресуспендированной ДНК в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
      8. Добавить 30 мкл 10% SDS (предварительно теплой при 65 ° С перед использованием) и 3 мкл протеиназы К (20 мкг / мл), тщательно перемешать и выдержать в течение 1 часа при 56 ° С.
      9. Добавить 100 мкл 5 М NaCl и тщательно перемешать. Добавить 80 мкл подогретого раствора СТАВ NaCl, вихря, и инкубируют в течение 10 мин при 65 ° С.
      10. Добавить 0,2 части объемом хлороформа, вихря, и спина при 16000 мкг в течение 2 мин. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
      11. Добавить равный объем фенола хлороформ изоамилового 25: 24: 1 раствор, вихревое смешивать,и вращаются на 16000 мкг в течение 2 мин. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
      12. Добавить равный объем хлороформа, вихря, и спина при 16000 х г в течение 2 мин. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
      13. Добавить 0,7 объема изопропанола, фракции супернатанта и инкубировать при температуре -20 ° С в течение по крайней мере 30 мин, чтобы осадить ДНК.
      14. Гранул ДНК центрифугированием при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Отбирают пипеткой супернатант и осадок мыть два раза с 500 мкл охлажденного льдом 70% этанола.
      15. Спин при 16000 х г и удалить оставшуюся этанола из трубки. Воздушно-сухой осадок в течение 15 мин.
      16. Осадок Ресуспендируют ДНК с 50 мкл буфера для элюции (5 мМ Трис, рН 7,5) или трис-ЭДТА, рН 8,0 в течение не менее 5 мин при комнатной температуре.
      17. Количественная ДНК с использованием высокой чувствительности флуоресценции на основе анализа.

Representative Results

Микроскопия

Образцы микроскопия может и должна быть проанализирована немедленно, чтобы обеспечить их желаемого качества. Для измерения численности и распределения по размерам бактериальной сообщества, DAPI слайды будут рассмотрены эпифлуоресцентной микроскопии (возбуждения / испускания: 358/461 нм, см McDole др 2012). (Рисунок 6А). Количество клеток и размеры могут быть собраны с помощью обработки изображений (например, ImagePro или ImageJ). От объемов измерений длины и ширины ячейки (V) являются производными помощью предположения о том, что все клетки имеют форму цилиндров с полусферическими крышками, используя следующее уравнение:

V = π / 4 × ш 2 (L - W / 3)

где L является длина и вес является ширина каждой ячейки 23,4. Микробная биомасса может быть оценена с помощью ранее установленного размера зависит от отношения FOг морских микробные сообщества 24. Вообще морские бактерии варьируются по длине от 0,1-4 мкм, но идти до ~ 8 мкм в некоторых местах.

В то время как фильтры (0,2 мкм) окрашивали DAPI с покажут только бактерии, фильтры, используемые для SYBR Gold пятна (0,02 мкм) содержат бактерии и вирусы. Измерение обилие вирусов следует тот же протокол, что и для микробов, однако возбуждение 325-375 нм будет использоваться и максимум излучения находится в 537 нм (рис 6В).

В целях получения количественных данных объем выборки может потребоваться корректировка в зависимости от вирусной изобилии в исходном образце. Правильный объем для фильтрации лучше всего определяется эмпирически для данного водоема. Примеры микрофотографии, содержащих образцы с различной вирусной концентрации показаны на рисунке 7.

Результаты предыдущих исследований показывают, что вирус к МикробКоэффициенты (VMR) обычно находится в диапазоне от 1 до 50 в водных системах 25-29, и в пределах от 3 ​​до 20, в среднем примерно 6 в систем коралловых рифов (Knowles неопубликованные данные).

Проточной цитометрии

В дополнение к пунктам прямых и размера оценки микробного сообщества, оценки коэффициента автотрофных к гетеротрофных микроорганизмов через проточной цитометрии дополнительно могут быть извлечены из собранных образцов (образцовое проточной цитометрии выходе данной на рисунке 8). Чтобы определить общее количество клеток бактерий, образцы окрашивали красителем SYBR Green I и фотоэлектронный умножитель с 530/30 полосовой фильтр используется для обнаружения. Канал для хлорофилла (спина к спине LP зеркал результате в диапазоне 675-735 нм) и phycoerytherin (585/42 полосового фильтра) используется для подсчета численности автотрофы в неокрашенных образцов. Для определения численности гетеротрофных микробов, автотрофные считает от невычисленнымиокрашенных часть затем вычитаются из SYBR-окрашенных общего количества (McDole и др., представленной).

Вирусные Метагеномика

Вирусный Метагеномика использует культуру независимый молекулярную подход к вирусной экологии, используя общую информацию геномной последовательности, чтобы определить структуру и функции сообщества. Метагеномика был продвижения нашего понимания сложности и разнообразия вирусных сообществ на местном 17 до глобальных масштабов 30. Недавнее развитие широкого спектра биоинформатики инструментов для анализа вирусных метагеномных данных снизилась вычислительные узкие, что позволяет применять более комплексный взгляд на часть virosphere через призму Метагеномика.

Методы, представленные здесь выделить выделение и обогащение вирусных частиц из морской воды с использованием комбинации предварительной фильтрации с большим размером пор нейлоновой сеткой для удаления мусора и клеточный материал, концентрациюОбразцы с TFF (фиг.3) и последующей фильтрации 0,45 мкм для удаления более крупных клеток. Этот метод дает примерно в 100 раз концентрированный образец (рис 5B-5E), что позволяет нам выполнять последующие процессы в меньших объемах. Для того чтобы предотвратить рост любых оставшихся микробных клеток в вирусном лизата и, следовательно, изменения в вирусный избытка образца в течение длительного времени прохождения между полевой станции и лаборатории, хлороформ часто добавляют до конечной концентрации 2% для хранения. После выделения и очистки VLPs, эпифлуоресцентной микроскопия с красителями нуклеиновых кислот, таких как SYBR Gold используются для проверки наличия и чистоты вирусных частиц (Цифры 5B-5E).

Здесь мы представляем две вирусные метагеномов от Южного острова Line кораллового рифа, в частности, Старбак (STAR7) и тысячелетия (CAR9; ранее известный как Кэролайн) островов. Общий объем 120 л СэмаPLE вода была собрана из каждого участка на глубине 10 метров и обрабатывают, как описано в разделе 3.7 и 5.2. В VLP, очищают от хлорида цезия центрифугированием в градиенте были 3,3 х 10 8 частиц / мл для CAR9 (рисунок 5D) и 2,9 · 10 9 частиц на мл в течение STAR7 как проверено в соответствии со способом, описанным в пункте 4 (фиг.5В). Общее количество ДНК, выделенной из этих образцов были примерно 400 нг основан на измерении NanoDrop. ДНК усиливается с помощью Phi29 полимеразы и секвенировали по окружающей геномики основной комплекс в 2011 году характеристики данных последовательности представлена ​​в таблице 1. На основании подобия поисков с использованием существующих баз данных, большинство (> 70%) из последовательностей часто заканчивали неохарактеризованными, т.е., неизвестные истоки и функции. Аналогичным образом, два viromes, представленные здесь представлены более чем 97% от неизвестных последовательностей. В результате, не-В базезависит анализ был использован для анализа и открыли новую руку исследовательской возможность на «темной материи» в вирусные Метагеномика (Seguritan др. в печати).

Микробная Метагеномика

Анализ микробных метагеномов позволяет для характеристики настоящего микробного сообщества и функциональное описание этих общин. Примеры включают оценки наличия патогенов и вирулентности 5,22 или сравнений между изменениями в структуре macrobial сообщества или доступных питательных веществ и обилия видов и их доминирующих метаболических путей (рис 9; Келли и др 2014)..

Химический состав воды

Параметры химического состава воды обычно занимает обширную аналитическую обработку для создания желаемого данных; Образцы для анализа DOC будет измеряться с помощью высокотемпературного каталитического окисления 31,32, частиц органического вещества (POM) с помощью изотопной масс-спектрометрии в сочетании с элементарной анализатора 33-35, и неорганических веществ путем инъекций Flow Analysis 36,12,37. После успешного завершения всех анализов, информация, как показано в таблице 1 будет доступна в качестве дополнения к характеристика микробного и вирусного населения. Эта информация может быть подарили стабильных изотопов органического углерода и азота образцов (см Хаас и др. 35) и соотношения между автотрофными и гетеротрофов (McDole др. Представили).

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор методов, описанных в разделе протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой FIGUповторно.

Рисунок 2
Рисунок 2. Пример установки переработки установка. Установка фильтрации представил здесь (схематическое изображение слева, реальную картину правую панель) не обязательно требуется для создания образцов, но значительно ускорить процесс. Установка состоит из задней панели, на которых подразделения Хатай Niskin (1) смонтированы. На выходе должна быть обращена вниз, Хатай Niskin блоки соединены с силиконовой трубки с в режиме онлайн фильтродержателями (2). Они позволяют пройти пробы воды через соответствующий фильтр во флаконы для отбора проб HDPE (3), установленный прямо под ним. Процесс фильтрации ускоряется через сжатого воздуха (4), который и регулируется с помощью манометра (5). Переполнение бассейна предотвращает разлив воды во время изменять из HDPE флаконах или POM фильтрации. Пожалуйста,Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Тангенциальное фильтр поток линейка (модифицированный из Тербер др. 19). Нейлоновую сетку фильтруют образец вода подается из резервуара (1) с помощью перистальтического насоса (2), чтобы фильтр тангенциального потока (3). Пробы воды возвращается в резервуар (1) вдоль обратной линии (4) при отсутствии противодавления. Когда противодавление применяется через хомутом (5) на обратной линии, вода проходит через фильтр и отбрасывается или доставлены фильтрата резервуара (6). Образец воды заменяется, как он сосредоточен вне фильтрата линию, пока вся проба воды не сосредоточена в линии труб.

Рисунок 4
Рисунок 4. Микроскоп установки фильтрации слайд.Для равномерного распределения DAPI и SYBR Gold окрашенных образцов на соответствующей матрицы оксида алюминия фильтра (1), фильтры должны быть помещены в башне между фильтра (2) и ствола фильтрации коллектора и фиксируется с помощью зажима (4). Давление регулируется вакуум (5) будет ускорить процесс фильтрации (схематическое изображение сверху, фактическое изображение нижней панели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Очистка и концентрирование фаговых частиц. В общей сложности 1 мл каждого цезия плотности хлорида градиента слой поверх друг друга до ведущей предварительно обработанного образца (А). Каждый слой должен быть помечен снаружи трубки, чтобы облегчить извлечение после ультрацентрифугирования. Красные метки стрелками, где труба будет пронзили к экстракта VLP фракции. (BE) Микрофотографии вирусных концентратов: эпифлуоресцентной микрофотографии 0,45 мкм-отфильтрованных представительных вирусных концентратов STAR7 (B) и CAR9 (D). Крупные частицы в том числе бактериальных клеток были видны от 0,45 мкм фильтратов из обоих STAR7 (В) и CAR9 (D) образцов, в то время как только ВПЧ (белые стрелки) остаются после градиента хлорида цезия ультрацентрифугирования; Звезда 7 (C) и CAR9 (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Пример DAPI и SYBR Gold анализ микрофотография. Скриншот из анализа (А) DAPI и (B) SYBR Gold окрашивали например слайд. (A) Длина и ширина (мкм) все выделенные частицы(= Микробы) могут быть оценены с помощью программы обработки изображений. Обратите внимание на агрегацию в центре изображения. Эти кластеры должны быть исключены из последующего анализа. (B) Во время анализа вирусов и бактерий необходимо Binned по пороговыми значениями размера в ВПЧ и диапазонах сотовой размер (VLP красный, сотовая зеленый). Обратите внимание, что, как правило, некоторые слабые ВПЧ Без рубрики соответствующим программы обработки изображений. Эти ВПЧ, появляющиеся как слабые белые точки должны быть вручную пересчитать и добавлены автоматизированных вирусных пунктам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Концентрации SYBR Gold окрашенных образцов. Микрофотографии 0,02 глинозема матрицы фильтра, содержащего различные количества SYBR окрашенных образцов вирусов. Группа показывает AFМСДЭНИ содержащий подходящее количество морской воды фильтрованной, в то время как концентрация на фильтре, показанные в B являются слишком высокими и в C слишком низкая для надежных пунктам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8
Рисунок 8. Результаты анализа проточной цитометрии выходе образца рифов воды. Панель (А) показывает воду молекулярную класса только с желто-зеленый флуоресцентный микросфер (0,75 мкм) используется для проверки минимальное фон с установок прибора. Панель (B) изображает выход образца риф воды перспективе с идентичными настройками и макет, как в A. Заметим, что шарики еще можно увидеть в том же месте, вместе с несколькими популяциями автотрофы. (C) (В), используемого для резервного ворота поток цитометр, ориентации Sybr положительные события (автотрофные + гетеротрофное счет) и минимизации фона. (D) репрезентативная выборка риф-вода окрашивали SYBR Green I. Использование стробирования создана в (С), суммарного количества микробов были получены, и гетеротрофные и автотрофные микроорганизмы разбивается хлорофилла автофлуоресценции (см McDole др. 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9
Рисунок 9. Пример микробных данных метагенома. Узоры между микробным данных метагеномных последовательности и сайта зависимых переменных. Здесь, относительное обилие Synechococcus Pelagibacter SPP. не было (слева панели). Метаболический путь для конъюгативного переноса положительно коррелировала с концентрацией нитратов, в то время как метаболический путь для репарации ДНК согласуется между всеми метагеномов (правая панели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Звезда 7 CAR9
Общее количество Читает 939311 591600
Количество препроцессированный Читает 579664 360246
Среднее последовательности длины (б.п.) 395 ± 131 451 ± 159
Аннотированные Последовательности (%) 42218 (7.3%) 9117 (2,5%)
Неизвестный (%) 537446 (92,7%) 351129 (97,5%)

Таблица 1. Характеристики данных двух viromes генерируемых из южных островов Лайн, Старбак и тысячелетия. Степень аннотации основана на блат с помощью сервера MG-Раст.

Таблица 2
Таблица 2. Типичные результаты, показывающие данные с различных сайтов в течение одного экспедиции. В здесь оцениваются параметры включают в себя измерения химического состава воды в паре с микробной и вирусной численности. В таблице также содержит имена файлов, относящихся к соответствующим метагеномных данных для каждого места отбора проб. Концентрации углерода и неорганических питательных веществ приведены в мкмоль / л. Пожалуйста,Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблице.

Discussion

Методы, представленные здесь будет служить инструментом для создания комплексной оценки вирусных и микробных динамики в водных экосистемах. Они предназначены для количественного определения стоящего запас органических и неорганических ресурсов, имеющихся в микробных сообществ и охарактеризовать состав настоящего вирусного и микробного сообщества. Рядом с количественной вирусной изобилие и микробного численность и биомасса, информация геномная последовательность показывает их структуру и функцию сообщества. Все методы были разработаны или модифицированы для обеспечения применения в местах удаленных местах. Однако отсутствие контролируемых условиях лаборатории по сути создает некоторый потенциал для ошибок. Здесь мы обсуждаем некоторые оговорки, связанные с каждой из оцениваемых параметров. Рядом с потенциалом загрязнения во время обработки образца некоторые из параметров, также дают возможности для ошибки в аналитическом процессе.

Растворенного органического углерода

Загрязнение углерода может произойти во время процедур отбора проб (дискретизации ниже по течению, или в непосредственной близости от лодки или водолаза), во время подготовки образца (загрязнение оборудования или случайного обработки), и даже при хранении образца (другие образцы в морозильную камеру, содержащую органический растворители / летучие вещества). Чтобы избежать различных источников загрязнения поведения как несколько шагов обработки, как это возможно, так как каждый образец переселение ставит дополнительный источник загрязнения. Образец не должен войти в контакт с любым пунктом не кислота промывают или сожженного. Наконец, обозначающий морозильник для хранения исключительно для образцов, не содержащих летучих органических веществ обеспечит целостность образцов при длительных сроках хранения. Если образцы не могут быть заморожены в течение длительного подкисления период путешествия образцов DOC с концентрированной соляной кислоты (как описано 38-41) может быть применимо альтернатива. Для проверки точности измерений DOC консенсус справочные материалы должны быть использованы обллярно во время измерения DOC работает. Особенно глубоко морской воды (> 2000 м) ссылки ценны в оценке эффективности работы аналитической машины, как это очень стабилен в своей DOC содержания 42.

Твердые Органическое вещество

В дополнение к уходу органические загрязнения углерода, выборка POM требует особого внимания для обеспечения точности отфильтрованного объема. Если целевой объем 500 мл должны отклоняться для любого потенциального причине это должно быть отмечено, соотнести количество POM захваченный на фильтре до фильтрата из которого он был получен.

Неорганические Питательные вещества

Как с отбором проб органического углерода, внимание должно быть уделено возможному питательной загрязнения образца, генерируемого различными источниками, как лодки или сброса сточных вод 12. Фильтры, используемые для отбора проб органического углерода с номинальным размером пор 0,8 мкм, не может исключать все микробной биомассы и шУальд быть изменена до 0,2 мкм фильтров для этой стадии фильтрации. Кроме того, пределы обнаружения создать проблему с питательными образцов; особенно в олиготрофных поверхности воды вокруг многих местах коралловых рифов (например, Cotner соавт. 43). Пределы обнаружения примерно около 0,1, 0,2, и 0,1 мкмоль / л для аммония, нитратов и нитритов, и орто-фосфата соответственно (см 36,12,37)

Микроскопия

Кроме изменений в концентрации анализа образцы изображений с микроскопии слайдов дополнительно дает возможность ошибок. Например, изображения могут быть не в фокусе, в некоторых областях поля зрения, и в центре внимания в других. В качестве матрицы оксида алюминия фильтр высокой чистоты является очень жесткой тип фильтра, любой мусор под фильтр может вызвать весь фильтр, чтобы сидеть на углом к ​​слайда. В результате, изображения могут быть последовательно из фокуса в различных частях поля зрения для данного фильтра, повторноНЕВЗИРАЯ выравнивания микроскопа. Повторный монтаж фильтров, обеспечивая обратную сторону фильтра чист, может улучшить это, если это наблюдается. Кроме того, в некоторых случаях может быть два фокальных плоскостей, в которых можно найти вирусов и микробов. Это является результатом окрашенных объектов становятся отдельно от фильтра на монтаж, а плавучих до нижней части покровным стеклом, который может сделать подсчитывает ненадежным. Поэтому всегда рекомендуется проверить качество образцов в процессе.

Проточной цитометрии

Как и в случае образцов микроскопии, может быть естественным различия между проточной цитометрии образцов, которые требуют корректировки аналитического процесса. Например, в зависимости от чувствительности прибора, тускло флуоресцирующие Prochlorococcus клетки могут быть ниже уровня шума и не будет количественно. Бусы служить контроля внутреннего образца (например, чтобы подтвердить, что соответственно прибора поonse для флуоресцентных сигналов согласуется со дня на день (и остается стабильным в течение самого перспективе). Если к образцу добавляли в известных концентрациях, они могут также служить в качестве внутреннего контроля для проверки объема образца пробег. Тем не менее, рекомендуется, чтобы всегда работать аликвоту предварительно замороженного "стандартной" морской воды, что образец оттаивают и окрашивали вместе с образцами интерес, чтобы обеспечить дополнительный контроль за биологической пробе обработки между 96-луночные пластины трасс. В зависимости от места, образцы морской воды может значительно отличаться друг от друга. Сортировка "представитель" населения, а затем просмотр под epifluorescent микроскопом (ЭМ) может быть хорошим способом, чтобы быстро проверить популяций фитопланктона, как ни Synechococcus зр., Или фотосинтезирующих эукариот. Prochlorococcus клетки, как правило, не видны под EM, потому что они исчезают слишком быстро. В дополнение к хлорофилл а, Synechococcus Sp. Также содержать рНotopigment phycoeurythrin (PE), который излучает свет при более коротких длинах волн (540-630 нм), чем хлорофилла А (660-700 нм). Когда Synechococcus клетки возбуждаются с синей / зеленой света (470-490 нм), они появятся золотой, если рассматривать под фильтром твердых, который удаляет все длины волн света ниже 510 нм. Для сравнения, эукариотические фракция будет выглядеть красный, при возбуждении с одной и той же длины волны света.

Вирусные Метагеномика

Важно отметить, что процесс концентрации VLP и хранения влияет на восстановленный сообщества. Вирусный потери частиц может происходить на каждом шагу в процессе, и таким образом, выбор вирусных очистки и обогащения протоколов может в конечном итоге повлиять на наблюдаемое таксономического состава и разнообразие полученных вирусных метагеномов 44,45,18. Концентрация образцов может быть сделано с помощью TFF 19 или химической основе флокуляции 20. В химической основе подхода, месторожде-раторов заряженные ионы железа связывают естественно отрицательно заряженные вирусные частицы, образующие крупные (> 8 мкм) железа-вирусная комплексы, которые выпадают хлопьями из раствора и могут быть восстановлены с помощью 8 мкм фильтры. Впоследствии железо хелатные от вирусных частиц и повторно растворяют с помощью магний, аскорбиновую кислоту, и ЭДТА, оставляя концентрированные вирусные частицы для экстракции нуклеиновой кислоты 20. После сравнения этих двух современных методов, мы пришли к выводу, что метод хлорид железа меньше времени, чем TFF ​​концентрации вируса, но может дать некоторые оговорки. Мы обнаружили, что диссоциации и растворению железа вирусный требуется в два раза более концентрированный раствор магний-аскорбиновой кислоты-ЭДТА, чем сообщалось 20 для того, чтобы приступить растворение перед деградирует аскорбиновой кислоты. Помимо этого вопроса, протокол очищает вирусные частицы по размерам-фракционирования, удаление микробных загрязнений, используя 0,2 мкм фильтрация. Большие вирусы не проходят через фильтэ (например, Ян и др. 46) и, таким образом, не может быть обнаружен в метагенома, в то время как некоторые бактерии (McDole, неопубликованные данные). Это приводит к бактериальному загрязнению при дискриминации крупных вирусов.

Это конкретный вопрос, однако, также имеет отношение к удалению микробов в связи с концентрацией TFF. Как лечение хлороформ, как было показано, чтобы удалить хлороформ-чувствительные вирусы с внешними липидные мембраны 47 некоторые исследования показывают, что 0,22 мкм фильтрации может использоваться для удаления большинства бактерий. Следует также отметить, что представленный метод в основном ориентирована бактериофаг, самый распространенный носитель генетического материала в морской среде. Потому фага, как правило, полагают, не обычно содержат липиды 48 они более устойчивы к лечению хлороформ. Насколько нам известно, метод "универсальные" не существует на сегодняшний день. Метод, представленный здесь, взяты из НУГ поле опыт за последние 10 лет в различных морских условиях, охватывающих тропических до арктических систем.

Микробная Метагеномика

Конструкция метагеномных библиотек для микробов (т.е., бактерий и архебактерий) является более простым, чем вирусных метагеномов как легче произвести минимальные концентрации ДНК библиотеки, необходимые для подготовки. Линкерные усиления дробовик библиотеки (LASLs) 17,49,50 и весь геном усиления, основанные на амплификации множественного смещения (MDA) являются двумя наиболее часто используемые методы получения достаточной ДНК для секвенирования. Использование MDA получить более высокие концентрации ДНК в микробных метагеномов иногда необходимо. Это, однако, может вызвать артефакты в последовательности данных, например, overamplification динофлагеллятных minicircles. Методы MDA, как известно, преимущественно усиливать одноцепочечной и кольцевую ДНК, в результате чего без количественных результатов 51,52, Оптимизированные LASLs подходить таким образом, 50 может служит лучшей альтернативой в усилении как микробные и вирусные метагеномных ДНК для секвенирования. Важно отметить, что подход LASLs имеет несколько шагов, требуется сложное оборудование, и ограничивается шаблонов дцДНК. Кроме того, набор для выделения ДНК ткани, как было показано, чтобы извлечь ДНК из грамположительных и грамотрицательных фил, но это не было проверено, чтобы эффективно лизируют непокорных микробной таксоны или связанных с ними структур (например, определенное археи, эндоспоры, или грибковых спор) , Поэтому биение шаг шарик может быть необходимо для получения ДНК из отдельных микробов.

Эти комплексные оценки приведет к лучшему пониманию вирусной и микробной функционирования экосистем. Хотя несколько исследований предприняли усилия, чтобы оценить все предложенные параметры, многие из них были расследовании выбранные. Нельсон и др. 53 предложили связи betwееп конкретных риф обитания и истощение в обоих DOC и бактериопланктона концентраций по отношению к акватории. Эти изменения концентрации сопровождались различными дифференциации бактериопланктона общин. Динсдейл др. 5 показано, что увеличение антропогенного воздействия сопровождалось 10х более высоких содержаний микробных клеток и вирусоподобных частиц. Микробных сообществ в морских водах, окружающих населенных островов также были большие фракции гетеротрофов и потенциальных патогенов 5. Наконец McDole др. 4 показали, вводя счет microbialization, что деятельность человека переходят энергии для микробов, в счет macrobes. Эти исследования, ориентированные на конкретных микробных и химического состава воды параметров, создание новых понимание биохимической структуре морских экосистем. Сочетание традиционных данных проводимого мониторинга экосистемы - как температуры и рН ценностей, биомассы рыб и Diversiти, бентоса крышка, или воздействие антропогенного воздействия - с химическим составом воды и микробных оценок, вероятно, приведет к более чувствительных усилий по мониторингу окружающей среды, что может привести к более конкретно целенаправленных усилий по сохранению.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) Figure 1
Filtration setup Figure 1
32-36% Hydrochloric acid (HCl) Fisher Sci A508-212
High-density polyethylene (HDPE) container e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid
Combustion oven (550 °C)
60 ml HDPE vials  Fisher Sci 02-896-2B
25 mm GF/F filter Fisher Sci 09-874-64
Forceps  Fisher Sci XX62-000-06
Sterile, non-powdered gloves Fisher Sci 19-170-010B
Bilge pump  e.g., Thirsty Mate 124PF
20 L collapsible low-density polyethylene carboy e.g., Reliance Fold A Carrier II
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges Amersham CFP-2-E-9A
Platinum-cured silicon tubing for TFF Cole Parmer 96440-82
Hose clamps Cole Parmer P-68007-23
Peristaltic pump Cole Parmer EW-77410-10
Sodium hydroxide (NaOH) solution Electron Microscopy Sciences 21162
0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-61
8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-57
0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVGP01050
0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVHV010RS
Synthetic nylon mesh Sefar 03-125-37
20 ml Plastic scintillation bottle Fisher Sci 03-341-72C
Clean bucket (10-20 L)
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15714
25% Glutaraldehyde Electron Microscopy Science 16220
Liquid nitrogen
0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring  Fisher Sci 6809-6002
0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring Fisher Sci 6809-6022
10,000x SYBR Gold nucleic acid stain Invitrogen S11494
DAPI solution 25 µg/ml Invitrogen D1306
Molecular grade water sigma aldrich W-4502
Ascorbic acid Fisher Sci BP351-500
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Sci BP399-500
Glycerol Fisher Sci G31-500
Microscope slide Fisher Sci 12-550-123
Coverslip Fisher Sci 12-548-5M
Delicate task wipe  Fisher Sci 06-666A
Slide station with vacuum pump Figure 3
DNA extraction kit Macherey-Nagel 740952.1 Nucleospin tissue kit
Proteinase K (20 mg/ml) Lifetechnologies AM2546
200-proof Ethanol Electron Microscopy Sciences 15058
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler  Cole Parmer EW-45503-88
Cesium chloride (CsCl) Fisher Sci bp1595-500
60 ml Syringe Fisher Sci 13-6898
0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter Fisher Sci O992613
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Ultra-swinging bucket rotor Beckman Coulter 333790 SW41 Ti Rotor 
DNase I (100 units/µl) Calbiochem 260913
0.5 M EDTA Fisher Sci BP2482-500
Formamide Fisher Sci BP228-100
Glycogen sigma aldrich G-1767
1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 Fisher Sci BP2473-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Sci 02674-25
20 μg/ml Proteinase K Fisher Sci BP1700-500
Chloroform Fisher Sci BP1145-1
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 sigma aldrich p3803
Isopropanol Fisher Sci BP2618-500
50 ml Oak Ridge tube Fisher Sci 05-562-16B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuhrman, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature. 399, (6736), 541-548 (1999).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, (10), 782-791 (2007).
  3. Huber, J. A., et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science. 318, (5847), 97-100 (2007).
  4. McDole, T., et al. Assessing coral reefs on a Pacific-wide scale using the microbialization score. PloS ONE. 7, (9), (2012).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Microbial ecology of four coral atolls in the Northern Line Islands. PloS ONE. 3, (2), (2008).
  6. Nelson, C. E., et al. Coral and macroalgal exudates vary in neutral sugar composition and differentially enrich reef bacterioplankton lineages. The ISME Journal. 7, (5), 962-979 (2013).
  7. Haas, A. F., et al. Influence of coral and algal exudates on microbially mediated reef metabolism. PeerJ. 1, (2013).
  8. Smith, J. E., et al. Indirect effects of algae on coral: algae‐mediated, microbe‐induced coral mortality. Ecology Letters. 9, (7), 835-845 (2006).
  9. Burdige, D. J., Martens, C. S. Biogeochemical cycling in an organic-rich coastal marine basin: 10. The role of amino acids in sedimentary carbon and nitrogen cycling. Geochimica et Cosmochimica Acta. 52, (6), 1571-1584 (1988).
  10. Capone, D. G., Kiene, R. P. Comparison of microbial dynamics in marine and freshwater sediments: Contrasts in anaerobic carbon catabolism. Limnology and Oceanography. 33, (4), 725-749 (1988).
  11. Krom, M. D., Sholkovitz, E. R. Nature and reactions of dissolved organic matter in the interstitial waters of marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 41, (11), 1565-1574 (1977).
  12. Grasshoff, K. Methods of sea-water analysis. Verlag Chemie. Weinheim and New York. (1976).
  13. Strickland, J. D. Practical handbook of seawater analysis. Bulletin Fisheries Research Board of Canada. 167, (1968).
  14. Sharp, J. H., et al. Analyses of dissolved organic carbon in seawater: the JGOFS EqPac methods comparison. Marine Chemistry. 48, (2), 91-108 (1995).
  15. DeLong, E. F. Microbial population genomics and ecology. Current Opinion in Microbiology. 5, (5), 520-524 (2002).
  16. Hugenholz, P., Goebel, B. M., Pace, N. R. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. Journal of Bacteriology. 180, (18), 4765-4774 (1998).
  17. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  18. Willner, D., Hugenholtz, P. From deep sequencing to viral tagging: Recent advances in viral metagenomics. BioEssays. 35, 436-442 (2013).
  19. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4, 470-483 (2009).
  20. John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports. 3, 195-202 (2011).
  21. Lim, Y. W., et al. The Microbiome and Virome of CF. Pediatric Pulmonology. 47, 321-322 (2012).
  22. Kelly, L. W., et al. Black reefs: iron-induced phase shifts on coral reefs. The ISME Journal. 6, (3), 638-649 (2012).
  23. Bjornsen, P. K. Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis. Applied Environmental Microbiology. 51, 1199 (1986).
  24. Simon, M., Azam, F. Protein content and protein synthesis rates of planktonic marine bacteria. Marine Ecology Progress Series. 51, (3), 201-213 (1989).
  25. Hara, S., Koike, I., Terauchi, K., Kamiya, H., Tanoue, E. Abundance of viruses in deep oceanic waters. Marine Ecology Progress Series. 145, (1), 269-277 (1996).
  26. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, (1), 69-114 (2000).
  27. Weinbauer, M. G., Brettar, I., Hofle, M. G. Lysogeny and virus-induced mortality of bacterioplankton in surface, deep, and anoxic marine waters. Limnology and Oceanography. 48, (4), 1457-1465 (2003).
  28. Clasen, J. L., Brigden, S. M., Payet, J. P., Suttle, C. A. Evidence that viral abundance across oceans and lakes is driven by different biological factors. Freshwater Biology. 53, (6), 1090-1100 (2008).
  29. Parada, V., Baudoux, A. C., Sintes, E., Weinbauer, M. G., Herndl, G. J. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal. 2, (9), 924-936 (2008).
  30. Angly, F. E., et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biology. 4, (11), (2006).
  31. Hansell, D. A., Carlson, C. A. Deep ocean gradients in dissolved organic carbon concentrations. Nature. 263, (266), (1998).
  32. Carlson, C. A., et al. Dissolved organic carbon export and subsequent remineralization in the mesopelagic and bathypelagic realms of the North Atlantic basin. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. 57, (16), 1433-1445 (2010).
  33. Sharp, J. H. Improved analysis for particulate organic carbon and nitrogen from seawater. Limnology and Oceanography. 19, (6), 984-989 (1974).
  34. Ehrhardt, M., Koeve, W. Determination of particulate organic carbon and nitrogen. Methods of Seawater Analysis. Third Edition, 437-444 (2007).
  35. Haas, A. F., et al. Organic matter release by coral reef associated benthic algae in the Northern Red Sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 389, (1), 53-60 (2010).
  36. Guildford, S. J., Hecky, R. E. Total nitrogen, total phosphorus, and nutrient limitation in lakes and oceans: Is there a common relationship. Limnology and Oceanography. 45, (6), 1213-1223 (2000).
  37. Allison, S. D., Chao, Y., Farrara, J. D., Hatosy, S., Martiny, A. C. Fine-scale temporal variation in marine extracellular enzymes of coastal southern California. Frontiers in Microbiology. 3, (2012).
  38. Van Duyl, F. C., Gast, G. J. Linkage of small-scale spatial variations in DOC, inorganic nutrients and bacterioplankton growth with different coral reef water types. Aquatic Microbial Ecology. 24, (1), 17-26 (2001).
  39. De Goeij, J. M., Van Duyl, F. C. Coral cavities are sinks of dissolved organic carbon (DOC). Limnology and Oceanography. 52, (6), 2608-2617 (2007).
  40. De Goeij, J. M., et al. Major bulk dissolved organic carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges. Marine Ecology Progress Series. 357, 139-151 (2008).
  41. Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9, (2), (2014).
  42. Carlson, C. A., Ducklow, H. W., Hansel, D. A. Organic carbon partitioning during spring phytoplankton blooms in the Ross Sea polynya and the Sargasso Sea. Oceanography. 43, (3), 375-386 (1998).
  43. Cotner, J. B., et al. Nutrient limitation of heterotrophic bacteria in Florida Bay. Estuaries. 23, (5), 611-620 (2000).
  44. Willner, D., et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108, (1), 4547-4553 (2011).
  45. Hall, R. J., et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods. 195, 194-204 (2013).
  46. Yang, S. Y., et al. Nanoporous membranes with ultrahigh selectivity and flux for the filtration of viruses. Advanced Materials. 18, (6), 709-712 (2006).
  47. Feldman, H. A., Wang, S. S. Sensitivity of various viruses to chloroform. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106, (4), 736-738 (1961).
  48. Ackermann, H. W. The Bacteriophages., Second Edition. Calendar, R. Oxford University Press. New York. 8-16 (2006).
  49. Henn, M. R., et al. Analysis of High-Throughput Sequencing and Annotation Strategies for Phage Genomes. PLoS ONE. 5, (2), (2010).
  50. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14, (9), 2526-2537 (2012).
  51. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nature Methods. 7, (12), 943-944 (2010).
  52. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification Methods Bias Metagenomic Libraries of Uncultured Single-Stranded and Double-Stranded DNA Viruses. Applied Environmental Microbiology. 77, (21), 7663-7668 (2011).
  53. Nelson, C. E., Alldredge, A. L., McCliment, E. A., Amaral-Zettler, L. A., Carlson, C. A. Depleted dissolved organic carbon and distinct bacterial communities in the water column of a rapid-flushing coral reef ecosystem. The ISME Journal. 5, (8), 1374-1387 (2011).
  54. Kelly, L. W., et al. Local genomic adaptation of coral reef-associated microbiomes to gradients of natural variability and anthropogenic stressors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (28), 10227-10232 (2014).
  55. Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats