जल रसायन विज्ञान और समुद्री सूक्ष्म जीव विज्ञान के एक फील्ड गाइड - महासागर में अनदेखी खिलाड़ी Unraveling

1Department of Biology, San Diego State University, 2Scripps Institution of Oceanography, University of California San Diego
Published 11/05/2014
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Haas, A. F., Knowles, B., Lim, Y. W., McDole Somera, T., Kelly, L. W., Hatay, M., et al. Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology. J. Vis. Exp. (93), e52131, doi:10.3791/52131 (2014).

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Abstract

यहाँ हम दूरस्थ समुद्री वातावरण में उपयोग के लिए अनुकूलित अच्छी तरह से जांच और अच्छी तरह से मानकीकृत अनुसंधान प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला शुरू. नमूना प्रोटोकॉल माइक्रोबियल समुदाय (भंग कार्बनिक कार्बन कण कार्बनिक पदार्थ, अकार्बनिक पोषक तत्वों) के लिए उपलब्ध संसाधनों का आकलन, और प्रत्यक्ष वायरल और माइक्रोबियल मायने रखता है के माध्यम से वायरल और बैक्टीरियल समुदायों के लिए एक व्यापक वर्णन (autofluorescent रोगाणुओं की गणना में शामिल हैं, और वायरल और माइक्रोबियल metagenomes का निर्माण). हम पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल और विकसित सबसे हाल ही में तकनीक के कुछ शामिल वैज्ञानिक विषयों की एक छितरी क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं जो तरीकों का एक संयोजन का उपयोग करें. वायरल और बैक्टीरियल समुदाय लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल खास तौर पर metagenomic अनुक्रमण तकनीक, केवल हाल के वर्षों में स्थापित किया गया है, और इस प्रकार अभी भी निरंतर सुधार के अधीन हैं. यह नमूना और नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया कुरेन की एक किस्म के लिए प्रेरित कियाtly उपयोग में. यहाँ प्रस्तुत तरीकों का सेट इकट्ठा करने और पर्यावरण के नमूने पर कार्रवाई करने की तारीख दृष्टिकोण के लिए ऊपर एक प्रदान करता है. इन प्रोटोकॉल के साथ संबोधित पैरामीटर विशेषताएँ और वायरल और माइक्रोबियल समुदाय गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए आवश्यक जानकारी पर न्यूनतम उपज. यह व्यापक सर्वेक्षण करने के लिए दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए आसान कर देता है और प्रत्येक तकनीक के लिए प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदम है और संभावित निरंतर चर्चा.

Introduction

समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों सुप्रीम शिकारियों की बायोमास के लिए पोषक तत्वों की उपलब्धता में किए गए बदलाव में परिणाम है कि perturbations की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन हैं. पिछले दशक के दौरान, कई अध्ययनों से समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों 1-4 में माइक्रोबियल समुदायों के महत्व का प्रदर्शन किया है. यह बैक्टीरियल और वायरल समुदाय में परिवर्तन बारीकी से समुद्री वातावरण 5 के समग्र गिरावट के साथ जुड़े रहे हैं कि स्पष्ट है. ये बदलाव ऐसे ऑक्सीजन की उपलब्धता या कार्बन पुनर्खनिजीकरण 6,7 के रूप में पानी स्तंभ में बदल बॉयोमेट्रिक्स द्वारा मदद की जा सकती है. Macroorganisms, पानी रसायन शास्त्र और माइक्रोबियल गतिविधि प्रतिक्रिया छोरों के बीच परस्पर निर्भरता का एक परिणाम के रूप में पारिस्थितिकी तंत्र गिरावट 8 की दर तेज हो सकती है.

1970 और 80 के दशक में कई प्रयास समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों 9-11 में biogeochemical चक्र को जानने के लिए किए गए थे. इन प्रारंभिक अध्ययन के लिए मुख्य चुनौतियों में से एक कमी थीमानकीकृत दृष्टिकोण का आकलन किया biogeochemical मापदंडों को मापने के लिए. मुख्य रूप से समुद्री जल पोषक तत्वों 12,13 पर उपलब्ध प्रोटोकॉल, वहाँ थे हालांकि, कार्बन गतिशीलता के आकलन और माइक्रोबियल समुदाय संरचना उपलब्ध साधनों और तरीकों से सीमित थे. JGOFS EqPac तरीकों तुलना के साथ, तीव्र एट अल. 14 पहली बार भंग कार्बनिक कार्बन (डॉक्टर) एकाग्रता के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय और मानकीकृत प्रोटोकॉल के लिए सुझाव दिया. 2000 के दशक तक विश्लेषणात्मक चुनौतियों इस प्रकार काफी हद तक हल हो चुका था माइक्रोबियल समुदाय के लिए उपलब्ध संसाधनों का निर्धारण और (डीलॉन्ग 15 देखें) स्थापित किया गया था नियंत्रित संस्कृति के वातावरण में सूक्ष्म समुदायों विशेषताएँ दृष्टिकोण को. उस समय पारंपरिक अनुक्रमण तरीकों बड़े पैमाने पर खेती की जाती प्रतिरूप संस्कृतियों पर आधारित है. प्राकृतिक नमूनों की प्रारंभिक पर्यावरण जीन अनुक्रमण माइक्रोबियल जैव विविधता के बहुमत cultiv से याद किया गया था कि, हालांकि, पता चलाव्यावहारिक आधारित विधियों 16. 2002 में, Breitbart एट अल. 17 असभ्य समुद्री वायरल समुदायों के पूरे जीनोम अनुक्रम के लिए एक विधि की स्थापना पर्यावरण समुद्री पानी के नमूनों में वायरल समुदाय का वर्णन करने के लिए पहली बार बन्दूक अनुक्रमण इस्तेमाल किया.

सबसे संस्कृति को मुश्किल कर रहे हैं के रूप में मौजूदा सूक्ष्म आकलन के भीतर, वायरस अभी भी, विशेष रूप से नीचे से अध्ययन किया रहते हैं और वे ऐसी 16S ribosomal शाही सेना (rRNA) आम तौर पर विविधता और समुदाय की रूपरेखा का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जीनों के रूप में एक सार्वभौमिक संरक्षित मार्कर की कमी है. metagenomic अनुक्रमण दृष्टिकोण जटिल वायरल समुदायों का विश्लेषण करने के लिए संस्कृति पर निर्भर है और जीन-लक्षित तरीकों के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. समुद्री जल से उत्पन्न प्रथम वायरल metagenomes सेंगर अनुक्रमण 17 का उपयोग अनुक्रम थे, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और बेहतर आणविक तकनीक का विकास metagenomic पढ़ाई 18 में तेजी से वृद्धि हुई है 19-21 से पीछा वायरल कणों की जुदाई, संवर्धन, और / या एकाग्रता, शामिल है.

दुनिया आवश्यक है चारों ओर विभिन्न प्रणालियों में डेटा सेट की तुलना, जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में वायरल, सूक्ष्म और जैव रासायनिक कामकाज पर मौजूदा ज्ञान और आगे के लिए. हालांकि, स्थापित प्रोटोकॉल काफी हद तक सहज सुलभ प्रयोगशाला सुविधाओं के साथ लगभग शोर वातावरण के लिए विकसित किया गया है. इस प्रकार, मानकीकृत क्षेत्र तरीकों की कमी इन पार पारिस्थितिकी तंत्र तुलना hinders. यहाँ हम अच्छी तरह से जांच शुरू करने और अच्छी तरह से दूरदराज के क्षेत्र के स्थानों में उपयोग के लिए कला अनुसंधान प्रोटोकॉल का राज्य से रूपांतरों मानकीकृत. इन तरीकों पिछले दशक 5,22 फैले कई अध्ययनों में सफल सिद्ध किया गया है और वर्तमान में एनओएए पर साथ ही साथ विभिन्न समुद्री प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाता हैरीफ आकलन और प्रशांत महासागर 4 भर निगरानी कार्यक्रम (रैंप). नमूना प्रोटोकॉल पानी रसायन शास्त्र मानकों (अकार्बनिक और कार्बनिक कार्बन सांद्रता, अकार्बनिक पोषक एकाग्रता), वायरल और माइक्रोबियल बहुतायत में शामिल (प्रत्यक्ष बैक्टीरियल मायने रखता है, प्रत्यक्ष वायरल मायने रखता है, और परपोषी अनुपात बनाम स्वपोषी का आकलन करने के लिए प्रवाह cytometry), और वायरल और माइक्रोबियल समुदाय संरचना और metagenomic विश्लेषण के माध्यम से चयापचय क्षमता (एक सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें). यहाँ वर्णित तरीकों से प्राप्त परिणामों के व्यापक जलीय पारितंत्र को चिह्नित करने के लिए आवश्यक कुंजी biogeochemical पृष्ठभूमि मापदंडों को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक हैं.

Protocol

उपकरण के 1. तैयारी

  1. निस्पंदन सेटअप की तैयारी
    1. (0.5-0.6 एम, अंतिम समाधान के 5 एल बनाने के लिए 4.75 एल आसुत जल के लिए 250 मिलीलीटर 32-36% एचसीएल जोड़) एक 5% हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) समाधान तैयार है. 2 सप्ताह के लिए एक उच्च-घनत्व पॉलीथीन कंटेनर (एचडीपीई) में इस समाधान स्टोर.
    2. संभावित भंग कार्बनिक कार्बन (डॉक्टर) contaminants बाहर जोंक 5% एचसीएल समाधान में 24 घंटे के लिए (फिल्टर) को छोड़कर नमूने के साथ संपर्क में आ जाएगा कि सभी भागों छोड़ दो. प्रत्येक नमूने घटना के बाद कार्बन प्रदूषण को रोकने के बारे में 30 मिलीलीटर 5% एचसीएल समाधान के साथ सभी भागों और फ्लश लाइनों कुल्ला (जैसे, गैस धुएं, तेल, नावों, मच्छर स्प्रे से).
    3. पूर्व combusted एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे या तुरंत पहले का उपयोग करने के लिए जब तक छाया हुआ सभी नमूने आइटम रखें.
    4. Precombust 25 मिमी GF / 12 घंटे के लिए 550 डिग्री सेल्सियस पर एक ओढ़ना भट्ठी में एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे एफ फिल्टर सब कार्बन बंद भाप और एक साफ, सूखे में उन्हें स्टोर करने के लिएउपयोग करें जब तक जगह है. हर समय precombusted फिल्टर संभाल करने एसिड धोया संदंश और बाँझ, गैर पीसा हुआ दस्ताने का प्रयोग करें.
  2. वायरल Metagenome सैम्पलिंग सामग्री की तैयारी
    1. अच्छी तरह से चार 20 एल बंधनेवाला कम घनत्व polyethylene carboys और चार 20 एल उच्च घनत्व polyethylene बाल्टी और 10% ब्लीच के साथ पलकों धो लो.
    2. इसके बाद सभी आइटम फिर आसुत और नमूना पानी के साथ 3x और पानी की कल के साथ carboys reseal कुल्ला.
    3. निम्नलिखित प्रोटोकॉल, और फिल्टर पिछले 5 दिनों में इस्तेमाल नहीं किया गया preemptively अगर साफ के अनुसार प्रत्येक उपयोग के बाद धो स्पर्शरेखा फ्लो फिल्टर (TFF).
    4. एक धोने बाल्टी में पानी की 5 एल में NaOH के छर्रों की 50 ग्राम भंग.
    5. चित्रा 3 के अनुसार ट्यूबिंग के लिए एक गीला TFF देते हैं और इकट्ठा.
    6. प्रणाली के माध्यम से NaOH के धोने समाधान के कुछ ले जाने के लिए कोई backpressure साथ 30 आरपीएम ~ पर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप चलाते हैं. धोने वापसी लाइन से बहता है एक बार, बाल्टी धोने के लिए हस्तांतरण के लिए कदमसमाधान के संचलन को पूरा करने के लिए.
    7. TFF के बहाव वापसी लाइन पर एक क्लैंप रखकर प्रणाली को backpressure लागू करें. इस छानना लाइन बाहर धोने समाधान के लिए मजबूर करेंगे. अत्यधिक समय (5 मिनट) TFF के बाहर बाढ़ और छानना एक अपमानित TFF का संकेत है निर्माण करने के लिए.
    8. NaOH समाधान के सभी लाइनों में है जब तक सिस्टम चलाया. तो फिर सिस्टम से बाहर backpressure, चलाने समाधान निकालने और त्यागें.
    9. वापसी और छानना लाइनों से पानी बहने की पीएच पीएच 7-8 है जब तक backpressure के तहत पानी चलाकर TFF कुल्ला.
    10. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और TFF से ट्यूबिंग निकालें. भंडारण के लिए TFF reseal. TFF अगले उपयोग करें जब तक गीला रहता है कि सुनिश्चित करें.

2. नमूना संग्रह

नोट: परिवहन के दौरान सभी एकत्र नमूनों शांत संग्रहित किया जाना चाहिए (4 डिग्री सेल्सियस यदि संभव हो तो) और आगे की प्रक्रिया जब तक प्रत्यक्ष सूर्य के प्रकाश के संपर्क में नहीं.

  1. सैम्पलिंगकार्बन, पोषक तत्वों, माइक्रोस्कोपी, फ्लो, और माइक्रोबियल metagenomics के लिए
    1. (4 एल नमूना पानी में जिसके परिणामस्वरूप) नमूना घटना के अनुसार दो Hatay Niskin इकाइयों ले. बस (उतरते रोकने जाएगा अन्यथा फंस हवा) जलमग्न पहले नमूने जहाजों खोलें.
    2. संबंधित साइट पर, दोनों सिरों को खोलने और पानी के माध्यम से ध्रुवीय धुरी के साथ सिलेंडर ले जाकर नमूना पानी के साथ नमूना पोत के अंदर फ्लश.
    3. नमूना लेने के लिए और ध्यान से नमूने कंटेनर बंद करें. यकीन नमूना साइट संक्रमण से बचने के लिए नाव और गोताखोरों से नदी के ऊपर है बनाओ.
  2. वायरल metagenomics के लिए नमूना
    1. लक्ष्य साइट पर 20 एल काबोइ पर तोड़ लेना पंप माउंट.
    2. इसी पानी की कल के साथ प्रत्येक लक्षित क्षेत्र और सील काबोइ पर काबोइ लक्ष्य तोड़ लेना पंप प्रवेश भरें.
    3. प्रत्येक नमूने साइट से अनफ़िल्टर्ड समुद्री जल के 4 carboys (सभी एक साथ 80 एल) ले लीजिए.

3. sampLe तैयारी

नोट: संदूषण की संभावना को कम करने के लिए डॉक्टर के साथ शुरू, यहाँ प्रस्तुत क्रम में नमूनों की प्रक्रिया. पूरी प्रक्रिया के लिए पाउडर मुक्त दस्ताने का प्रयोग करें.

  1. भंग कार्बनिक कार्बन (डॉक्टर)
    1. माउंट निस्पंदन सेट के संबंधित स्लॉट में दो विभाज्य Hatay Niskin इकाइयों में से एक. संबंधित फिल्टर धारक की ओर जाता है जो आउटलेट टयूबिंग कनेक्ट करें. Hatay Niskin इकाई के लिए दबाव हवा (0.2 बार) टयूबिंग कनेक्ट (चित्रा 2 देखें).
    2. फिल्टर धारकों में फिल्टर डालने से पहले नमूना पानी की 100 मिलीलीटर के साथ सभी लाइनों फ्लश. एसिड संदंश धोया का उपयोग फिल्टर धारक में 25 मिमी पूर्व combusted GF / एफ फिल्टर रखें. प्रत्येक डॉक्टर बोतल कुल्ला और नमूने पानी फ़िल्टर्ड के बारे में 20 मिलीलीटर के साथ 3 बार टोपी.
    3. नमूना पानी के बारे में 40 मिलीलीटर (~ 2/3 पूर्ण) के साथ बोतल भरें. परिवहन के दौरान संभावित संदूषण या नुकसान के मामले में एक बैकअप के लिए डॉक्टर के नमूनों में से कम से डुप्लिकेट में ले लीजिए.
    4. एफविश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सीधा खड़ा reeze नमूना बोतलें.
  2. पार्टिकुलेट कार्बनिक पदार्थ (पोम)
    1. 500 मिलीलीटर की कुल डॉक्टर नमूने एकत्रित करते समय के माध्यम से पारित कर दिया क्या सहित, GF / एफ फिल्टर पारित कर दिया है जब तक एकत्र किया गया है डॉक्टर नमूने छानने जारी रखने के बाद.
    2. खोल देना इनलाइन फिल्टर धारक.
    3. पूर्व combusted एल्यूमीनियम पन्नी के एक वर्ग के अंदर संदंश और जगह फिल्टर का उपयोग पोम विश्लेषण के लिए फिल्टर निकालें, शीर्ष पक्ष पर ही में बदल गया गुना, और लपेटो.
    4. मौलिक और समस्थानिक विश्लेषण के अधीन तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर फ्रीज.
  3. अकार्बनिक पोषक तत्वों
    1. प्रत्येक फिल्टर धारक में एक 0.2 माइक्रोन ट्रैक-Etched फिल्टर रखें. फिल्टर कैसेट पुनः देते हैं.
    2. प्रत्येक 20 मिलीलीटर की प्लास्टिक जगमगाहट बोतल नमूने पानी के साथ तीन बार कुल्ला. कंधे (~ 18 मिलीग्राम) के लिए प्रत्येक बोतल भरें.
    3. बाद में विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर.
  4. Microscopवाई (SYBR गोल्ड और DAPI)
    1. फिल्टर धारक उतारो.
    2. दो microcentrifuge ट्यूबों में से प्रत्येक में पानी के 1 मिलीलीटर लीजिए.
    3. (बाद में SYBR गोल्ड धुंधला के लिए) aliquots में से एक को 66 μl 32% paraformaldehyde जोड़ें. इसी दूसरे के लिए 12 μl 25% glutaraldehyde जोड़ें (बाद में DAPI धुंधला के लिए).
    4. धीरे मिश्रण, और नमूने अंधेरे में आरटी पर कम से कम 15 मिनट के लिए "ठीक" करने की अनुमति.
  5. फ्लो
    1. मलबा और बड़े यूकेरियोटिक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए फिल्टर धारकों में से एक में एक 8.0 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट फिल्टर रखें.
    2. 1 मिलीलीटर नमूने के साथ प्रत्येक नमूने साइट से 2 cryovials भरने के माध्यम से नमूने पानी से गुजरती हैं.
    3. प्रत्येक cryovial (अंतिम एकाग्रता = 0.125%) 25% glutaraldehyde के 5 μl जोड़ें.
    4. मिश्रण करने के लिए शीशियों उलटें.
    5. नमूना आरटी पर 15-30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें. 30 मिनट से अधिक नहीं है.
    6. तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज नमूने.
    7. -80 डिग्री सेल्सियस या liqui में स्टोर नमूनेएक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण जब तक डी नाइट्रोजन शुष्क शिपर.
  6. माइक्रोबियल Metagenomic नमूना
    1. लाइन फिल्टर धारकों में निकालें.
    2. सीधे संबंधित लाइन पर 0.22 माइक्रोन बेलनाकार फिल्टर माउंट.
    3. प्रत्येक साइट से Hatay Niskin इकाइयों दोनों का नमूना शेष पानी फिल्टर एक फिल्टर के माध्यम से (फिल्टर प्रति 3-4 एल योग).
    4. छानने के बाद हवा से भरा एक साफ 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके प्रत्येक फिल्टर के बाहर शेष पानी धक्का.
    5. वापस मूल पैकेजिंग में फिल्टर प्लेस और प्रयोगशाला टेप के साथ पैकेज सील.
    6. -20 डिग्री सेल्सियस पर अलग-अलग पैक फिल्टर स्टोर.
  7. वायरल Metagenomic नमूना
    1. कोई नमूना पर्यावरण से खो दिया है या दूषित है सुनिश्चित करने के लिए तुरंत धोया बाल्टी में वायरल metagenome नमूने स्थानांतरण.
    2. पूर्व एकाग्रता 19 को मलबे और सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए बड़े छेद के आकार नायलॉन जाल (25-100 माइक्रोन) का उपयोग करते हुए पूर्व फिल्टर.
    3. एक नमूना बाल्टी में प्रसव लाइन रखने, और एक सिंक में चल वापसी और छानना लाइनों छोड़ने, चित्रा 3 में दिखाया गया है TFF सेट करें.
    4. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और नमूना पानी के 1-2 एल से भरा लाइनों को चालू करें.
    5. , चक्र पूरा backpressure के 0.7 बार जोड़ने के लिए नमूना बाल्टी में वापसी लाइन रखें.
    6. समुद्री जल ध्यान केंद्रित करते हुए स्तर के रूप में ऊपर नमूना जलाशय चला जाता है. जल स्तर और एक ब्लीच-धोए, ट्रिपल rinsed tripour बीकर में बाल्टी में सेवन लाइन, स्थानांतरण ध्यान नीचे चला जाता है जब ध्यान केंद्रित जारी है.
    7. जलाशय बीकर खाली है, तो tripour में यह ठीक हो, पंप दर बढ़ाने के लिए और लाइनों के माध्यम से पूरे नमूना धक्का, backpressure हटा दें.
    8. किसी भी वायरल प्रजातियों के खिलाफ भेदभाव नहीं है, जबकि सबसे बैक्टीरिया को दूर करने के लिए 0.45 माइक्रोन बेलनाकार फिल्टर के माध्यम से ध्यान देना.
    9. हर 150 मिलीलीटर के बाद 0.45 माइक्रोन बेलनाकार फिल्टर बदलें. 0.45 माइक्रोन फिल लीजिए50 मिलीलीटर ट्यूब में पंजीकृत वायरल ध्यान.
    10. अवशिष्ट बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए फ़िल्टर किया वायरल ध्यान से प्रत्येक 50 मिलीलीटर विभाज्य को क्लोरोफॉर्म की 250 μl जोड़ें. बाद के प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ईमानदार, मिश्रण को पलटना, और दुकान.
    11. 0.45 माइक्रोन फिल्टर सूखी और 3.6.5 और 3.6.6 चरणों में वर्णित के रूप में उन्हें दुकान.

माइक्रोस्कोपी नमूने 4. प्रसंस्करण

नोट: संभावित दाग या रन के बीच जैविक अवशेषों को रोकने के लिए 95% इथेनॉल द्वारा पीछा 10% ब्लीच के साथ फिल्टर टावरों कुल्ला. यदि संभव हो तो प्रक्रिया माइक्रोस्कोप नमूने 1 घंटे के भीतर और उजागर धब्बे और दाग फिल्टर से बचने के प्रकाश में.

  1. पर्वत
    1. 1x पीबीएस के 4.9 मिलीलीटर के लिए 10% एस्कॉर्बिक एसिड की 100 μl जोड़ें, और मिश्रण अच्छी तरह से.
    2. 100% ग्लिसरॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और मिश्रण अच्छी तरह से.
    3. फ़िल्टर -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.02 माइक्रोन एल्यूमिना मैट्रिक्स डिस्पोजेबल सिरिंज फिल्टर, विभाज्य और दुकान का उपयोग कर माउंट.
  2. SYBRगोल्ड धुंधला
    1. एक microcentrifuge ट्यूब में 2% अंतिम एकाग्रता paraformaldehyde के साथ तय की प्रत्येक नमूने के 500 μl विभाज्य पिपेट.
    2. Aliquots में से प्रत्येक के लिए 1,000x SYBR गोल्ड समाधान के 0.5 μl जोड़ें.
    3. धीरे नमूना मिक्स और 10 मिनट के लिए अंधेरे में डाल दिया.
    4. वैक्यूम पंप प्रणाली की प्रत्येक फिल्टर स्टैंड पर कुंडलाकार polypropylene के समर्थन की अंगूठी के साथ एक 0.02 माइक्रोन एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर प्लेस और फिल्टर टावरों (चित्रा 4) देते हैं. इन फिल्टर एक दोहरी सरंध्रता के रूप में 0.02 माइक्रोन फिल्टर, फिल्टर स्टैंड प्लास्टिक साइड पर रखा गया है सुनिश्चित करें.
    5. वैक्यूम पंप के साथ बंद, फिल्टर भर में समान रूप से फैला हुआ है नमूना सुनिश्चित करने के लिए 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर किए वायरस मुक्त पानी के 2 मिलीलीटर के साथ साथ, SYBR दाग नमूना के 500 μl जोड़ें.
    6. हानिकारक वायरस और रोगाणुओं फ़िल्टर किया जा रहा से बचने के लिए कोई अधिक से अधिक 1 बार की एक नकारात्मक दबाव बनाने के लिए वैक्यूम पंप चालू करें.
    7. पूरे नमूना जाने की अनुमतिके माध्यम से.
    8. (डॉक्टर के लिए उपयोग के रूप में नहीं एक ही जोड़ी) संदंश का प्रयोग, ध्यान से फिल्टर सूखा है सुनिश्चित करने के लिए पोंछ छानने टॉवर से प्रत्येक फिल्टर हटाने, और एक नाजुक काम पर से गुजारें.
    9. एक खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट की पिपेट 10 μl और पर्वत की बूंद पर दाग नमूना युक्त शुष्क फिल्टर जगह है.
    10. एक coverslip जोड़ने से पहले 10 μl प्रत्येक फिल्टर के ऊपर से माउंट जोड़ें.
    11. धीरे नीचे coverslip दबाएँ. यदि संभव हो तो हवा के बुलबुले को खत्म करने और coverslip के प्रस्ताव पास से बचने की कोशिश करें.
    12. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक slidebox और दुकान में रखें स्लाइड.
  3. DAPI धुंधला
    1. प्रत्येक फिल्टर स्टैंड पर कुंडलाकार polypropylene के समर्थन की अंगूठी के साथ एक 0.2 माइक्रोन एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर प्लेस और फिल्टर टावरों देते हैं.
    2. वैक्यूम पंप बंद कर दिया साथ, प्रयोग प्रत्येक टावर के लिए 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर किए वायरस मुक्त पानी के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. कुल मात्रा ओ में जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक टावर में glutaraldehyde तय नमूना के पिपेट 1 मिलीलीटर,एफ प्रत्येक फिल्टर टॉवर में 3 मिलीग्राम.
    4. कोई अधिक से अधिक 1 बार की एक नकारात्मक दबाव बनाने के लिए वैक्यूम पंप चालू करें.
    5. 0.2 माइक्रोन एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर पर पूरे नमूना फ़िल्टर.
    6. ध्यान से संदंश (डॉक्टर के लिए उपयोग के रूप में नहीं एक ही जोड़ी) का उपयोग छानने टॉवर से फिल्टर हटा दें.
    7. दाईं तरफ ऊपर फिल्टर रखते हुए एक पेट्री डिश में एक 100 μl ड्रॉप DAPI के समाधान [25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] पर फिल्टर प्लेस और 15 मिनट के लिए नमूना दाग करते हैं. धुंधला प्रक्रिया के दौरान प्रकाश से बचें.
    8. 15 मिनट के बाद, दाग से फिल्टर को दूर एक नाजुक कार्य पर इसे पारित पोंछ सूखी और फिर फिल्टर रखने, 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर किए वायरस मुक्त पानी के 100 μl ड्रॉप करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए दाईं तरफ ऊपर DAPI दाग शेष बंद धोने के लिए 1 मिनट के लिए. एक बार इस धोने दोहराएँ.
    9. SYBR गोल्ड नमूने के लिए वर्णित के रूप में माइक्रोस्कोप पर माउंट फिल्टर समान रास्ता स्लाइड.

5. डीएनए निष्कर्षण

  1. माइक्रोबियल Metagenomic डीएनए
    1. आरटी पर कम से कम 20 मिनट के लिए बेलनाकार फिल्टर गला लें.
    2. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग फिल्टर में किसी भी शेष समुद्री जल निकालें. एक प्रक्षालित और autoclaved टोपी का उपयोग बेलनाकार फिल्टर के नीचे अंत टोपी.
    3. प्रत्येक फिल्टर के लिए, 360 μl T1 "पूर्व सेल" मिश्रण बफर और 50 μl proteinase कश्मीर, और उसके बाद फिल्टर में मिश्रण विंदुक. खुले अंत टोपी.
    4. 55 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन ओवन हे / एन (या कम से कम 2 घंटे) में सेल प्रतिक्रिया सेते हैं.
    5. टोपी में से एक निकालें और 200 μl बी 3 "सेल" जोड़ने पूर्व Lyse नमूना करने के लिए फिल्टर में बफर. पुनः टोपी फिल्टर और 70 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 मिनट के लिए एक घूर्णन ओवन में मिश्रण सेते हैं.
    6. उल्टा फिल्टर के साथ तरल बाहर चूसने से एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग बेलनाकार फिल्टर से पूरी मात्रा निकालें.
    7. एक नया microfuge ट्यूब में lysed नमूना निष्कासित, और 100% इथेनॉल के 200 μl जोड़ें.
    8. , अच्छी तरह मिक्स स्पिन पर पूरे नमूना लोडनिर्माता प्रोटोकॉल के निर्देशानुसार स्तंभ, और आगे बढ़ना.
    9. एक फ्लोरोसेंट आधारित परख का उपयोग डीएनए यों.
  2. समुद्री वायरल metagenomics
    1. शुद्ध और फेज कणों ध्यान केंद्रित (Thurber एट अल से संशोधित. 19)
      1. 1.7 ग्राम / मिलीलीटर के समाधान तैयार करने के लिए समुद्री जल में CSCL भंग 1.5 ग्राम / मिलीलीटर, 1.35 ग्राम / मिलीलीटर, 1.2 ग्राम / मिलीलीटर (समाधान के 1 मिलीलीटर बाहर वजन द्वारा calibrated). उपयोग करने के लिए पहले 0.02 माइक्रोन फिल्टर के साथ प्रत्येक अंश फ़िल्टर.
        नोट: प्रत्येक अंश का घनत्व समाधान का उपयोग करने से पहले तीन महत्वपूर्ण आंकड़े को सही है कि सुनिश्चित करें और उपयोग करने से पहले एक 0.02 माइक्रोन फिल्टर के साथ सभी समाधान फिल्टर. इस्तेमाल की समुद्री जल या समुद्री जल क्रमशः, कम या घनत्व बढ़ाने के लिए CSCL के साथ संतृप्त.
      2. सभी अभिकर्मकों आगे बढ़ने से पहले वायरस से रहित हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए खंड 4.2 में वर्णित के रूप में संयुक्त अभिकर्मकों के 1 मिलीलीटर से एक खुर्दबीन स्लाइड बनाओ.
      3. वायरल TFF ध्यान की 45 मिलीलीटर 9 छ CSCL जोड़ें1.12 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम घनत्व. सर्द CSCL कदम ढाल की स्थापना करते हुए.
      4. 1.7 ग्राम / मिलीलीटर समाधान के साथ शुरू क्रमिक सीरम वैज्ञानिक pipettes का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब में धीरे-धीरे कम सघन अंश प्रत्येक क्रमिक रूप से 1 मिलीलीटर जोड़ें. प्रत्येक व्यक्ति meniscus के स्तर मार्क और भिन्न के बीच pycnoclines परेशान नहीं हैं कि सुनिश्चित करते हैं. अधिक विस्तार के लिए साथी पत्र देख (लिम एट अल. 2014).
      5. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट भार ~ 83,000 XG पर 6 ट्यूब और अपकेंद्रित्र में से प्रत्येक में नमूना की 7.5 मिलीलीटर, 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के साथ.
      6. बाधा पहुँचा के बिना घनत्व ढ़ाल रोटर उतारना और सिर्फ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 18 जी सुई के साथ पहले से चिह्नित 1.5 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व परत (चित्रा 5) नीचे ट्यूब पियर्स. शुद्ध VLPs के 1.5 मिलीलीटर बंद ड्रा और एक नया microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण. सभी नमूनों के लिए दोहराएँ.
      7. , शुद्ध VLPs को क्लोरोफॉर्म की 0.2 मात्रा जोड़ें सख्ती मिश्रण, 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
      8. जोड़ें 150 और# 181; प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब 10x DNase बफर के एल.
      9. 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर स्पिन, और जलीय चरण इकट्ठा. क्लोरोफॉर्म microcentrifuge ट्यूब के तल में नहीं कुल करता है, अधिक DNase बफर जोड़ने मिश्रण और दोहराएँ.
      10. फिर 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा DNase गतिविधि निष्क्रिय, DNase मैं (अंतिम एकाग्रता = 2.5 यूनिट / μl) जोड़ें और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    2. वायरल कणों की तरह से डीएनए निष्कर्षण (VLPs)
      1. समान रूप से दो से साफ और autoclaved ओक रिज ट्यूबों में प्रत्येक नमूने से शुद्ध VLPs पूल.
      2. 0.2 एम EDTA, 0.01 मात्रा 0.5 एम EDTA, formamide की 1 मात्रा 10 μl ग्लाइकोजन (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 0.1 मात्रा 2 एम Tris-एचसीएल (पीएच 8.5) जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
      3. नई मात्रा का जिक्र करते हुए 2 संस्करणों आर टी 100% इथेनॉल जोड़ें. मिक्स और 30 से अधिक मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
      4. 4 & # पर 60 मिनट के लिए 17,200 XG पर ओक रिज ट्यूब कताई द्वारा गोली डीएनए176, सी.
      5. सतह पर तैरनेवाला निकालें. सीरम वैज्ञानिक pipettes का उपयोग कर ठंडा 70% इथेनॉल के साथ दो बार डीएनए गोली धोने.
      6. सभी इथेनॉल (यदि आवश्यक हो तो संक्षेप में फिर से कताई), कवर निकालें, और> 15 मिनट के लिए आरटी पर हवा शुष्क गोली अनुमति देते हैं.
      7. 1X ते बफर (8.0 पीएच) के 567 μl में> 15 मिनट के लिए डीएनए गोली Resuspend. एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में resuspended डीएनए के 567 μl स्थानांतरण.
      8. Proteinase कश्मीर की और 3 μl (20 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) (65 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करने से पहले कम से पूर्व गर्म) 10% की एसडीएस 30 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
      9. 5 एम NaCl के 100 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. पूर्व गर्म CTAB NaCl समाधान, भंवर के 80 μl जोड़ें, और 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
      10. 2 मिनट के लिए 16,000 XG पर क्लोरोफॉर्म, भंवर, और स्पिन की मात्रा का 0.2 भागों जोड़ें. एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
      11. 24: फिनोल क्लोरोफॉर्म isoamyl 25 के बराबर मात्रा में जोड़ें 1 समाधान, भंवर मिश्रण करने के लिए,और 2 मिनट के लिए 16,000 XG पर स्पिन. एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
      12. 2 मिनट के लिए 16,000 XG पर क्लोरोफॉर्म, भंवर, और स्पिन के बराबर मात्रा में जोड़ें. एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
      13. सतह पर तैरनेवाला अंश को isopropanol के 0.7 मात्रा में जोड़ें और डीएनए वेग को कम से कम 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
      14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर कताई द्वारा डीएनए गोली. सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट और ठंडा 70% इथेनॉल के 500 μl के साथ दो बार गोली धोने.
      15. 16,000 XG पर स्पिन और ट्यूब से शेष इथेनॉल को हटा दें. 15 मिनट के लिए गोली हवा शुष्क.
      16. आरटी पर कम से कम 5 मिनट के लिए क्षालन बफर (5 मिमी Tris, पीएच 7.5) या Tris-EDTA पीएच 8.0 के 50 μl के साथ resuspend डीएनए गोली.
      17. उच्च संवेदनशीलता प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग डीएनए यों.

Representative Results

माइक्रोस्कोपी

माइक्रोस्कोपी के नमूने और वे वांछित गुणवत्ता के हैं सुनिश्चित करने के लिए तुरंत विश्लेषण किया जाना चाहिए सकता है. बहुतायत और बैक्टीरियल समुदाय के आकार के वितरण को मापने के लिए, DAPI स्लाइड epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जाएगी: (चित्रा 6A) (उत्तेजना / उत्सर्जन. 358/461 एनएम, McDole एट अल 2012 देखें). कोशिकाओं की गिनती और आयाम इमेजिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, ImagePro या ImageJ) का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है. सभी कोशिकाओं निम्न समीकरण का उपयोग अर्धगोल टोपी के साथ सिलेंडर के आकार है कि इस धारणा बनाने से निकाली गई लंबाई और चौड़ाई माप सेल संस्करणों (वी) से:

वी = π / 4 × डब्ल्यू 2 (एल - / 3 डब्ल्यू)

एल लंबाई और w है जहां प्रत्येक कोशिका 23,4 की चौड़ाई है. माइक्रोबियल बायोमास तो के लिए पहले से स्थापित आकार पर निर्भर रिश्तों का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता हैआर समुद्री माइक्रोबियल समुदायों 24. आम तौर पर समुद्री बैक्टीरिया 0.1-4 माइक्रोन से लंबाई में सीमा, लेकिन कुछ स्थानों में ~ 8 माइक्रोन तक जाने.

DAPI के साथ दाग फिल्टर (0.2 माइक्रोन) केवल बैक्टीरिया दिखा देंगे, वहीं SYBR गोल्ड दाग (0.02 माइक्रोन) के लिए इस्तेमाल किया फिल्टर बैक्टीरिया और वायरस होते हैं. वायरस की बहुतायत मापने रोगाणुओं के लिए के रूप में एक ही प्रोटोकॉल इस प्रकार है, लेकिन 325-375 एनएम के एक उत्तेजना का उपयोग किया जाएगा और उत्सर्जन अधिकतम 537 एनएम (चित्रा 6B) में है.

मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करने के लिए नमूना मात्रा मूल नमूने में वायरल बहुतायत के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. सही मात्रा सबसे अच्छा पानी की दी शरीर के लिए अनुभव से निर्धारित किया जाता है फिल्टर करने के लिए. वायरल सांद्रता के साथ अलग नमूने युक्त micrographs के उदाहरण चित्रा 7 में सचित्र हैं.

पिछले अध्ययनों से परिणाम सूक्ष्म जीव है कि वायरस का सुझावअनुपात (VMR) आम तौर पर मूंगा चट्टान प्रणाली में लगभग 6 के एक औसत (नोल्स अप्रकाशित डेटा) के साथ, जलीय प्रणालियों 25-29 में 1-50 सीमा होती है, और बीच में 3 और 20.

फ्लो

प्रत्यक्ष मायने रखता है और माइक्रोबियल समुदाय के आकार के आकलन के अलावा, फ्लो के जरिए परपोषी रोगाणुओं को स्वपोषी के अनुपात का आकलन आगे एकत्र नमूनों से (चित्रा 8 में दिए गए उत्पादन cytometry अनुकरणीय प्रवाह) निकाला जा सकता है. कुल जीवाणु कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने, नमूने SYBR ग्रीन मैं साथ दाग रहे हैं और एक 530/30 bandpass फिल्टर के साथ एक photomultiplier ट्यूब का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. क्लोरोफिल के लिए और phycoerytherin (585/42 bandpass फिल्टर) (वापस 675-735 एनएम की एक श्रृंखला में जिसके परिणामस्वरूप वापस एल.पी. दर्पण को) एक चैनल बेदाग नमूनों में स्वपोषक की बहुतायत गिनती करने के लिए प्रयोग किया जाता है. परपोषी रोगाणुओं की बहुतायत, गैर से स्वपोषी मायने रखता है निर्धारित करने के लिएसना भाग तो SYBR से सना हुआ कुल गिनती (McDole एट अल. प्रस्तुत) से घटाया जाता है.

वायरल metagenomics

वायरल metagenomics समुदाय संरचना और समारोह निर्धारित करने के लिए कुल जीनोमिक अनुक्रम जानकारी का उपयोग, वायरल पारिस्थितिकी के लिए एक संस्कृति-स्वतंत्र आणविक दृष्टिकोण का इस्तेमाल करता. Metagenomics वैश्विक तराजू से 30 जटिलता और स्थानीय 17 पर वायरल समुदायों की विविधता के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने की गई है. वायरल metagenomic डेटा के विश्लेषण के लिए पहले से पंजीकृत उपकरणों की एक विस्तृत सरणी की हाल ही में विकास metagenomics के लेंस के माध्यम से एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण virosphere के लिए अनुमति देता है, कम्प्यूटेशनल बाधाओं में कमी आई है.

यहाँ प्रस्तुत तरीकों, की एकाग्रता मलबा और सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए जाल बड़े छेद के आकार नायलॉन के साथ पूर्व निस्पंदन के संयोजन का उपयोग समुद्री जल से अलगाव और वायरल कणों के संवर्धन पर प्रकाश डालाTFF (चित्रा 3) और बाद में एक 0.45 माइक्रोन निस्पंदन के साथ नमूने बड़ा कोशिकाओं को हटाने के लिए. इस विधि को मोटे तौर पर हमें छोटे खंडों में नीचे की ओर प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने की अनुमति देता है एक 100x केंद्रित नमूना (आंकड़े 5 ब-5E) पैदा करता है. वायरल lysate में किसी भी शेष माइक्रोबियल कोशिकाओं के विकास को रोकने के लिए और इसलिए क्षेत्र स्टेशन और प्रयोगशाला के बीच लंबे समय से पारगमन समय के दौरान नमूने के वायरल बहुतायत में परिवर्तन करने के लिए, क्लोरोफॉर्म अक्सर भंडारण के लिए 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा है. अलगाव और VLPs की शुद्धि के बाद, ऐसी SYBR गोल्ड के रूप में न्यूक्लिक एसिड रंगों के साथ epifluorescence माइक्रोस्कोपी वायरल कणों की उपस्थिति और शुद्धता (आंकड़े 5 ब-5E) को सत्यापित करने के लिए उपयोग किया जाता है.

यहाँ, हम दक्षिणी रेखा द्वीप मूंगा चट्टान से दो वायरल metagenomes मौजूद है, विशेष रूप से, स्टारबक (Star7) और मिलेनियम (CAR9, पहले कैरोलीन के रूप में जाना जाता है) द्वीपों. 120 एल सैम की कुल मात्राखंड 3.7 और 5.2 में वर्णित के रूप में मिसाल पानी 10 मीटर की गहराई पर प्रत्येक साइट से एकत्र और संसाधित किया गया था. अनुच्छेद 4 (चित्रा 5 ब) में वर्णित विधि के अनुसार सत्यापित रूप सीज़ियम क्लोराइड ढाल centrifugation से शुद्ध VLPs CAR9 (चित्रा 5D) के लिए 3.3 एक्स 10 8 कणों / मिलीलीटर और Star7 के लिए मिलीलीटर प्रति 2.9 एक्स 10 9 कणों थे. इन नमूनों से अलग डीएनए की कुल राशि लगभग 400 Nanodrop माप के आधार पर एनजी थे. डीएनए अनुक्रम डेटा की विशेषताओं तालिका 1 में प्रस्तुत किया है. मौजूदा डेटाबेस का उपयोग समानता खोजों के आधार पर Phi29 पोलीमर्स का उपयोग प्रवर्धित और 2011 में पर्यावरण जीनोमिक्स कोर सुविधा से अनुक्रम गया था, दृश्यों का बहुमत (> 70%) अक्सर समाप्त हो गया uncharacterized, यानी, अज्ञात मूल और कार्य करता है. इसी तरह, यहाँ प्रस्तुत दो viromes अज्ञात दृश्यों से अधिक 97% प्रस्तुत किया. नतीजतन, गैर डेटाबेसनिर्भर विश्लेषण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया और (वायरल metagenomics में "काले पदार्थ" पर अनुसंधान अवसर का एक नया हाथ खोला गया था Seguritan एट अल. प्रेस में).

माइक्रोबियल metagenomics

माइक्रोबियल metagenomes का विश्लेषण माइक्रोबियल समुदाय वर्तमान के लक्षण वर्णन और इन समुदायों के कार्यात्मक विवरण के लिए अनुमति देता है. उदाहरण macrobial समुदाय संरचना में परिवर्तन या उपलब्ध पोषक तत्वों और प्रजातियों की बहुतायत और उनके प्रमुख चयापचय मार्ग (; केली एट अल 2014. चित्रा 9) के बीच रोगजनक और डाह 5,22 या तुलना की मौजूदगी का अनुमान शामिल.

जल रसायन विज्ञान

जल रसायन शास्त्र मापदंडों आम तौर पर वांछित डेटा उत्पन्न करने के लिए व्यापक विश्लेषणात्मक प्रसंस्करण ले; डॉक्टर के विश्लेषण के लिए नमूने उच्च तापमान उत्प्रेरक ऑक्सीकरण 31,3 के माध्यम से मापा जाएगा2, प्रवाह इंजेक्शन विश्लेषण 36,12,37 द्वारा एक मौलिक विश्लेषक 33-35, और अकार्बनिक पोषक तत्वों के लिए युग्मित आइसोटोप अनुपात जन स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से कण कार्बनिक पदार्थ (पोम). सभी विश्लेषण के सफल समापन के बाद, के रूप में 1 टेबल में दिखाई गई जानकारी माइक्रोबियल और वायरल समुदायों के लक्षण वर्णन के पूरक के लिए उपलब्ध हो जाएगा. यह जानकारी जैविक कार्बन और नाइट्रोजन के नमूनों की स्थिर आइसोटोप अनुपात के साथ बधाई दी जा सकती है और स्वपोषक और heterotrophs के बीच अनुपात (McDole एट अल. प्रस्तुत) (हास एट अल. 35 देखें).

चित्रा 1
प्रोटोकॉल खंड में वर्णित विधि का चित्रा 1. अवलोकन. इस figu का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंपुनः.

चित्रा 2
चित्रा 2. नमूना प्रसंस्करण रिग सेटअप. यहाँ पेश निस्पंदन सेटअप (योजनाबद्ध ड्राइंग, वास्तविक तस्वीर सही पैनल छोड़ दिया) जरूरी नमूने उत्पन्न करने की आवश्यकता नहीं है लेकिन काफी प्रक्रिया को तेज करेगा. सेटअप (1) Hatay Niskin इकाइयों बढ़ रहे हैं जिस पर एक backplate के होते हैं. नीचे की ओर का सामना करना पड़ दुकान पर, Hatay Niskin इकाइयों में लाइन फिल्टर धारकों (2) के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के साथ जुड़े हुए हैं. ये एचडीपीई नमूना शीशियों में संबंधित फिल्टर के माध्यम से जांचा पानी दर्रा (3) सही नीचे घुड़सवार करते हैं. निस्पंदन प्रक्रिया एक दबाव पण (5) द्वारा विनियमित और जो दबाव हवा (4), के माध्यम से त्वरित है. एक अतिप्रवाह बेसिन एचडीपीई शीशियों या पोम निस्पंदन के बदलते दौरान पानी spilling से बचाता है. कृपयाइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
. नायलॉन (Thurber एट अल. 19 से संशोधित) चित्रा 3. स्पर्शरेखा प्रवाह फिल्टर लाइनअप फ़िल्टर्ड जाल नमूना पानी एक स्पर्शरेखा प्रवाह फिल्टर करने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (2) के माध्यम से जलाशय (1) से पंप है (3). backpressure के अभाव में वापसी लाइन (4) के साथ जलाशय (1) के लिए नमूना पानी रिटर्न. Backpressure वापसी लाइन पर एक नली बंद करना (5) के माध्यम से लागू किया जाता है, पानी फिल्टर के माध्यम से गुजरता है और त्याग या छानना जलाशय (6) को दिया है. सभी नमूना पानी ट्यूबिंग लाइनों में केंद्रित है जब तक यह छानना लाइन बाहर ध्यान केंद्रित किया है नमूना पानी की जगह है.

चित्रा 4
चित्रा 4. माइक्रोस्कोप स्लाइड निस्पंदन सेटअप.समान रूप से संबंधित एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर पर DAPI और SYBR गोल्ड दाग नमूने वितरित करने के लिए (1), फिल्टर एक क्लैंप (4) के साथ छानने का काम कई गुना का फिल्टर टॉवर (2) और स्टेम के बीच में रख दिया गया और तय होने की जरूरत है. एक दबाव विनियमित निर्वात (5) निस्पंदन प्रक्रिया (योजनाबद्ध ड्राइंग शीर्ष, वास्तविक चित्र नीचे पैनल) में तेजी लाने जाएगा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. शोधन और फेज कणों की एकाग्रता. प्रत्येक सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढाल के 1 मिलीलीटर की कुल पूर्व इलाज नमूना (ए) के प्रमुख के लिए एक दूसरे को पहले के शीर्ष पर स्तरित है. प्रत्येक परत ultracentrifugation के बाद निकासी की सुविधा के लिए ट्यूब के बाहर चिह्नित किया जाना चाहिए. ट्यूब पूर्व में छेद किया जाएगा जहां लाल तीर के निशानVLP अंश पथ. Star7 (बी) और CAR9 (डी) की 0.45 माइक्रोन फ़िल्टर प्रतिनिधि वायरल केंद्रित की epifluorescence micrographs: वायरल केंद्रित की micrographs (इ). केवल VLPs (सफेद तीर) सीज़ियम क्लोराइड ढाल ultracentrifugation बाद भी बने रहते हैं जबकि बैक्टीरियल कोशिकाओं सहित बड़े कणों, Star7 (बी) और CAR9 (डी) नमूने दोनों से 0.45 माइक्रोन filtrates से दिखाई दे रहे थे; स्टार 7 (सी) और CAR9 (ई). यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा (ए) DAPI और (बी) SYBR गोल्ड दाग स्लाइड उदाहरण के विश्लेषण से DAPI और SYBR गोल्ड माइक्रोग्राफ विश्लेषण. स्क्रीनशॉट 6. उदाहरण. (ए) की लंबाई और सभी की चौड़ाई (माइक्रोन) कणों पर प्रकाश डाला(= रोगाणुओं) एक इमेजिंग प्रोग्राम की मदद से मूल्यांकन किया जा सकता. छवि के केन्द्र में एकत्रीकरण नोट. इन समूहों विश्लेषण वायरस के दौरान (बी). बाद के विश्लेषण से बाहर रखा करने की आवश्यकता होगी और बैक्टीरिया VLP और सेलुलर आकार पर्वतमाला (लाल VLP, सेलुलर हरा) में आकार थ्रेसहोल्ड द्वारा binned करने की आवश्यकता है. आमतौर पर संबंधित इमेजिंग प्रोग्राम द्वारा Uncategorized कुछ बेहोश VLPs कर रहे हैं कि ध्यान दें. के रूप में बेहोश सफेद डॉट्स दिखने ये VLPs मैन्युअल गिना और स्वचालित वायरल की गिनती के लिए जोड़ा जाना चाहिए. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
चित्रा SYBR गोल्ड 7. सांद्रता दाग नमूने. SYBR दाग वायरस के नमूने की विभिन्न संख्या युक्त 0.02 एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर का micrographs. पैनल वायुसेना से पता चलता हैबी में दिखाया फिल्टर पर सांद्रता विश्वसनीय मामलों के लिए बहुत कम भी उच्च और सी में हैं जबकि ilter, फ़िल्टर समुद्री जल का एक उपयुक्त राशि युक्त. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 8
चित्रा एक चट्टान-पानी के नमूने के विश्लेषण के उत्पादन प्रवाह cytometry 8. परिणाम. पैनल (ए) केवल साधन सेटिंग्स के साथ न्यूनतम पृष्ठभूमि को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल पीले-हरे रंग का फ्लोरोसेंट microspheres (0.75 माइक्रोन), के साथ आणविक ग्रेड पानी से पता चलता है. पैनल (बी) मोती अभी भी स्वपोषक के कई आबादी के साथ, एक ही स्थान में देखा जा सकता है कि ए नोट के रूप में समान सेटिंग्स और लेआउट के साथ चट्टान पानी के नमूने रन के उत्पादन को दर्शाया गया है. (सी) (बी), के रूप में ही नमूना. (डी) SYBR ग्रीन मैं उपयोग करने के साथ दाग प्रतिनिधि चट्टान-पानी के नमूने (सी) में स्थापित gating, कुल सूक्ष्म जीव मायने रखता है उत्पन्न कर रहे थे, और क्लोरोफिल autofluorescence द्वारा विभाजित परपोषी और स्वपोषी रोगाणुओं. (McDole एट अल. 4 देखें) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 9
चित्रा माइक्रोबियल metagenome डेटा 9. उदाहरण. माइक्रोबियल metagenomic अनुक्रम डेटा और साइट निर्भर चर के बीच पैटर्न्स. Synechococcus के यहाँ, रिश्तेदार बहुतायत Pelagibacter एसपीपी जबकि, मूंगा का प्रतिशत कवर के साथ सहसंबद्ध किया गया था. (पैनल छोड़ दिया) नहीं किया गया था. डीएनए की मरम्मत के लिए चयापचय मार्ग सभी metagenomes (सही पैनल) के बीच अनुरूप था जबकि conjugative हस्तांतरण के लिए चयापचय मार्ग सकारात्मक, नाइट्रेट सांद्रता के साथ सहसंबद्ध किया गया था. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

स्टार 7 CAR9
कुल संख्या के पुस्तकें 939311 591600
Preprocessed की संख्या में पुस्तकें 579664 360246
अनुक्रम की लंबाई मीन (बीपी) 395 ± 131 451 ± 159
एनोटेट दृश्यों (%) 42,218 (7.3%) 9117 (2.5%)
अज्ञात (%) 537446 (92.7%) 351129 (97.5%)

दक्षिणी रेखा द्वीप समूह, स्टारबक और मिलेनियम से उत्पन्न दो viromes की तालिका 1 डाटा विशेषताओं. एनोटेशन की डिग्री एमजी-RAST सर्वर का उपयोग blat पर आधारित है.

तालिका 2
एक अभियान के दौरान विभिन्न साइटों से डेटा दिखा तालिका 2. प्रतिनिधि परिणाम है. यहां का मूल्यांकन मापदंडों सूक्ष्म और वायरल abundances साथ रखा पानी रसायन शास्त्र माप शामिल हैं. तालिका आगे प्रत्येक नमूना स्थान के लिए संबंधित metagenomic डेटा पीडीएफ फाइल नाम शामिल हैं. कार्बन और अकार्बनिक पोषक तत्व सांद्रता μmol / एल में दिए गए हैं. कृपयाइस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत तरीकों जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में वायरल और माइक्रोबियल गतिशीलता की एक व्यापक मूल्यांकन उत्पन्न करने के लिए एक उपकरण प्रदान करेगा. वे माइक्रोबियल समुदायों के लिए उपलब्ध कार्बनिक और अकार्बनिक संसाधनों के खड़े शेयर यों और वायरल और माइक्रोबियल समुदाय वर्तमान का श्रृंगार चिह्नित करने के लिए लक्षित कर रहे हैं. अगला वायरल बहुतायत और माइक्रोबियल बहुतायत और बायोमास बढ़ाता, जीनोमिक अनुक्रम जानकारी उनके समुदाय संरचना और समारोह का पता चलता है. सभी तरीके विकसित या दूरदराज के क्षेत्र के स्थानों में आवेदन के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित किया गया है. हालांकि नियंत्रित प्रयोगशाला सेटिंग की कमी स्वाभाविक त्रुटियों के लिए कुछ संभावित बनाता है. यहाँ हम आकलन किया मापदंडों में से प्रत्येक के साथ जुड़े कुछ निरंतर चर्चा की. अगला संदूषण के लिए क्षमता के लिए नमूना दौरान भी विश्लेषणात्मक प्रक्रिया में त्रुटि के लिए संभावित उपज मापदंडों में से कुछ से निपटने.

भंग कार्बनिक कार्बन

कार्बन संदूषण (बहाव के नमूने, या एक नाव या गोताखोर के आसपास के क्षेत्र में), नमूना तैयार करने के दौरान (उपकरण या अनजाने से निपटने के प्रदूषण), और यहां तक ​​कि नमूने के भंडारण के दौरान (अन्य नमूने फ्रीजर में जैविक युक्त नमूना प्रक्रिया के दौरान हो सकता है सॉल्वैंट्स / वाष्पशील). प्रत्येक नमूने स्थानांतरण संदूषण का एक अतिरिक्त स्रोत बन गया है, के रूप में संभव के रूप में कुछ से निपटने के कदम के रूप में संदूषण आचरण की विभिन्न स्रोतों से बचने के लिए. नमूना नहीं एसिड धोया या combusted किसी भी वस्तु के संपर्क में नहीं होना चाहिए. अंत में, वाष्पशील कार्बनिक पदार्थों से युक्त नहीं नमूने के लिए विशेष रूप से एक भंडारण फ्रीजर designating अब भंडारण अवधि के दौरान नमूनों की अखंडता को सुनिश्चित करेगा. नमूने केंद्रित एचसीएल के साथ डॉक्टर के नमूने की एक विस्तारित यात्रा अवधि अम्लीकरण के दौरान जमी नहीं रखा जा सकता है (38-41 वर्णित) एक लागू विकल्प हो सकता है. माप सटीकता डॉक्टर आम सहमति संदर्भ सामग्री reg इस्तेमाल किया जाना चाहिए सत्यापित करने के लिएडॉक्टर माप दौरान ularly चलाता है. यह अपने डॉक्टर सामग्री 42 में बहुत स्थिर है के रूप में विशेष रूप से गहरे समुद्र में पानी (> 2,000 मीटर) संदर्भ विश्लेषणात्मक मशीन के प्रदर्शन का आकलन करने में मूल्यवान हैं.

पार्टिकुलेट कार्बनिक पदार्थ

जैविक कार्बन संदूषण से परहेज करने के अलावा, पोम नमूना फ़िल्टर की मात्रा की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है. 500 मिलीलीटर की लक्षित मात्रा किसी भी संभावित कारण हटना चाहिए तो यह बात निकाली थी जिसमें से छानना करने के लिए फिल्टर पर कब्जा कर लिया पोम की राशि संबंधित करने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए.

अकार्बनिक पोषक तत्वों

जैविक कार्बन नमूने के साथ के रूप में, ध्यान नावों या अपशिष्ट निर्वहन 12 जैसे विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न संभव पोषक नमूना संदूषण के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. 0.8 माइक्रोन का एक नाममात्र ताकना आकार के साथ कार्बनिक कार्बन नमूना लेने के लिए इस्तेमाल किया फिल्टर, सभी माइक्रोबियल बायोमास और श बाहर नहीं हो सकताould इसलिए इस निस्पंदन कदम के लिए 0.2 माइक्रोन फिल्टर करने के लिए परिवर्तित किया जाना. इसके अलावा, पता लगाने सीमा पोषक नमूनों के साथ एक समस्या खड़ी; विशेष रूप से कई मूँगे की चट्टान स्थानों (जैसे, Cotner एट अल. 43) के आसपास oligotrophic सतह पानी में. पता लगाने सीमा मोटे तौर पर लगभग 0.1, 0.2, और अमोनियम नाइट्रेट और नाइट्राइट, और ऑर्थो-फॉस्फेट के लिए 0.1 μmol / एल क्रमशः (36,12,37 देखें) कर रहे हैं

माइक्रोस्कोपी

माइक्रोस्कोपी स्लाइड से नमूने छवि विश्लेषण की एकाग्रता में बदलाव के अलावा आगे त्रुटियों के लिए संभावित पैदावार. उदाहरण के लिए, छवियों को देखने के क्षेत्र के कुछ क्षेत्रों में ध्यान से बाहर हो सकता है और दूसरों में ध्यान केंद्रित करने में कर सकते हैं. एक उच्च शुद्धता एल्यूमिना मैट्रिक्स फिल्टर एक बहुत कठोर फिल्टर प्रकार है, फिल्टर के तहत किसी भी मलबे पूरे फिल्टर स्लाइड करने के लिए एक कोण पर बैठने के कारण हो सकता है. नतीजतन, छवियों फिर से, किसी दिए गए फिल्टर के लिए देखने के क्षेत्र के विभिन्न भागों में ध्यान से बाहर लगातार हो सकता हैखुर्दबीन संरेखण के gardless. यह देखा गया है कि अगर फिल्टर के नीचे सुनिश्चित करने, फिल्टर remounting साफ है, इस उन्नति कर सकते हैं. इसके अलावा, कुछ मामलों में वायरस और रोगाणुओं पाया जा सकता है जिसमें दो फोकल विमानों हो सकता है. इस बढ़ते पर फिल्टर से अलग होता जा रहा है, और मायने रखता है अविश्वसनीय बना सकते हैं जो कवर पर्ची के नीचे करने के लिए ऊपर चल दाग वस्तुओं का परिणाम है. इसलिए यह हमेशा की प्रक्रिया के दौरान नमूनों की गुणवत्ता की जांच करने के लिए सिफारिश की है.

फ्लो

माइक्रोस्कोपी नमूनों के साथ के रूप में, स्वाभाविक रूप से विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के समायोजन की आवश्यकता होती है जो नमूने प्रवाह cytometry के बीच मतभेद होने वाली हो सकती है. उदाहरण के लिए, साधन की संवेदनशीलता पर निर्भर करता है, dimly fluorescing Prochlorococcus कोशिकाओं शोर के स्तर से नीचे हो सकता है और मात्रा निर्धारित नहीं किया जाएगा. मोती पुष्टि करने के लिए, जैसे एक आंतरिक नमूना नियंत्रण (के रूप में सेवा है कि साधन के respफ्लोरोसेंट संकेतों को onse दिन से दिन में संगत है (और चलाने के दौरान ही स्थिर रहता है). जाना जाता सांद्रता में नमूना करने के लिए जोड़ा है, वे भी नमूना मात्रा रन सत्यापित करने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं. हालांकि, यह हमेशा thawed और 96 अच्छी तरह से थाली रन के बीच से निपटने के नमूने के लिए एक अतिरिक्त जैविक नियंत्रण प्रदान करने के लिए ब्याज के नमूने के साथ दाग है कि एक पहले से जमे हुए "मानक" समुद्री जल के नमूने की एक विभाज्य चलाने की सिफारिश की है. स्थान के आधार पर, समुद्री जल के नमूने एक दूसरे से बहुत अलग दिख सकता है. "प्रतिनिधि" आबादी छंटनी और फिर एक epifluorescent खुर्दबीन (ईएम) के नीचे देखने के लिए जल्दी से या तो Synechococcus सपा. या संश्लेषक यूकेरियोट्स रूप पादप प्लवक आबादी को सत्यापित करने के लिए एक अच्छा तरीका हो सकता है. वे भी तेजी से नहीं हो पाती क्योंकि Prochlorococcus कोशिकाओं ईएम के तहत आम तौर पर दिखाई नहीं देते हैं. इसके अलावा एक, Synechococcus सपा क्लोरोफिल के लिए. भी पीएच होते हैंक्लोरोफिल ए (660-700 एनएम) की तुलना में कम तरंग दैर्ध्य (540-630 एनएम) पर प्रकाश का उत्सर्जन करता है जो otopigment phycoeurythrin (पीई),. Synechococcus कोशिकाओं नीला / हरी प्रकाश (470-490 एनएम) के साथ उत्साहित कर रहे हैं 510 एनएम नीचे प्रकाश के सभी तरंग दैर्ध्य को हटा कि एक उत्सर्जन फिल्टर के नीचे देखा, तो वे सुनहरा दिखाई देगा. प्रकाश की एक ही तरंग दैर्ध्य के साथ उत्साहित जब तुलना करके, यूकेरियोटिक अंश, लाल दिखेगा.

वायरल metagenomics

यह VLP एकाग्रता और भंडारण की प्रक्रिया बरामद समुदाय को प्रभावित करती है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. वायरल कण कम करने की प्रक्रिया में हर कदम पर हो सकता है, और इस प्रकार, वायरल शुद्धि और संवर्धन प्रोटोकॉल का चयन अंततः परिणामस्वरूप वायरल metagenomes 44,45,18 की मनाया वर्गीकरण संरचना और विविधता को प्रभावित कर सकते हैं. नमूनों की एकाग्रता TFF 19 या रासायनिक आधारित flocculation 20 का उपयोग किया जा सकता है. रासायनिक आधारित दृष्टिकोण, मंज़ूर मेंively लोहे के आयनों समाधान के बाहर गुच्छे में पड़ना और 8 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर ठीक किया जा सकता है कि बड़े (> 8 माइक्रोन) लोहे वायरल परिसरों के गठन स्वाभाविक रूप से नकारात्मक आरोप लगाया वायरल कणों बाँध का आरोप लगाया. इसके बाद लोहे वायरल कणों बंद chelated और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण 20 के लिए केंद्रित वायरल कणों छोड़ने, मैग्नीशियम, एस्कॉर्बिक एसिड, और EDTA का उपयोग फिर से भंग कर रहा है. इन दो मौजूदा तरीकों की तुलना के बाद, हम लोहा क्लोराइड विधि TFF वायरल एकाग्रता से खपत कम समय है, लेकिन कुछ निरंतर उपज हो सकती है कि संपन्न हुआ. हम लोहा वायरल की कि हदबंदी और विघटन पाया आवश्यकता है एक दो गुना विघटन एस्कॉर्बिक एसिड degrades से पहले आगे बढ़ने के लिए आदेश में रिपोर्ट 20 से अधिक केंद्रित मैग्नीशियम-एस्कॉर्बिक अम्ल-EDTA समाधान. एक तरफ इस मुद्दे से, प्रोटोकॉल 0.2 माइक्रोन निस्पंदन का उपयोग माइक्रोबियल contaminants को दूर करने, अकेले आकार-विभाजन से वायरल कणों शुद्ध. बड़े वायरस filt के माध्यम से पारित नहीं हैईआर (जैसे, यांग एट अल. 46) और इस प्रकार metagenome में पता नहीं होगा, कुछ बैक्टीरिया जबकि (McDole, अप्रकाशित डेटा). बड़े वायरस के खिलाफ भेदभाव है, जबकि यह जीवाणु संक्रमण में परिणाम है.

यही विशिष्ट मुद्दा हालांकि यह भी TFF एकाग्रता के सिलसिले में रोगाणुओं को हटाने के लिए प्रासंगिक है. क्लोरोफॉर्म उपचार बाह्य लिपिड झिल्लियों 47 के साथ क्लोरोफॉर्म के प्रति संवेदनशील वायरस को दूर करने के लिए दिखाया गया है जैसा कि कुछ अध्ययनों से 0.22 माइक्रोन निस्पंदन बैक्टीरिया के बहुमत को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सुझाव है. यह भी प्रस्तुत विधि में मुख्य रूप से जीवाणुभोजी, समुद्री वातावरण में आनुवंशिक सामग्री के सबसे प्रचुर वाहक है कि लक्ष्य पर ध्यान दिया जाना चाहिए. फेज आम तौर पर लगा रहे हैं क्योंकि न सामान्यतः वे क्लोरोफॉर्म उपचार के लिए प्रतिरोधी रहे लिपिड 48 को शामिल करने के लिए. हमारे ज्ञान करने के लिए एक "पकड़ सभी" विधि तारीख को मौजूद नहीं है. यहाँ प्रस्तुत विधि कहां से अनुकूलित हैआर्कटिक सिस्टम में उष्णकटिबंधीय फैले विभिन्न समुद्री वातावरण में पिछले 10 वर्षों से अनुसंधान क्षेत्र अनुभव.

माइक्रोबियल metagenomics

रोगाणुओं (यानी, जीवाणु और आर्किया) के लिए metagenomic पुस्तकालयों का निर्माण यह पुस्तकालय तैयारी के लिए आवश्यक न्यूनतम डीएनए सांद्रता उत्पन्न करने के लिए आसान है के रूप में वायरल metagenomes से अधिक सरल है. एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) पर आधारित linker प्रवर्धन बन्दूक पुस्तकालयों (LASLs) 17,49,50 और पूरे जीनोम प्रवर्धन अनुक्रमण के लिए पर्याप्त डीएनए उत्पन्न करने के लिए दो सबसे अधिक इस्तेमाल के तरीके हैं. माइक्रोबियल metagenomes में उच्च डीएनए सांद्रता प्राप्त करने के लिए एमडीए का उपयोग कभी कभी आवश्यक है. हालांकि इस तरह के dinoflagellate minicircles की overamplification के रूप में अनुक्रम डेटा में कलाकृतियों, पैदा कर सकता है. एमडीए तरीकों गैर मात्रात्मक परिणाम 51,52, जिसके परिणामस्वरूप को प्राथमिकता-एक असहाय और परिपत्र डीएनए बढ़ाना जाना जाता है. अनुकूलित LASLs 50 इस प्रकार सूक्ष्म और अनुक्रमण के लिए वायरल metagenomic डीएनए दोनों amplifying में एक बेहतर विकल्प के रूप में कार्य करता है हो सकता है दृष्टिकोण. यह LASLs दृष्टिकोण, कई कदम है परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता है, और dsDNA टेम्पलेट्स तक सीमित है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, ऊतक डीएनए निष्कर्षण किट ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक संघ दोनों से डीएनए निकालने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इसे प्रभावी ढंग से Lyse अड़ियल माइक्रोबियल taxa या उनके संबद्ध संरचनाओं को सत्यापित नहीं किया गया है (उदाहरण के लिए, कुछ आर्किया, endospores, या कवक spores) . इसलिए एक मनका पिटाई कदम निश्चित रोगाणुओं से डीएनए प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

ये व्यापक आकलन वायरल और माइक्रोबियल पारिस्थितिकी तंत्र के कामकाज को बेहतर ढंग से समझ में परिणाम होगा. कुछ अध्ययनों से सभी प्रस्तावित पैरामीटर का आकलन करने के लिए प्रयास किए गए हैं, कई चयनित लोगों की जांच की गई है. नेल्सन एट अल. 53 betw एक कनेक्शन का सुझाव दियाअपतटीय जल के सापेक्ष दोनों डॉक्टर और bacterioplankton सांद्रता में een विशिष्ट चट्टान निवास और depletions. ये एकाग्रता परिवर्तन bacterioplankton समुदायों के अलग differentiations के साथ थे. Dinsdale एट अल. 5 वृद्धि मानवीय प्रभाव सूक्ष्म कोशिकाओं और वायरस की तरह कणों की 10x उच्च abundances के साथ गया था कि पता चला है. बसे हुए द्वीपों के आसपास के समुद्री जल में सूक्ष्म समुदायों भी heterotrophs और संभावित रोगजनक 5 का बड़ा भिन्न था. अंत में McDole एट अल. 4 मानव गतिविधियों macrobes की कीमत पर, रोगाणुओं को ऊर्जा जा रहे हैं कि, microbialization स्कोर को शुरू करने से पता चला है. विशिष्ट सूक्ष्म और पानी रसायन शास्त्र मानकों पर ध्यान केंद्रित ये अध्ययन, समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों के जैव रासायनिक संरचना में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. तापमान और पीएच मान, मछली बायोमास और diversi तरह - पारिस्थितिकी तंत्र निगरानी प्रयासों के पारंपरिक डेटा का मेलTy, benthic कवर, या मानव प्रभाव के लिए जोखिम - पानी रसायन विज्ञान और सूक्ष्म आकलन के साथ, संभावना अधिक विशेष रूप से निशाना बनाया संरक्षण के प्रयासों को जन्म दे सकती है जो अधिक संवेदनशील पर्यावरण निगरानी प्रयासों का परिणाम देगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) Figure 1
Filtration setup Figure 1
32-36% Hydrochloric acid (HCl) Fisher Sci A508-212
High-density polyethylene (HDPE) container e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid
Combustion oven (550 °C)
60 ml HDPE vials  Fisher Sci 02-896-2B
25 mm GF/F filter Fisher Sci 09-874-64
Forceps  Fisher Sci XX62-000-06
Sterile, non-powdered gloves Fisher Sci 19-170-010B
Bilge pump  e.g., Thirsty Mate 124PF
20 L collapsible low-density polyethylene carboy e.g., Reliance Fold A Carrier II
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges Amersham CFP-2-E-9A
Platinum-cured silicon tubing for TFF Cole Parmer 96440-82
Hose clamps Cole Parmer P-68007-23
Peristaltic pump Cole Parmer EW-77410-10
Sodium hydroxide (NaOH) solution Electron Microscopy Sciences 21162
0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-61
8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-57
0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVGP01050
0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVHV010RS
Synthetic nylon mesh Sefar 03-125-37
20 ml Plastic scintillation bottle Fisher Sci 03-341-72C
Clean bucket (10-20 L)
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15714
25% Glutaraldehyde Electron Microscopy Science 16220
Liquid nitrogen
0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring  Fisher Sci 6809-6002
0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring Fisher Sci 6809-6022
10,000x SYBR Gold nucleic acid stain Invitrogen S11494
DAPI solution 25 µg/ml Invitrogen D1306
Molecular grade water sigma aldrich W-4502
Ascorbic acid Fisher Sci BP351-500
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Sci BP399-500
Glycerol Fisher Sci G31-500
Microscope slide Fisher Sci 12-550-123
Coverslip Fisher Sci 12-548-5M
Delicate task wipe  Fisher Sci 06-666A
Slide station with vacuum pump Figure 3
DNA extraction kit Macherey-Nagel 740952.1 Nucleospin tissue kit
Proteinase K (20 mg/ml) Lifetechnologies AM2546
200-proof Ethanol Electron Microscopy Sciences 15058
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler  Cole Parmer EW-45503-88
Cesium chloride (CsCl) Fisher Sci bp1595-500
60 ml Syringe Fisher Sci 13-6898
0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter Fisher Sci O992613
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Ultra-swinging bucket rotor Beckman Coulter 333790 SW41 Ti Rotor 
DNase I (100 units/µl) Calbiochem 260913
0.5 M EDTA Fisher Sci BP2482-500
Formamide Fisher Sci BP228-100
Glycogen sigma aldrich G-1767
1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 Fisher Sci BP2473-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Sci 02674-25
20 μg/ml Proteinase K Fisher Sci BP1700-500
Chloroform Fisher Sci BP1145-1
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 sigma aldrich p3803
Isopropanol Fisher Sci BP2618-500
50 ml Oak Ridge tube Fisher Sci 05-562-16B

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