Unraveling Unseen Spillere i havet - A Field Guide til Vannkjemi og Marine mikrobiologi

1Department of Biology, San Diego State University, 2Scripps Institution of Oceanography, University of California San Diego
Published 11/05/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Haas, A. F., Knowles, B., Lim, Y. W., McDole Somera, T., Kelly, L. W., Hatay, M., et al. Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology. J. Vis. Exp. (93), e52131, doi:10.3791/52131 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Her introduserer vi en rekke grundig testet og godt standardiserte forskningsprotokoller tilpasset for bruk i avsidesliggende marine miljøer. Prøvetakings protokoller inkluderer vurdering av tilgjengelige ressurser til det mikrobielle samfunn (oppløst organisk karbon, partikulært organisk materiale, uorganiske næringsstoffer), og en omfattende beskrivelse av de virale og bakterielle samfunn (via direkte viral og mikrobielle teller, telling av autofluorescent mikrober, og bygging av viral og mikrobielle metagenomes). Vi bruker en kombinasjon av metoder, som representerer en spredt felt av vitenskapelige disipliner omfatter allerede etablerte protokoller og noen av de nyeste teknikker utviklet. Spesielt metagenomic sekvense teknikker som brukes for virus- og bakteriesamfunnet karakterisering, er det etablert først i de senere årene, og er dermed fortsatt utsatt for kontinuerlig forbedring. Dette har ført til en rekke prøvetaking og utvalgets behandling prosedyrer kortstly i bruk. Settet av metoder som presenteres her gir en oppdatert tilnærming til å samle inn og behandle miljøprøver. Parametere adressert med disse protokollene gi minimum på informasjon som er viktig for å karakterisere og forstå de underliggende mekanismene for viral og mikrobielle samfunnet dynamikk. Det gir lett å følge retningslinjer for å gjennomføre omfattende undersøkelser og diskuterer kritiske trinn og potensielle begrensninger relevant for hver teknikk.

Introduction

Marine økosystemer er utsatt for et bredt spekter av forstyrrelser som fører til endringer fra næringsstoffer til biomassen av apex rovdyr. I løpet av det siste tiåret har flere studier vist betydningen av mikrobielle samfunn i marine økosystemer 1-4. Det er tydelig at endringer i bakteriell og viral samfunnet er nært forbundet med den generelle nedbrytning av marine miljøer 5. Disse endringene kan gjøres lettere ved endret geokjemi i vannsøylen som oksygen tilgjengelighet eller karbon remineralization 6,7. Som et resultat av den gjensidige avhengigheten mellom de makro, vannkjemi og mikrobiell aktivitet tilbakekoblingssløyfer kan akselerere hastigheten av degradering 8 økosystemet.

På 1970- og 80-tallet flere forsøk ble gjort for å løse biogeokjemiske sykluser i marine økosystemer 9-11. En av de viktigste utfordringene for disse tidlige studiene var mangelenav standardiserte metoder for å måle de vurderte biogeokjemiske parametre. Selv om det var protokoller tilgjengelig, først og fremst på sjøvanns næringsstoffer 12,13, ble vurderingen av karbondynamikken og mikrobiell samfunnsstruktur begrenset av de verktøy og metoder tilgjengelig. Med JGOFS EqPac metoder sammenligning, 14 Sharp et al., Foreslo for første gang en pålitelig og standardisert protokoll for oppløst organisk karbon (DOC) konsentrasjons vurderinger. Ved begynnelsen av 2000-tallet de analytiske utfordringer å avgjøre ressurser tilgjengelig for den mikrobielle samfunnet hadde dermed vært i stor grad løst og tilnærminger for å karakterisere mikrobielle samfunn i kontrollerte kulturmiljøer hadde blitt etablert (se DeLong 15). De tradisjonelle sekvenseringsmetoder på den tiden i stor grad støttet seg på dyrket klonale kulturer. Tidlig miljø gensekvensering av naturlige prøver viste imidlertid at flertallet av mikrobiell biodiversitet hadde vært savnet av Kulturasjon baserte metoder 16. I 2002 Breitbart et al. 17 brukte hagle sekvensering for første gang å beskrive viral samfunnet i miljøsjøvannsprøver etablere en metode for å sekvensere hele genomet til ukultur marine virus lokalsamfunn.

Innenfor de eksisterende mikrobielle vurderinger, virus fortsatt spesielt under-studert, som de fleste er vanskelige å dyrke og de mangler et universelt konservert markør som 16S ribosomalt RNA (rRNA) gener som vanligvis brukes for å vurdere mangfold og samfunnet profilering. Den metagenomic sekvense tilnærmingen gir et alternativ til kulturavhengig og gen-målrettede metoder for å analysere komplekse virus lokalsamfunn. Mens de første virale metagenomes generert fra sjøvann ble sekvensert med Sanger-sekvensering 17, har utviklingen av neste generasjons sekvensering teknologi og forbedrede molekylære teknikker førte til en rask økning i metagenomic studier 18 19-21.

Å videreutvikle det eksisterende kunnskap om virus, mikrobiologisk og biokjemisk funksjon i akvatiske økosystemer, sammenligne datasett i ulike systemer rundt om i verden er avgjørende. Imidlertid har de etablerte protokoller i stor grad blitt utviklet for kystnære miljøer med lett tilgjengelige laboratoriefasiliteter. Således mangelen på standardiserte feltmetoder hindrer disse kryss-økosystem sammenligninger. Her introduserer vi grundig testet og godt standardisert tilpasninger fra state of the art forskningsprotokoller for avsidesliggende felt steder. Har vist seg vellykket i flere studier som spenner over det siste tiåret 5,22 disse metodene, og brukes i dag av ulike marine laboratorier samt på NOAAReef Assessment and Monitoring Program (RAMP) i hele Stillehavet 4. Prøvetakings protokoller inkluderer vannkjemi parametere (uorganiske og organiske karbonkonsentrasjoner, uorganiske næringsstoffer konsentrasjon), viral og mikrobiell overflod (direkte bakterietall, direkte virus teller, og flowcytometri for å vurdere Autotrofi vs Heterotrofi prosenter), og viral og mikrobiell samfunnsstruktur og metabolsk potensial gjennom metagenomic Analyse (for en oversikt se figur 1). Resultatene fra de metodene som er beskrevet her resultatene er nødvendig for å belyse viktige biogeokjemiske bakgrunns parametere som trengs til omfattende karakter akvatiske økosystemer.

Protocol

1. Utarbeidelse av Instrumenter

  1. Utarbeidelse av Filtration Setup
    1. Tilbered en 5% saltsyre (HCl) løsning (0,5 til 0,6 M; 250 ml legge 32-36% HCl til 4,75 l destillert vann til å lage 5 liter endelig oppløsning). Lagre denne løsningen i en høy-tetthet polyetylen beholder (HDPE) i opp til 2 uker.
    2. La alle deler som kommer i kontakt med prøven (bortsett fra filtrene) i 24 timer i 5% HCl-oppløsning til å lekke ut potensielle oppløst organisk karbon (DOC) forurensninger. Etter hver prøvetaking hendelse skylle alle deler og skyll linjer med ca 30 ml 5% HCl løsning for å hindre karbon forurensning (for eksempel fra gass røyk, olje, båter, myggspray).
    3. Hold alle prøvetakings elementer innpakket i pre-forbrent aluminiumsfolie eller avkortet til å umiddelbart før bruk.
    4. Precombust 25 mm GF / F filtre innpakket i aluminiumsfolie i en muffelovn ved 550 ° C i 12 timer for å fordampe av alt karbon og lagre dem i en ren, tørrplassere inntil bruk. Bruk syre vasket tang og sterile, ikke-pulverisert hansker for å håndtere de precombusted filtre til alle tider.
  2. Utarbeidelse av Viral Metagenome Prøvetaking Materials
    1. Grundig vask fire 20 L sammen low-density polyethylene glassballonger og fire 20 L høy tetthet polyetylen bøtter og lokk med 10% blekemiddel.
    2. Deretter skyller alle elementer 3x med destillert og deretter prøvevann og forsegle glassballonger med kran.
    3. Vask Tangential Flow Filter (TFF) etter hver bruk i henhold til følgende protokoll, og rent preemptively hvis filteret ikke har vært brukt de siste fem dagene.
    4. Oppløs 50 g NaOH-pellets i 5 l vann i en vaskebøtten.
    5. Fest en våt TFF til røret og montere henhold til figur 3.
    6. Kjør peristaltisk pumpe ved ~ 30 rpm uten mottrykk for å bevege noen av NaOH-vaskeløsning gjennom systemet. Når vask renner fra returledningen, flytte transfer å vaske bøttefor å fullføre sirkulasjon av oppløsningen.
    7. Påfør mottrykk til systemet ved å plassere en klemme på returledningen nedstrøms av TFF. Dette vil tvinge vaskeoppløsning ut filtratet linje. Overdreven tid (5 min) for å oversvømme utsiden av TFF og produsere filtratet er en indikasjon på en degradert TFF.
    8. Kjøre systemet inntil alt NaOH-løsningen er i linjene. Deretter fjerner mottrykk, kjøre løsning ut av systemet og kast.
    9. Skyll TFF ved å kjøre vann under mottrykk inntil pH-verdien av vannet som strømmer fra retur og Filtratrørledningene er pH 7-8.
    10. Fjern slangen fra den peristaltiske pumpen og TFF. Tett TFF for lagring. Kontroller at TFF forblir vått til neste gangs bruk.

2. Prøvetaking

MERK: Under transport skal lagres alle innsamlede prøvene kule (hvis mulig 4 ° C) og ikke utsettes for direkte sollys før videre behandling.

  1. Samplingfor Carbon, Næringsstoffer, Mikros, flowcytometri, Mikrobielle metagenomikk
    1. Ta to Hatay Niskin enheter per sampling hendelse (noe som resulterer i 4 L prøvevann). Åpne utvalgsårene like før neddykking (ellers innestengt luft vil hindre synkende).
    2. På det aktuelle anlegget, spyle innsiden av prøvetagningsbeholderen med prøven vann ved å åpne begge ender og bevegelige sylinderen langs den polare akse gjennom vannet.
    3. Ta prøven og lukke nøye prøvetakingsbeholderen. Kontroller at målepunktet er oppstrøms fra båt og dykkere for å unngå forurensning.
  2. Prøvetaking for Viral metagenomikk
    1. På målstedet montere lensepumpe på 20 L carboy.
    2. Fyll opp carboy sikter lensepumpeinntaket på hver målrettede området og tetning carboy med tilsvarende stuss.
    3. Samle fire glassballonger av ufiltrert sjøvann (alle sammen 80 L) fra hvert prøvetakingssted.

3. Sample forberedelse

MERK: Prosess prøvene i den rekkefølgen som presenteres her, og starter med DOC for å minimere sjansen for forurensning. Bruk pudderfrie hansker for hele prosedyren.

  1. Løst organisk karbon (DOC)
    1. Mount en av de to alikvote Hatay Niskin enheter i respektive sliss av filtreringssettet. Koble utløpsrøret som fører til de respektive filterholderen. Koble trykkluft (0,2 bar) slangen til Hatay Niskin enheten (Se figur 2).
    2. Skyll alle linjer med 100 ml av prøven vann før du setter filtrene på filterholderne. Plasser 25 mm pre-forbrent GF / F filter i filterholderen ved hjelp av syre vasket tang. Skyll hver DOC flasken og hetten 3 ganger med ca 20 ml filtrert prøvetaking vann.
    3. Fyll flasken med ca 40 ml (~ 2/3 fulle) av prøvetaking vann. Samle minst duplikater av DOC prøver å ha en backup i tilfelle potensiell forurensning eller tap under transport.
    4. Freeze prøvetaking flasker stående oppreist ved -20 ° C inntil analyse.
  2. Partikkel Organic Matter (POM)
    1. Etter DOC prøvene har blitt samlet filtrering fortsetter inntil totalt 500 ml har passert GF / F-filter, inkludert det som passerte gjennom mens samle DOC prøver.
    2. Skru inline filterholderen.
    3. Fjern filteret for POM analyse ved hjelp av pinsett og sett filteret inne i en firkant av pre-forbrent aluminiumsfolie, brett top-side slått inn på seg selv, og pakk.
    4. Fryse filtre ved -20 ° C for lagring inntil underkastet elementæranalyse og isotopisk.
  3. Uorganiske næringsstoffer
    1. Plasser en 0,2 mikrometer Track-Etset filter hver filterholderen inn. Re-feste filterkassetter.
    2. Skyll hver 20 ml plast scintillasjon flaske tre ganger med prøvetaking vann. Fyll hver flaske til skulderen (~ 18 ml).
    3. Fryses ved -20 ° C inntil senere analyse.
  4. Microscopy (SYBR Gold og DAPI)
    1. Ta av filterholderen.
    2. Samle 1 ml vann i hver av to mikrosentrifugerør.
    3. Legg 66 ul 32% paraformaldehyd til en av aliquoter (for senere SYBR gullfarging). Tilsett 12 ul 25% glutaraldehyd til den tilsvarende andre (for senere DAPI-farging).
    4. Bland forsiktig, og la prøver å "fikse" i minst 15 min ved RT i mørket.
  5. Flowcytometrisystemer
    1. Plassere en 8,0 um polykarbonatfilter i en av filterholderne for å utelukke smuss og store eukaryote celler.
    2. Pass prøvetaking vann gjennom å fylle to cryovials fra hvert prøvetakingsstedet med 1 ml prøve.
    3. Tilsett 5 ul av 25% glutaraldehyd til hver kryoampulle (sluttkonsentrasjon = 0,125%).
    4. Snu hetteglass for å blande.
    5. La prøven å fikse for 15-30 min ved RT. Ikke overstige 30 min.
    6. Flash fryse prøvene i flytende nitrogen.
    7. Oppbevar prøver ved -80 ° C eller i LIQUId nitrogen tørr avsender til analyse på et flowcytometer.
  6. Mikrobiell Metagenomic Sample
    1. Fjern i linjefilterholdere.
    2. Direkte montere et 0,22 um filter sylindrisk på den respektive linje.
    3. Filter værende prøvevannet av både Hatay Niskin enheter fra hvert område (totalt 3-4 l pr filter) gjennom ett filter.
    4. Etter filtrering skyver den resterende vannet ut av hvert filter ved hjelp av en ren 10 ml sprøyte fylt med luft.
    5. Sett filteret tilbake i originalemballasjen og forsegle pakken med lab tape.
    6. Oppbevar individuelt pakket filtre ved -20 ° C.
  7. Viral Metagenomic Sample
    1. Overføre virus metagenome prøver umiddelbart inn de vasket bøtter for å sikre at ingen prøven er tapt eller er forurenset av miljøet.
    2. Pre-filter ved bruk av stor porestørrelse nylon mesh (25-100 um) for å fjerne rusk og cellulært materiale før konsentrasjon 19.
    3. Sett opp TFF som vist i figur 3, å plassere leveringslinje i en prøve bøtte, og forlater retur og filtrat linjer som går inn i en vask.
    4. Slå på peristaltisk pumpe og skyll linjer med 1-2 L av prøvevann.
    5. Plasser returledningen i utvalget bøtte for å fullføre syklusen, tilsett 0,7 bar mottrykk.
    6. Mens konsentrere sjøvannet, drops fyll prøve reservoar som nivået. Når vannstanden synker under sugeledning i bøtte, overføring konsentrat i et blekemiddel-vasket, triple skylles tripour beger og fortsette å konsentrere seg.
    7. Hvis reservoaret beger er tomt, fjerne mottrykk, øke pumpehastigheten og skyv hele utvalget gjennom linjene, utvinne den i tripour.
    8. Pass konsentratet gjennom 0,45 mikrometer sylindriske filtre for å fjerne de fleste bakterier mens ikke diskriminere noen virus linjene.
    9. Endre 0,45 mikrometer sylindriske filtre hver 150 ml. Samle 0,45 mikrometer-filgistrert viruskonsentrat i 50 ml rør.
    10. Legg 250 ul kloroform til hver 50 ml prøve av filtrert viruskonsentrat for å eliminere gjenværende bakterier. Invertere å blande, og lagre, oppreist ved 4 ° C inntil påfølgende behandling.
    11. Tørk 0,45 mikrometer filtre og lagre dem som beskrevet i trinn 3.6.5 og 3.6.6.

4. Behandling av Mikros Samples

MERK: Skyll filter tårn med 10% blekemiddel etterfulgt av 95% etanol for å unngå potensielle beis eller biologiske rester mellom kjøringer. Prosess mikroskop prøver innen 1 time og unngå å utsette flekker og farget filtrene til å lyse hvis mulig.

  1. Mount
    1. Tilsett 100 pl 10% askorbinsyre til 4,9 ml 1x PBS, og bland godt.
    2. Tilsett 5 ml 100% glyserol, og bland godt.
    3. Filter montere ved hjelp av en 0,02 mikrometer alumina matrise engangssprøyte filter, delmengde og oppbevar ved -20 ° C.
  2. SYBRGold Farging
    1. Pipetter en 500 ul alikvot av hver prøve ble fiksert med 2% sluttkonsentrasjon paraformaldehyd i et mikrosentrifugerør.
    2. Tilsett 0,5 mL av 1,000x SYBR Gold oppløsning til hver av tilsetningene.
    3. Bland prøven forsiktig og legg den i mørket i 10 min.
    4. Plasser en 0,02 mikrometer Aluminiumoksydmatriksen filter med ringformet polypropylen støttering på hvert filter stå av vakuumpumpe system og fest filter tårnene (figur 4). Kontroller at 0,02 mikrometer filter er plassert på filteret stå plast-siden opp, som disse filtrene har en dobbel porøsitet.
    5. Med vakuumpumpen slått av, tilsett 500 mL av SYBR farget prøven, sammen med 2 ml 0,02 mikrometer filtrert virus fritt vann for å sikre at prøven er spredt jevnt over filteret.
    6. Slå på vakuumpumpen for å skape et undertrykk på ikke mer enn 1 bar for å unngå skadelige virus og mikrober blir filtrert.
    7. Tillat hele prøven for å gågjennom.
    8. Bruk pinsett (ikke det samme paret som brukes til DOC), forsiktig fjerne hvert filter fra filtrering tårn, og passerer over en delikat oppgave tørk for å sikre at filteret er tørt.
    9. Pipetter 10 mL av mount på et objektglass og legg tørt filter inneholder farget prøven på slipp av mount.
    10. Tilsett 10 mL festet til toppen av hver filter før du legger et dekkglass.
    11. Trykk forsiktig dekk ned. Prøv å fjerne luftbobler hvis mulig og unngå sideveis bevegelse av dekkglass.
    12. Plasser lysbilde i en slidebox og oppbevar ved -20 ° C.
  3. DAPI Farging
    1. Plasser en 0,2 mikrometer Aluminiumoksydmatriksen filter med ringformet polypropylen støttering på hvert filter stativ og fest filter tårnene.
    2. Med vakuumpumpen slått av, tilsett 2 ml 0,02 mikrometer filtrert virus fritt vann til hvert tårn brukt.
    3. Pipette 1 ml av glutaraldehyd-fikserte prøve inn i hvert tårn, noe som resulterer i et totalvolum of 3 ml i hvert filter tårnet.
    4. Slå på vakuumpumpen for å skape et negativt trykk på ikke mer enn 1 bar.
    5. Filtrer hele prøven på 0,2 um filter aluminamatrise.
    6. Fjern forsiktig filteret fra filtrering tårnet med pinsett (ikke det samme paret som brukes til DOC).
    7. Plasser filteret på 100 ul dråpe DAPI-løsning [25 ug / ml] i en Petri-skål holde filteret høyre side opp og la prøven flekken i 15 min. Unngå lys under fargeprosessen.
    8. Etter 15 min, ta ut filteret fra flekken, passerer det over en delikat oppgave klut for å tørke og overføre til en 100 mL dråpe 0,02 mikrometer filtrert virus fritt vann, igjen holde filteret riktig vei, for å vaske av rester DAPI flekken i 1 min. Gjenta denne vaske gang.
    9. Mount filter på mikroskop skyv samme måte som beskrevet for SYBR Gold prøvene.

5. DNA Extraction

  1. Microbial Metagenomic DNA
    1. Tine de sylindriske filtrene i minst 20 min ved RT.
    2. Fjern eventuelle gjenværende sjøvann i filteret ved å bruke en 10 ml sprøyte. Cap den nedre enden av det sylindriske filteret ved hjelp av en bleket og autoklavert cap.
    3. For hvert filter, bland 360 ul T1 "pre-lysis" buffer og 50 pl proteinase K, og deretter pipettere blandingen inn i filteret. Cap åpen ende.
    4. Inkuber lyseringsreaksjon i en roterende ovn O / N (eller minst to timer) ved 55 ° C.
    5. Fjern en av lokket og tilsett 200 mL B3 "lysis" buffer inn i filteret til pre-lyse prøven. Re-cap-filter og inkubere blandingen i en roterende ovn i 10-20 min ved 70 ° C.
    6. Ekstraher den hele volumet fra det sylindriske filteret ved å bruke en 3 ml sprøyte ved å suge væsken ut med filteret opp ned.
    7. Utvise lysert prøven inn i et nytt mikrofuge-rør, og tilsett 200 ul av 100% etanol.
    8. Bland godt, legger hele utvalget på spinkolonne, og fortsett som instruert av produsentens protokoll.
    9. Kvantifisere DNA ved hjelp av en fluorescerende-baserte analysen.
  2. Marine Viral metagenomikk
    1. Rensende og Konsentrerer fagpartikler (modifisert fra Thurber et al. 19)
      1. Oppløs CsCl i sjøvann til å fremstille løsninger av 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (kalibrert ved å veie ut 1 ml oppløsning). Filtrer hver fraksjon med 0,02 um filter før bruk.
        MERK: Sørg for at tettheten av hver fraksjon er nøyaktig til tre viktige tall før du bruker løsningene og filtrere alle løsninger med en 0,02 mikrometer filter før bruk. Bruk av sjøvann eller sjøvann mettet med CsCl å senke eller øke tettheten, respektivt.
      2. Gjør et objektglass fra 1 ml kombinert reagenser som beskrevet i kapittel 4.2 for å sikre at alle reagenser er blottet for virus før du fortsetter.
      3. Legg 9 g CsCl til 45 ml av viruskonsentrat til TFFen endelig densitet på 1,12 g / ml. Kjøle mens du setter opp CsCl trinnet gradient.
      4. Fra og med den 1,7 g / ml oppløsning suksessivt legge 1 ml av hver sekvensielt mindre tett fraksjon langsomt inn i hvert rør ved hjelp av serologiske pipetter. Marker nivået på hvert enkelt menisk og sørge for at de pycnoclines mellom fraksjonene ikke blir forstyrret. For flere detaljer se følges papir (Lim et al. 2014).
      5. Med en serologisk pipette last 7,5 ml prøve til hver av seks rør og sentrifuger ved 83 000 xg ~, 4 ° C i 2 timer.
      6. Uten å forstyrre de tetthetsgradienter losse rotoren og stikke gjennom røret like under den tidligere merket 1,5 g / ml tetthet lag (figur 5) med en 18 G nål på en 3 ml sprøyte. Trekke ut 1,5 ml av rensede VLP og overføring til en ny mikrosentrifuge-rør. Gjenta for alle prøvene.
      7. Legg 0,2 volum av kloroform til de rensede VLP, bland kraftig, inkuber ved romtemperatur i 10 min.
      8. Legg 150 &# 181; l 10x DNAse buffer til hver mikrosentrifugerør.
      9. Spinn ved 16.000 xg i 5 min, og samle den vandige fase. Hvis den ikke gjør det samlede kloroform i bunnen av mikrosentrifugerør, tilsett mer DNAse buffer, bland og gjenta.
      10. Legg DNase I (endelig konsentrasjon = 2,5 enhet / mikroliter) og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer, deretter inaktivere DNase-aktivitet ved inkubering ved 65 ° C i 15 min.
    2. DNA Extraction fra Viral lignende partikler (VLP)
      1. Jevnt pool de rensede VLPene fra hver prøve i to rengjort og autoklaveres Oak Ridge rør.
      2. Tilsett 0,1 volum 2 M Tris-HCl (pH 8,5) med 0,2 M EDTA, 0,01 volum 0,5 M EDTA, 1 volum av formamid, 10 ul glykogen (10 mg / ml). Bland godt og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
      3. Med henvisning til nye volumet, tilsett 2 volumer RT 100% etanol. Bland og inkuber ved 4 ° C i mer enn 30 min.
      4. Pellet DNA ved å spinne Oak Ridge rør på 17 200 xg i 60 min, ved 4 & #176; C.
      5. Fjern supernatanten. DNA-pelleten vaskes to ganger med iskald 70% etanol ved bruk av serologiske pipetter.
      6. Fjern alle etanol (re-spinne kort hvis nødvendig), deksel, og tillater pellet å lufttørke ved RT i> 15 minutter.
      7. Resuspender pelleten for DNA> 15 min i 567 ul av 1 x TE-buffer (pH 8,0). Overfør 567 ul av de resuspenderte DNA inn i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      8. Tilsett 30 ul 10% SDS (pre-varm ved 65 ° C før bruk) og 3 ul proteinase K (20 pg / ml), blandes grundig og inkuberes i 1 time ved 56 ° C.
      9. Tilsett 100 mL av 5 M NaCl og bland godt. Legg 80 ul av forvarmet CTAB NaCl-oppløsning, vortex, og inkuber i 10 min ved 65 ° C.
      10. Legg 0,2 deler volum kloroform, virvelen, og sentrifugering ved 16.000 xg i 2 min. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      11. Legg like stort volum av fenol-kloroform isoamylalkohol 25: 24: 1 løsning, vortex å blande,og spinne ved 16.000 xg i 2 min. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      12. Legg like stort volum av kloroform, virvelen, og sentrifugering ved 16.000 xg i 2 min. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      13. Legg 0,7 volum av isopropanol til den overliggende fraksjon og inkuberes ved -20 ° C i minst 30 minutter for å utfelle DNA.
      14. Pelletere DNA ved spinning ved 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C. Pipetter av supernatanten og pelleten vaskes to ganger med 500 ul iskald 70% etanol.
      15. Spinn ved 16000 xg og fjerne den gjenværende etanol fra røret. Air-tørke pelleten i 15 min.
      16. Resuspender DNA-pellet med 50 ul elueringsbuffer (5 mM Tris, pH 7,5) eller Tris-EDTA pH 8,0 i minst 5 min ved RT.
      17. Kvantifisere DNA ved hjelp av høy følsomhet fluorescens-basert analyse.

Representative Results

Mikroskopi

Mikrosprøver kan og bør bli analysert umiddelbart for å sikre at de er av den ønskede kvalitet. For å måle overflod og størrelsesfordeling av bakteriesamfunnet, vil DAPI lysbilder bli undersøkt av epifluorescence mikroskopi (eksitasjon / emisjon: 358/461 nm, se McDole et al 2012). (Figur 6A). Celletall og dimensjoner kan samles ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer (f.eks ImagePro eller ImageJ). Fra lengde- og breddemålinger cellevolum (V) blir utledet ved å foreta antagelsen at alle celler som har form av sylindere med halvkuleformede hetter ved hjelp av følgende ligning:

V = π / 4 × w 2 (L - w / 3)

hvor L er lengden og w er bredden av hver celle 23,4. Mikrobiell biomasse kan da beregnes ved hjelp tidligere etablerte størrelse avhengige relasjoner for marine mikrobielle samfunn 24. Vanligvis marine bakterier varierer i lengde 0,1 til 4 pm, men gå opp til ~ 8 mikrometer i enkelte områder.

Mens filtrene (0,2 uM) farvet med DAPI vil bare vise bakterier, filtrene som brukes for SYBR Gold flekk (0,02 um) inneholder bakterier og virus. Måling av overflod av virus følger den samme protokollen som for mikrober, men en eksitasjon på 325 til 375 nm vil bli brukt, og emisjonsmaksimum ligger ved 537 nm (figur 6B).

For å generere kvantitative data volumsamplings kan trenge å bli justert, avhengig av den virale overflod i den opprinnelige prøven. Den korrekte volum for å filtrere er best bestemmes empirisk for en gitt vannlegeme. Eksempler på mikrografer som inneholder prøver med varierende konsentrasjoner virale er illustrert i figur 7.

Resultater fra tidligere studier tyder på at virus til mikrobeforhold (VMR) generelt variere fra 1 til 50 i akvatiske systemer 25-29, og i mellom 3 og 20, med et gjennomsnitt på omtrent 6 i korallsystemer (Knowles upubliserte data).

Flowcytometrisystemer

I tillegg til de direkte teller og størrelse estimering av den mikrobielle fellesskap, kan vurdering av forholdet mellom autotrofe til heterotrofe mikroorganismer via flowcytometri videre ekstraheres fra de innsamlede prøvene (eksemplarisk flowcytometri utgang gitt i Figur 8). For å bestemme det totale antallet bakterier celler, prøver farget med SYBR Grønn jeg og en fotomultiplikatorrør med et 530/30 båndpassfilter brukes til deteksjon. En kanal for klorofyll (rygg mot rygg LP speil som resulterer i en rekke 675-735 nm) og phycoerytherin (585/42 båndpassfilter) brukes til å telle overflod av autotrophs i ufargede prøver. For å bestemme overflod av heterotrofe mikrober, de autotrofe tellinger fra ikke-farget del blir deretter trukket fra SYBR-farget totalt teller (McDole et al. innsendt).

Viral metagenomikk

Viral metagenomikk benytter en kultur-uavhengig molekylær tilnærming til viral økologi, ved hjelp av total genomisk sekvens informasjonen til å bestemme samfunnsstruktur og funksjon. Metagenomikk har vært fremme vår forståelse av kompleksiteten og mangfoldet av virus samfunn på lokalt 17 til globalt nivå 30. Den siste utviklingen av et bredt utvalg av bioinformatiske verktøy for analyse av virale metagenomic data har gått ned beregningsflaskehalser, noe som åpner for en mer helhetlig syn på virosphere gjennom linsen av metagenomikk.

De fremgangsmåter som er presentert her fremheve isolering og anrikning av viruspartikler fra sjøvann ved bruk av en kombinasjon av pre-filtrasjon med stor porestørrelse nylonnett for å fjerne rusk og cellemateriale, konsentrasjonen avprøver med TFF (figur 3) og en etterfølgende 0,45 um filtrering for å fjerne større celler. Denne metoden produserer omtrent en 100x konsentrert prøve (figur 5B-5E) som tillater oss å utføre nedstrøms prosesser i mindre volumer. For å hindre vekst av eventuelle gjenværende mikrobielle celler i det virale lysat og derfor endringer i det virale overflod av prøven i løpet av den lange overføringstiden mellom feltstasjon og laboratorie, kloroform blir ofte tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 2% for lagring. Etter isolering og rensing av VLP-er, er epifluorescens mikroskopi med nukleinsyre-fargestoff så som SYBR Gull brukes for å bekrefte nærværet og renhet av de virale partikler (figurene 5B-5E).

Her presenterer vi to virus metagenomes fra Southern linje Island korallrev, spesifikt, Starbuck (Star7) og Millennium (CAR9, tidligere kjent som Caroline) øyer. Et totalt volum på 120 l sample vann ble samlet inn fra hvert område i en dybde på 10 meter og behandlet som beskrevet i avsnitt 3.7 og 5.2. De VLP renset fra cesiumklorid-gradient sentrifugering var 3,3 x 10 8 partikler / ml for CAR9 (figur 5D) og 2,9 x 10 9 partikler per ml for Star7 som bekreftet i henhold til metoden beskrevet i punkt 4 (figur 5B). Den totale mengde av DNA isolert fra disse prøvene var rundt 400 ng basert på Nanodrop måling. DNA ble amplifisert ved hjelp av Phi29 polymerase og sekvensert av Environmental Genomics Kjerne anlegget i 2011. Egenskapene til sekvensdata er presentert i Tabell 1. Basert på likheten søk ved hjelp av eksisterende databaser, majoriteten (> 70%) av sekvensene ofte havnet uncharacterized, dvs. ukjent opprinnelse og funksjoner. Tilsvarende de to viromes presenteres her presentert mer enn 97% av ukjente sekvenser. Som et resultat av ikke-databaseavhengig analyse ble brukt for analyse og åpnet opp en ny arm av forskningsmulighet på "mørk materie" i virus metagenomikk (Seguritan et al. in press).

Microbial metagenomikk

Analysen av mikrobielle metagenomes gjør det mulig for karakterisering av den mikrobielle fellesskap til stede, og den funksjonsbeskrivelse av disse miljøene. Eksempler inkluderer estimater av tilstedeværelse av patogener og virulens 5,22 eller sammenligninger mellom endringer i macrobial samfunnsstruktur eller tilgjengelige næringsstoffer og overflod av arter og deres dominerende metabolske veier (figur 9; Kelly et al 2014)..

Vannkjemi

Vannkjemi parametere generelt ta omfattende analytisk prosessering for å generere den ønskede data; prøver for DOC-analyse vil bli målt via høy temperatur katalytisk oksidasjon 31,32, partikkelformet organisk materiale (POM) via isotopforholdet massespektrometri koplet til en analysator elementært 33-35, og uorganiske næringsstoffer ved Flow Injection Analysis 36,12,37. Etter en vellykket gjennomføring av alle analysene, vil informasjonen som vist i tabell 1 være tilgjengelig for å komplettere den karakteriseringen av den mikrobielle og virale fellesskap. Denne informasjonen kan bli komplimentert med stabile isotopen prosenter av organisk karbon og nitrogen prøver (Se Haas et al. 35) og forholdstall mellom autotrophs og heterotrophs (McDole et al. Innsendt).

Figur 1
Figur 1. Oversikt over metodene som er beskrevet i protokollen delen. Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.

Figur 2
Figur 2. Utvalgets behandling riggoppsettet. Filtrerings oppsett introdusert her (skjematisk tegning igjen, selve bildet til høyre panel) er ikke nødvendigvis nødvendig for å generere prøvene, men vil fremskynde prosessen betraktelig. Oppsettet består av en bakplate, der de Hatay Niskin enheter (1) er montert. På uttaket vender nedover, er Hatay Niskin enheter koblet med silikonslanger til in-line filterholdere (2). Disse la samplet vann passerer gjennom de respektive filteret inn i HDPE prøvetaking hetteglass (3) montert rett under. Filtreringsprosessen akselereres gjennom trykksatt luft (4), og som reguleres med en trykkmåler (5). Et overløp bassenget hindrer søl vann under endring av HDPE flasker eller POM filtrering. Vennligstklikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Tangential strømsfilter formasjon (modifisert fra Thurber et al. 19). Nylonduk prøven filtrert vann blir pumpet fra reservoaret (1) via en peristaltisk pumpe (2) til en tangential strømningsfilter (3). De prøvevannet tilbake til beholderen (1) langs returrøret (4) i fravær av mottrykk. Når mottrykket blir tilført gjennom en slangeklemme (5) på returledningen, passerer vann gjennom filteret og blir kassert eller leveres til filtratet reservoaret (6). Prøve vann erstattes som det er konsentrert med filtratet linjen inntil alt vannet prøven er konsentrert i de slangeledninger.

Figur 4
Figur 4. objektglass filtrering oppsett.For å fordele DAPI og SYBR Gold farget prøvene på den respektive matrise alumina filter (1), filtre trenger å bli plassert i mellom filtertårnet (2) og stammen av filtreringsmanifold og fiksert med en klemme (4). En trykk regulert vakuum (5) vil fremskynde filtreringsprosessen (skjematisk tegning toppen, selve bildet nederst panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Rensing og konsentrering av fagpartikler. Total 1 ml av hver cesiumklorid densitetsgradient er lagvis oppå hverandre før fører den forbehandlede prøve (A). Hvert lag bør merkes på utsiden av røret for å lette utvinningen etter ultrasentrifugering. Røde pilen markerer hvor røret vil bli gjennomboret til exproselyttering VLP fraksjonen. (BE) Mikrografer av virale konsentrater: epifluorescens mikrografer på 0,45 mikrometer-filtrerte representative virale konsentrater av Star7 (B) og CAR9 (D). Store partikler, inkludert bakterieceller var synlig fra 0,45 pm-filtrater fra begge Star7 (B) og (D) CAR9 prøvene, mens det bare VLP (hvite piler) forblir etter at cesiumklorid-gradient-ultrasentrifugering; Stjerne 7 (C) og CAR9 (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Eksempel på DAPI og SYBR Gold mikroskopianalyse. Skjermbilde fra analysen av (A) DAPI og (B) SYBR Gold farget lysbilde eksempel. (A) Lengde og bredde (mm) av alle merkede partikler(= Mikrober) kan vurderes ved hjelp av en bildebehandlingsprogram. Legg merke til aggregering i midten av bildet. Disse klyngene må bli ekskludert fra senere analyse. (B) Under analyse virus og bakterier trenger å bli binned av størrelse terskler inn VLP og cellulære størrelse serier (VLP rødt, cellulær grønn). Merk at det er vanligvis noen svake VLPene Uncategorized av den respektive bildeprogrammet. Disse VLPene vises som svake hvite prikker må manuelt telles og legges til de automatiserte virus teller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Konsentrasjoner av SYBR Gold farget prøver. Mikrografer av en 0,02 alumina matrise filter inneholder ulike mengder SYBR farget virusprøver. Panel A viser afIlter som inneholder en passende mengde sjøvann filtrert, mens konsentrasjonene på filteret er vist i B er for høye og i C for lav for pålitelig teller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Resultater av flowcytometri analyse produksjon på et rev-vannprøve. Panel (A) viser molekylær grade vann bare med gul-grønne fluorescerende mikrosfærer (0,75 mikrometer), som brukes for å verifisere minimal bakgrunn med instrumentinnstillingene. Panel (B) viser resultatet av revet vannprøve kjøre med identiske innstillinger og oppsett som i A. Merk at perlene kan fortsatt sees på samme sted, sammen med flere bestander av autotrophs. (C) (B), som brukes til back-gate strømningscytometeret, målretting SYBR positive hendelser (autotrofe + heterotrof count) og minimere bakgrunn. (D) Representanten reef-vannprøve farget med SYBR Grønn I. hjelp gating etablert i (C), ble totalt mikrobe teller generert, og heterotrofe og autotrofe mikrober partisjonert av klorofyll autofluorescence (se McDole et al. 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. Eksempel på mikrobielle metagenome data. Mønstre mellom de mikrobielle metagenomic sekvensdata og steds avhengige variabler. Her er den relative overflod av Synechococcus Pelagibacter spp. ble ikke (venstre panel). Den metabolske veien for konjugerbare overføringen ble positivt korrelert med nitratkonsentrasjoner, mens den metabolske veien for DNA-reparasjon var konsistent mellom alle metagenomes (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Stjerne 7 CAR9
Totalt antall Leser 939311 591600
Antall preprocessed Leser 579664 360246
Mean Sequence Lengde (bp) 395 ± 131 451 ± 159
Kommenterte Sekvenser (%) 42 218 (7,3%) 9117 (2,5%)
Ukjent (%) 537 446 (92,7%) 351 129 (97,5%)

Tabell 1. Data karakteristikker av to viromes generert fra de sørlige Line Islands, Starbuck og Millennium. Graden av anmerkningen er basert på BLAT hjelp av MG-RAST server.

Tabell 2
Tabell 2. Representative resultater som viser data fra ulike steder i løpet av en ekspedisjon. De her vurderes parametrene inkluderer vannkjemi målinger forbundet med mikrobiell og virale abundances. Tabellen inneholder videre filnavn som henviser til de respektive metagenomic data for hver prøvetaking sted. Karbon og uorganiske næringsstoffer konsentrasjoner er gitt i umol / L. Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne tabellen.

Discussion

De metodene som presenteres her vil gi et verktøy for å generere en helhetlig vurdering av viral og mikrobielle dynamikk i akvatiske økosystemer. De er målrettet for å kvantifisere den stående bestanden av organiske og uorganiske ressurser tilgjengelig for mikrobielle samfunn og å karakter makeup av viral og mikrobielle samfunn stede. Ved siden av å kvantifisere viral overflod og mikrobiell overflod og biomasse, avslører genomisk sekvensinformasjon deres samfunn struktur og funksjon. Alle fremgangsmåter er blitt utviklet eller modifisert for å gi rom for anvendelse i fjernfelt steder. Men mangelen på kontrollerte innstillinger laboratorie skaper iboende visst potensiale for feil. Her diskuterer vi noen begrensninger knyttet til hver av parametrene vurderes. Ved siden av potensialet for forurensning ved håndtering av prøver noen av parametrene også gi muligheter for feil i den analytiske prosessen.

Oppløst organisk karbon

Carbonforurensning kan oppstå i løpet av samplingsprosedyrer (prøvetaking nedstrøms, eller i umiddelbar nærhet av en båt eller dykker), i løpet av prøvepreparering (forurensning av utstyr eller utilsiktet håndtering), og til og med under lagring av prøven (andre prøvene i fryseren inneholdende organiske løsemidler / FLYKTIGE). For å unngå de ulike forurensningskilder oppførsel så få stegene som mulig, som hver prøve flytting utgjør en ekstra kilde til forurensning. Prøven bør ikke komme i kontakt med noen element som ikke er syrevasket eller forbrennes. Til slutt vil utpeke en lagringsplass fryser utelukkende for prøver som ikke inneholder flyktige organiske stoffer sikre integriteten av prøvene ved langvarig lagring. Hvis prøvene ikke kan holdes frossen løpet av en lengre reise periode forsuring av DOC prøver med konsentrert HCl (som beskrevet 38-41) kan være et aktuelt alternativ. Hvis du vil kontrollere målenøyaktigheten DOC konsensusreferansemateriale bør brukes regularly under DOC målingen går. Spesielt dypt sjøvann (> 2000 m) referanser er verdifulle i å vurdere resultatene av den analytiske maskinen til det den er veldig stabil i sin DOC-innhold 42.

Partikkel Organic Matter

I tillegg til å unngå forurensning av organisk karbon, POM prøvetaking krever spesiell oppmerksomhet for å sikre nøyaktigheten av den filtrerte volum. Dersom målrettede volum på 500 ml bør avvike for enhver potensiell grunn dette må bemerkes å forholde mengden POM fanget på filteret til filtratet som den ble hentet.

Uorganiske næringsstoffer

Som med organisk karbon prøvetaking, må det tas hensyn til mulige nærings prøvekontaminering generert av ulike kilder som båter eller avløpsvann 12. Filtrene som brukes for organisk karbon prøvetaking med en nominell porestørrelse på 0,8 mikrometer, kan ikke utelukke all mikrobiell biomasse og shOuld derfor bli endret til 0,2 um filtre for dette filtreringstrinn. Videre deteksjonsgrenser utgjøre et problem med næringsprøver; spesielt i oligotrofe overflatevann rundt mange korallrev steder (f.eks Cotner et al. 43). Deteksjonsgrenser er omtrent rundt 0,1, 0,2 og 0,1 umol / L for ammonium, nitrat og nitritt, og orto-fosfat henholdsvis (se 36,12,37)

Mikroskopi

Ved siden av variasjoner i konsentrasjonen av prøvene bildeanalyse fra mikros glir videre gir potensial for feil. For eksempel kan bildene være ute av fokus i enkelte områder av synsfeltet, og i fokus i andre. Som et høyrent filter aluminamatrise er en meget stiv filtertype, kan en hvilken som helst rusk under filteret føre til at hele filteret for å sitte på en vinkel til sleiden. Som et resultat, kan bildene være konsekvent ute av fokus i ulike deler av synsfeltet for et gitt filter, regardless mikroskop justering. Remontering filtre, noe som sikrer at undersiden av filteret er rent, kan bøte på dette hvis det er observert. Også, i noen tilfeller kan det være to fokalplanene hvori virus og mikrober kan bli funnet. Dette er et resultat av fargede gjenstander løsner fra filteret ved montering, og flyter opp til undersiden av dekkglass som kan foreta tellinger upålitelig. Derfor er det alltid anbefalt å sjekke kvaliteten på prøvene i løpet av prosessen.

Flowcytometrisystemer

Som med de mikroskopi prøver, kan det være naturlig forekommende forskjeller mellom flowcytometri prøver som krever justeringer av den analytiske prosess. For eksempel, avhengig av følsomheten av apparatet, kan svakt Prochlorococcus celler som fluorescerer være under det støynivå, og vil ikke bli kvantifisert. Perler tjene som en intern prøvekontroll (f.eks, for å bekrefte at instrumentets response til fluorescerende signaler er konsekvent fra dag til dag (og forblir stabil under kjøringen i seg selv). Hvis tilsettes til prøven ved kjente konsentrasjoner, kan de også tjene som en intern kontroll for å verifisere at prøvevolum løp. Imidlertid er det anbefalt til alltid å kjøre en alikvot på en tidligere frosset "standard" sjøvannsprøven som blir tint og farget sammen med prøvene av interesse å tilveiebringe en ytterligere biologisk kontroll for prøvehåndtering mellom 96-brønners plate løper. Avhengig av plasseringen, kan sjøvannsprøver ser veldig forskjellige fra hverandre. Sortering "representative" populasjoner og deretter visning under en epifluorescent mikroskop (EM) kan være en god måte å raskt verifisere planteplankton populasjoner som enten Synechococcus sp. Eller foto eukaryoter. Prochlorococcus celler er vanligvis ikke synlig under EM fordi de visne for fort. I tillegg til klorofyll a, Synechococcus sp. Også inneholde photopigment phycoeurythrin (PE), som emitterer lys med kortere bølgelengder (540-630 nm) enn klorofyll A (660-700 nm). Når Synechococcus celler er begeistret med blå / grønt lys (470-490 nm), vil de vises golden hvis sett under en utslippsfilter som fjerner alle bølgelengder av lys under 510 nm. Til sammenligning vil den eukaryote fraksjon let rødt, når eksitert med den samme bølgelengden til lyset.

Viral metagenomikk

Det er viktig å merke seg at prosessen med VLP konsentrasjon og lagring påvirker fellesskap utvinnes. Viruspartikkelen tap kan oppstå på alle trinn i prosessen, og dermed kan valg av virus rensing og berikelse protokoller slutt påvirker den observerte taksonomiske sammensetningen og mangfoldet i de resulterende virus metagenomes 44,45,18. Konsentrasjon av prøvene kan gjøres ved hjelp TFF 19 eller kjemisk-baserte flokkulering 20. I den kjemiske-basert tilnærming, positheving belastet jernioner binder de naturlig negativt ladede virale partikler som danner store (> 8 um) jern-viral komplekser som flokkulerer ut av oppløsningen og kan utvinnes ved hjelp av 8 um filtre. Deretter jernet er chelatert av de virale partikler og re-oppløst ved hjelp av magnesium, askorbinsyre og EDTA, forlater konsentrerte viruspartikler for nukleinsyre-ekstraksjon 20. Etter å sammenligne disse to aktuelle metoder, konkluderte vi med at jernklorid metoden er mindre tidkrevende enn TFF viral konsentrasjon, men kan gi noen begrensninger. Vi fant at dissosiasjon og oppløsning av jern-viral krever en to-ganger mer konsentrert magnesium-askorbinsyre-EDTA-oppløsning enn rapportert 20 i rekkefølge for oppløsning for å fortsette før den askorbinsyre degraderes. Bortsett fra dette problemet, renser protokollen viruspartikler etter størrelse-fraksjone alene, fjerne mikrobielle forurensninger som bruker 0,2 mikrometer filtrering. Store virus ikke passerer gjennom filtER (f.eks Yang et al. 46) og vil således ikke bli detektert i det metagenome, mens noen bakterier (McDole, upubliserte data). Dette resulterer i bakteriell forurensning, mens diskriminerende mot store virus.

Det spesifikke problem er imidlertid også relevant for fjerning av mikrober i forbindelse med TFF konsentrasjon. Som kloroform behandling har vist seg å fjerne kloroform-sensitive virus med eksterne lipidmembraner 47 noen studier antyder at 0,22 um filtrering kan brukes for å fjerne de fleste bakterier. Det skal også bemerkes at den presenterte fremgangsmåten først og fremst er rettet mot bakteriofag, det mest tallrike bærer av genetisk materiale i marine miljøer. Fordi fagen er generelt antatt ikke å inneholde vanlig lipider 48 de er mer motstandsdyktige mot kloroform behandling. Så vidt vi vet en "catch-all" metoden ikke eksisterer til dags dato. Metoden som presenteres her er tilpasset fra our felterfaring i løpet av de siste 10 årene i ulike marine miljøer som spenner over tropisk til arktisk systemer.

Microbial metagenomikk

Byggingen av metagenomic biblioteker for mikrober (dvs. bakterier og Archaea) er mer oversiktlig enn virale metagenomes som det er lettere å generere minimal DNA-konsentrasjoner som kreves for biblioteket forberedelse. Linker forsterkning hagle biblioteker (LASLs) 17,49,50 og hele genomet forsterkning basert på multiple forskyvning forsterkning (MDA) er de to mest brukte metoder for å generere tilstrekkelig DNA for sekvensering. Bruken av MDA å oppnå høyere konsentrasjoner i DNA-mikrobielle metagenomes er noen ganger nødvendig. Dette kan imidlertid føre til artefakter i sekvensdataene, for eksempel overforsterking av dinoflagellat minicircles. MDA fremgangsmåter er kjent for å forsterke fortrinnsvis enkelt-trådet og sirkulært DNA, noe som resulterer i ikke-kvantitative resultater 51,52. Den optimaliserte LASLs nærmer 50 kan dermed fungerer som et bedre alternativ i å forsterke både mikrobiell og viral metagenomic DNA for sekvensering. Det er viktig å merke seg at LASLs tilnærmingen har flere trinn, krever sofistikert utstyr, og er begrenset til dsDNA-maler. Videre har vevet DNA-ekstraksjon kit vist seg å trekke ut DNA fra både Gram positive og Gram negative phyla, men det har ikke blitt bekreftet å effektivt Lyse trassig mikrobiell taxa eller tilhørende strukturer (f.eks viss archaea, endospores eller soppsporer) . Derfor er en vibrerende kuletrinn kan være nødvendig for å oppnå DNA fra visse mikrober.

Disse omfattende vurderinger vil føre til en bedre forståelse av viral og mikrobiell økosystemet. Selv om få studier har påtatt seg arbeidet med å vurdere alle foreslåtte parametere, mange har vært etterforsket utvalgte. Nelson et al., Foreslo en 53 forbindelse kroneen bestemt rev habitater og nedbryting av både DOC og bacterioplankton konsentrasjoner i forhold til offshore farvann. Disse konsentrasjons endringer ble ledsaget av forskjellige differensieringer av bacterioplankton lokalsamfunn. Dinsdale et al. 5 viste at økt menneskeskapt påvirkning ble ledsaget av 10x høyere Forekomsten av mikrobielle celler og viruslignende partikler. Mikrobielle samfunn i marine farvannene rundt bebodde øyene hadde også større fraksjoner av heterotrophs og potensielle patogener 5. Endelig McDole et al. 4 viste, ved å innføre den microbialization stillingen, at menneskelige aktiviteter er skiftende energi til mikrobene, på bekostning av de macrobes. Disse studiene, rettet mot ulike mikrobielle og vannkjemi parametere, gi ny innsikt i den biokjemiske struktur av marine økosystemer. Kombinerer tradisjonelle data av økosystemet overvåking innsats - som temperatur og pH-verdier, fiskebiomasse og diversity, bentiske cover, eller eksponering for menneskelig påvirkning - med vannkjemi og mikrobielle vurderinger, vil trolig føre til mer sensitive miljøovervåking innsats, noe som kan føre til mer målrettede naturvernarbeid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) Figure 1
Filtration setup Figure 1
32-36% Hydrochloric acid (HCl) Fisher Sci A508-212
High-density polyethylene (HDPE) container e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid
Combustion oven (550 °C)
60 ml HDPE vials  Fisher Sci 02-896-2B
25 mm GF/F filter Fisher Sci 09-874-64
Forceps  Fisher Sci XX62-000-06
Sterile, non-powdered gloves Fisher Sci 19-170-010B
Bilge pump  e.g., Thirsty Mate 124PF
20 L collapsible low-density polyethylene carboy e.g., Reliance Fold A Carrier II
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges Amersham CFP-2-E-9A
Platinum-cured silicon tubing for TFF Cole Parmer 96440-82
Hose clamps Cole Parmer P-68007-23
Peristaltic pump Cole Parmer EW-77410-10
Sodium hydroxide (NaOH) solution Electron Microscopy Sciences 21162
0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-61
8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter Fisher Sci 09-300-57
0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVGP01050
0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter Fisher Sci SVHV010RS
Synthetic nylon mesh Sefar 03-125-37
20 ml Plastic scintillation bottle Fisher Sci 03-341-72C
Clean bucket (10-20 L)
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15714
25% Glutaraldehyde Electron Microscopy Science 16220
Liquid nitrogen
0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring  Fisher Sci 6809-6002
0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring Fisher Sci 6809-6022
10,000x SYBR Gold nucleic acid stain Invitrogen S11494
DAPI solution 25 µg/ml Invitrogen D1306
Molecular grade water sigma aldrich W-4502
Ascorbic acid Fisher Sci BP351-500
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Sci BP399-500
Glycerol Fisher Sci G31-500
Microscope slide Fisher Sci 12-550-123
Coverslip Fisher Sci 12-548-5M
Delicate task wipe  Fisher Sci 06-666A
Slide station with vacuum pump Figure 3
DNA extraction kit Macherey-Nagel 740952.1 Nucleospin tissue kit
Proteinase K (20 mg/ml) Lifetechnologies AM2546
200-proof Ethanol Electron Microscopy Sciences 15058
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler  Cole Parmer EW-45503-88
Cesium chloride (CsCl) Fisher Sci bp1595-500
60 ml Syringe Fisher Sci 13-6898
0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter Fisher Sci O992613
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344059
Ultra-swinging bucket rotor Beckman Coulter 333790 SW41 Ti Rotor 
DNase I (100 units/µl) Calbiochem 260913
0.5 M EDTA Fisher Sci BP2482-500
Formamide Fisher Sci BP228-100
Glycogen sigma aldrich G-1767
1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 Fisher Sci BP2473-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Sci 02674-25
20 μg/ml Proteinase K Fisher Sci BP1700-500
Chloroform Fisher Sci BP1145-1
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 sigma aldrich p3803
Isopropanol Fisher Sci BP2618-500
50 ml Oak Ridge tube Fisher Sci 05-562-16B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuhrman, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature. 399, (6736), 541-548 (1999).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, (10), 782-791 (2007).
  3. Huber, J. A., et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science. 318, (5847), 97-100 (2007).
  4. McDole, T., et al. Assessing coral reefs on a Pacific-wide scale using the microbialization score. PloS ONE. 7, (9), (2012).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Microbial ecology of four coral atolls in the Northern Line Islands. PloS ONE. 3, (2), (2008).
  6. Nelson, C. E., et al. Coral and macroalgal exudates vary in neutral sugar composition and differentially enrich reef bacterioplankton lineages. The ISME Journal. 7, (5), 962-979 (2013).
  7. Haas, A. F., et al. Influence of coral and algal exudates on microbially mediated reef metabolism. PeerJ. 1, (2013).
  8. Smith, J. E., et al. Indirect effects of algae on coral: algae‐mediated, microbe‐induced coral mortality. Ecology Letters. 9, (7), 835-845 (2006).
  9. Burdige, D. J., Martens, C. S. Biogeochemical cycling in an organic-rich coastal marine basin: 10. The role of amino acids in sedimentary carbon and nitrogen cycling. Geochimica et Cosmochimica Acta. 52, (6), 1571-1584 (1988).
  10. Capone, D. G., Kiene, R. P. Comparison of microbial dynamics in marine and freshwater sediments: Contrasts in anaerobic carbon catabolism. Limnology and Oceanography. 33, (4), 725-749 (1988).
  11. Krom, M. D., Sholkovitz, E. R. Nature and reactions of dissolved organic matter in the interstitial waters of marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 41, (11), 1565-1574 (1977).
  12. Grasshoff, K. Methods of sea-water analysis. Verlag Chemie. Weinheim and New York. (1976).
  13. Strickland, J. D. Practical handbook of seawater analysis. Bulletin Fisheries Research Board of Canada. 167, (1968).
  14. Sharp, J. H., et al. Analyses of dissolved organic carbon in seawater: the JGOFS EqPac methods comparison. Marine Chemistry. 48, (2), 91-108 (1995).
  15. DeLong, E. F. Microbial population genomics and ecology. Current Opinion in Microbiology. 5, (5), 520-524 (2002).
  16. Hugenholz, P., Goebel, B. M., Pace, N. R. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. Journal of Bacteriology. 180, (18), 4765-4774 (1998).
  17. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  18. Willner, D., Hugenholtz, P. From deep sequencing to viral tagging: Recent advances in viral metagenomics. BioEssays. 35, 436-442 (2013).
  19. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4, 470-483 (2009).
  20. John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports. 3, 195-202 (2011).
  21. Lim, Y. W., et al. The Microbiome and Virome of CF. Pediatric Pulmonology. 47, 321-322 (2012).
  22. Kelly, L. W., et al. Black reefs: iron-induced phase shifts on coral reefs. The ISME Journal. 6, (3), 638-649 (2012).
  23. Bjornsen, P. K. Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis. Applied Environmental Microbiology. 51, 1199 (1986).
  24. Simon, M., Azam, F. Protein content and protein synthesis rates of planktonic marine bacteria. Marine Ecology Progress Series. 51, (3), 201-213 (1989).
  25. Hara, S., Koike, I., Terauchi, K., Kamiya, H., Tanoue, E. Abundance of viruses in deep oceanic waters. Marine Ecology Progress Series. 145, (1), 269-277 (1996).
  26. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, (1), 69-114 (2000).
  27. Weinbauer, M. G., Brettar, I., Hofle, M. G. Lysogeny and virus-induced mortality of bacterioplankton in surface, deep, and anoxic marine waters. Limnology and Oceanography. 48, (4), 1457-1465 (2003).
  28. Clasen, J. L., Brigden, S. M., Payet, J. P., Suttle, C. A. Evidence that viral abundance across oceans and lakes is driven by different biological factors. Freshwater Biology. 53, (6), 1090-1100 (2008).
  29. Parada, V., Baudoux, A. C., Sintes, E., Weinbauer, M. G., Herndl, G. J. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal. 2, (9), 924-936 (2008).
  30. Angly, F. E., et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biology. 4, (11), (2006).
  31. Hansell, D. A., Carlson, C. A. Deep ocean gradients in dissolved organic carbon concentrations. Nature. 263, (266), (1998).
  32. Carlson, C. A., et al. Dissolved organic carbon export and subsequent remineralization in the mesopelagic and bathypelagic realms of the North Atlantic basin. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. 57, (16), 1433-1445 (2010).
  33. Sharp, J. H. Improved analysis for particulate organic carbon and nitrogen from seawater. Limnology and Oceanography. 19, (6), 984-989 (1974).
  34. Ehrhardt, M., Koeve, W. Determination of particulate organic carbon and nitrogen. Methods of Seawater Analysis. Third Edition, 437-444 (2007).
  35. Haas, A. F., et al. Organic matter release by coral reef associated benthic algae in the Northern Red Sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 389, (1), 53-60 (2010).
  36. Guildford, S. J., Hecky, R. E. Total nitrogen, total phosphorus, and nutrient limitation in lakes and oceans: Is there a common relationship. Limnology and Oceanography. 45, (6), 1213-1223 (2000).
  37. Allison, S. D., Chao, Y., Farrara, J. D., Hatosy, S., Martiny, A. C. Fine-scale temporal variation in marine extracellular enzymes of coastal southern California. Frontiers in Microbiology. 3, (2012).
  38. Van Duyl, F. C., Gast, G. J. Linkage of small-scale spatial variations in DOC, inorganic nutrients and bacterioplankton growth with different coral reef water types. Aquatic Microbial Ecology. 24, (1), 17-26 (2001).
  39. De Goeij, J. M., Van Duyl, F. C. Coral cavities are sinks of dissolved organic carbon (DOC). Limnology and Oceanography. 52, (6), 2608-2617 (2007).
  40. De Goeij, J. M., et al. Major bulk dissolved organic carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges. Marine Ecology Progress Series. 357, 139-151 (2008).
  41. Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9, (2), (2014).
  42. Carlson, C. A., Ducklow, H. W., Hansel, D. A. Organic carbon partitioning during spring phytoplankton blooms in the Ross Sea polynya and the Sargasso Sea. Oceanography. 43, (3), 375-386 (1998).
  43. Cotner, J. B., et al. Nutrient limitation of heterotrophic bacteria in Florida Bay. Estuaries. 23, (5), 611-620 (2000).
  44. Willner, D., et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108, (1), 4547-4553 (2011).
  45. Hall, R. J., et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods. 195, 194-204 (2013).
  46. Yang, S. Y., et al. Nanoporous membranes with ultrahigh selectivity and flux for the filtration of viruses. Advanced Materials. 18, (6), 709-712 (2006).
  47. Feldman, H. A., Wang, S. S. Sensitivity of various viruses to chloroform. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106, (4), 736-738 (1961).
  48. Ackermann, H. W. The Bacteriophages., Second Edition. Calendar, R. Oxford University Press. New York. 8-16 (2006).
  49. Henn, M. R., et al. Analysis of High-Throughput Sequencing and Annotation Strategies for Phage Genomes. PLoS ONE. 5, (2), (2010).
  50. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14, (9), 2526-2537 (2012).
  51. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nature Methods. 7, (12), 943-944 (2010).
  52. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification Methods Bias Metagenomic Libraries of Uncultured Single-Stranded and Double-Stranded DNA Viruses. Applied Environmental Microbiology. 77, (21), 7663-7668 (2011).
  53. Nelson, C. E., Alldredge, A. L., McCliment, E. A., Amaral-Zettler, L. A., Carlson, C. A. Depleted dissolved organic carbon and distinct bacterial communities in the water column of a rapid-flushing coral reef ecosystem. The ISME Journal. 5, (8), 1374-1387 (2011).
  54. Kelly, L. W., et al. Local genomic adaptation of coral reef-associated microbiomes to gradients of natural variability and anthropogenic stressors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (28), 10227-10232 (2014).
  55. Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats