多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル:のノックダウン

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Huang, L., Xiao, A., Wecker, A., McBride, D. A., Choi, S. Y., Zhou, W., Lipschutz, J. H. A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys. J. Vis. Exp. (94), e52156, doi:10.3791/52156 (2014).

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Abstract

Introduction

ゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ )胚は広く腎臓発生および多発性嚢胞腎疾患を研究するためのモデルとして使用されている。遺伝的相互作用を研究することの実現可能性、タンパク質のノックダウン、迅速胚の多数のアッセイの機会、および器官の表現型を表示するのを容易にするためのアンチセンスモルフォリノ(MO)を使用する能力:動物モデルとしてゼブラフィッシュを使用することには多くの利点がある幼虫1を生きて。前腎 ​​は脊椎動物で開発した最初の腎臓で、幼虫のゼブラフィッシュ2で機能的である。ゼブラフィッシュ前腎の構造は哺乳類の後腎、哺乳動物で開発するための3番目と最後の腎臓に比べて比較的簡単である。ネフロンが困難単一ネフロンの構造を観察すること、500,000-1,000,000ネフロン3,4及び約13000ネフロン5をそれぞれ有するマウス腎臓の間にそれぞれ含むヒト腎臓を、腎臓の作業単位でのinは、ヒトまたはマウスの腎臓。ゼブラフィッシュは2ネフロンがあり、各ゼブラフィッシュネフロンは、マウスとヒト6と類似した特殊な腎細胞型の糸球体と尿細管で見つかったすべての主要なコンポーネントが含まれています。それはクローズドシステム7を有しているので、このようなアフリカツメガエルなどの他の脊椎動物のモデルと比較すると、ゼブラフィッシュネフロンはより密接に哺乳類のネフロンに似ている。

近年では、ゼブラフィッシュのゲノムは、遺伝的なツール、広範な変異リソース、およびゼブラフィッシュモデルにおけるトランスジェニックレポーターラインのコレクションの幅広い導入を可能にする、配列決定されている。 12-72時間後に受精(ゼブラ)との間のゼブラフィッシュの前腎形態は透明な胚で容易に可視化することができる。ウィルムス腫瘍タンパク質WT1は、腎臓の開発のために不可欠な要素である。 wt1bプロモーターのTg(wt1b:GFP)の制御下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインはGFPのexpreを示すssionは、具体的には17 HPF 8から始まる、ゼブラフィッシュ胚で前腎領域に位置する。 Nephronophthisis(NPHP)、常染色体劣性嚢胞腎疾患は、NPHP遺伝子9の突然変異によって引き起こされる。モルホリノによるノックダウンNPHP4はTgは(wt1b:GFP)で嚢胞形成を引き起こした。魚10したがって、このトランスジェニック魚は腎臓開発中に腎臓の構造と嚢胞形成を観察するのに適したモデルです。重要なのは、腎臓発生の調節因子の影響は、時間と労力効率的な方法でこの株を使用して研究することができる。

遺伝子変調後の腎嚢胞形成を可視化するモデルとして魚私たちの論文は、Tgは(GFP wt1b)の使用が記載されている。我々はゼブラフィッシュにおけるWNT5A遺伝子をノックダウンするスタート-とスプライス部位アンチセンスMOを使用。 Wnt5aのは、様々な器官および細胞出生後の発達に重要な役割を果たしているWntファミリーの非標準的な分泌糖タンパク質である機能11。 Wnt5aのは、尿細管伸長時の指向細胞分裂において役割を果たしていることが見出されている平面内細胞極性(PCP)経路を含む非カノニカルWnt経路を介して機能する。 Wnt5aのはさらに、それによってVangl2安定性12を推進 、VANGL平面細胞極性タンパク質2(Vangl2)と複合体を形成することにより、Wnt5aのシグナルを伝達するチロシンキナーゼ(RYK)のような受容体と複合体を形成することによってWntシグナル/ PCP経路を調節する。 PCP経路における欠陥は、ランダムな細胞分裂を生じ、腎嚢胞形成を引き起こす可能性があります。 WNT5Aノックダウン以下の腎嚢胞形成を観察するためにゼブラフィッシュの行私たちは、Tgは(GFP wt1b)を使用した。 Tgは(wt1b:GFP)ゼブラフィッシュモデルは、ライブイメージングと腎臓の構造のタイムリーな観察 ​​を可能にする。 WNT5Aノックダウンした後、腎嚢胞形成は24 HPFから始まる発見された。 72 HPFで、嚢胞は糸球体と近位尿細管で見つけることができた。この方法は、sに使用することができる腎嚢胞形成を引き起こす可能性のある他の遺伝子をcreen。

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Protocol

注:倫理に関する声明:すべてのゼブラフィッシュの実験は、イースタンバージニアメディカルスクールの施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1.モルホリノ準備

  1. 図1A)を製造者の指示に従って、目的の遺伝子のための設計と合成する翻訳ブロッキング(AUG-)及びスプライス抑制(スプライス)アンチセンスモルホリノ(MO)オリゴヌクレオチド。 表1に、メーカーの情報を参照してください。
    注:MOは、ガラスびんで凍結乾燥されたストックとして出荷されています。
  2. 25μgの/μlの最終濃度にMOを再懸濁するためにガラス瓶にハイグレードの滅菌水を追加します。オリゴヌクレオチドが完全に溶解していることを確認します。いくつかの固体のままの場合は、簡単に5から10分であり、渦65℃で株式オリゴヌクレオチド溶液を含むバイアルを加熱し。
  3. RTでMO原液を保管してください。 4℃または-20℃で保管しないでください。; Cより低い温度がMOオリゴヌクレオチドは容器壁にバインドするために発生する可能性があるため。分光光度計を用いてストック溶液の濃度を測定する新しいMOストック溶液が作成されるたびに( 表1を参照)。
  4. 所望の投与量にハイグレードの滅菌水を用いて原液を希釈することによって、注射の日に、MO作業溶液を準備します。 0.05%の濃度になるように0.5%フェノールレッドを追加する。たとえば、15 NG / NLの濃度の5μlのワーキング溶液を作るために、3μLMO原液と0.5μlの0.5%フェノールレッド水1.5μlに追加します。
    注:この作業濃度では、注入の各ドロップ(500 PL)はMOの7.5 ngのが含まれており、2滴は、MOの15 ngのが含まれている。

射出装置の調製

  1. 購入ガラス事前に引っ張ら針(詳細は表1を参照してください)。あるいは、ガラス注射針w iを引くニードルプラーを番目。
  2. 空気圧縮機の電源を入れ、50 PSIへの圧力設定を調整します。解剖顕微鏡の光源とピコマイクロインジェクションポンプの電源を入れ、次のように設定を調整:圧力20 PSIを保持、圧力10 PSI、ゲーティングの2.5と100マイクロ秒の範囲の期間値を取り出す。
  3. 注射液5μlのガラスプレ引っ張ら針をロードし、先端が下向きに垂直な位置に針を置く。すべてのソリューションは、目に見える気泡がで針の先端に到達するまで待ちます。顕微鏡の隣に適切な位置に針ホルダーを配置し、ホルダーにガラス針を挿入します。 45度に噴射角度を調整します。
  4. 高段オフ、顕微鏡下でビューに針の先端を持参し、先端の最も薄い地域に焦点を当てる。細かい点をピンセットで針の先端を折ります。
  5. 顕微鏡下側0.15 mmの側の内径定規と毛細管を配置し、液柱を作るために、キャピラリーチューブの一端に溶液を注入する。 1ミリメートル長液柱あたりのすべての17滴に到達するためにイジェクト時間を調整し、その後すべての滴の体積は1 NL滴の(滴体積=πX半径長さ(液柱の)/数()である。
    NOTE:直径0.1mmの低下は約500 plの(滴体積= 4/3 xはπxの半径3)の注入量を与える。

モルフォリノ3.受精ゼブラフィッシュ胚の作製と注入

  1. 標準のゼブラフィッシュの飼育と維持のために公開されたプロトコルに従って、トランスジェニックゼブラフィッシュの繁殖ペア:Tgは(GFP wt1b)を設定します。自然スポーン後の胚を収集し、およびE3水で満たされた10センチメートルペトリ皿(5mMのNaClを、0.17mMのKCl、0.33のCaCl 2、0.33 mMのMgSO 4)しに保管してください。すぐに13 MO注入を開始します。顕微鏡下で胚の形態を監視し、MO注入がワンであることを確認してください細胞期または4細胞期よりも遅くない。
    1. と10cmのペトリ皿に胚を移しトラフ寒天くさび形。余分E3水を吸引し、優しく谷に胚を押してください。
    2. 解剖顕微鏡下で1細胞期胚を可視化するためにマイクロピペットを持つ胚を操作します。絨毛膜その後卵黄(=500μlの1滴)にMOの1つまたは2つの液滴を注入する卵黄を貫通する。 E3水で10cmのペトリ皿に注入した胚を移し、28.5℃でインキュベートする。
  2. 注射の後、死んだ胚を除去し、注入した胚の数を記録。ディッシュごとに24〜48時間でE3の水を交換してください。

4.表現型レスキュー実験

  1. 異なる主要塩基対構造(通常は3-7塩基対のミスマッチ)を有し、救助、したがって、MOに耐性のある別の種由来の相同分子種を選択する。例えば、この実験では、我々は選択したマウスマウスWnt5aの mRNA配列は、ゼブラフィッシュ配列とは異なるからです。
  2. 翻訳サイトで開始するフォワードプライマーとmRNAコード領域の末端に近いにおけるリバースプライマーとのプライマーセットを設計します。フォワードプライマー配列の5 '末端にT7プロモーター配列を付加する。この実験では、以下のプライマー配列を使用する。フォワード:5'-TAA TAC GAC TCA CTAタグGGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA A-3 'と逆:5'- TCA CTT GCA GAC GTA CTG gtc- 3'。
  3. 上記で設計されたプライマーセット(各プライマー0.5μM)、以下のPCRプログラムを使用してマウスのWnt5a cDNA配列を含有する0.1μgのテンプレートDNAを50μlのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う:95℃で5分間の1サイクル。 95℃(30秒)、58.5℃(30秒)、72℃(1分)の35サイクル。 7分間の72℃での最終伸長ステップを。
  4. トンを終えた後彼は、サイクル、バンドは右のサイズであることを確認するために1%アガロースゲルでPCR産物2μlのを実行します。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットでPCR産物を精製する。分光光度計を用いてDNA濃度を確認してください。 -20℃で精製したPCR産物を保存したり、次の工程に直接キャップ化RNA転写に使用します。
  5. 製造業者の説明書に従ってキャップ化RNA合成キットでキャップされたmRNAをin vitroで合成する。 20μlのRNaseを含まない水にmRNAを希釈し、濃度を測定。 -80℃でRNAと店舗を分注し。
  6. 注射の日には、RNaseを含まない滅菌水でmRNAのワーキング溶液を準備する。 40 PGは、RNAの非特異的または毒性作用が発生しないで、最高のRNA量が一般的であることに注意してください。氷の上で作業溶液を保管してください。 MOその後救助mRNAと胚を注入、または両方一緒に共同注入する。例えば、mRNAのpreparの濃度場合各注入のステップ4.5でEDは0.08μgの/μlの最終濃度を作るためにRNaseを含まない水の4.33μlにするmRNA(0.4μgの)の0.67μlを添加、0.6μgの/μLで、その後1滴(500 PL)は40 PGが含まれていますmRNAの。ステップ3で説明したようにMOを準備します。

蛍光イメージングのために注入した胚の5準備

  1. 28.5℃のCO / Nインキュベーション後、蛍光顕微鏡を用いて前腎構造の観察に影響を与えるメラニン化を防止するE3水に0.003%のN-フェニルチオ尿素(PTU)を追加する。それは初期胚発生に影響するので、原腸形成の前にPTUを追加しないでください。
  2. 48 HPFでは、手動で微ピンセットで胚をdechorionate。光解剖顕微鏡下で48と72 HPFの胚の画像を取る。
    注:これらの写真は、麻酔なしで撮影することができます。
  3. 約10分後、蛍光顕微鏡で撮像するにそれらを置くことによって胚を麻酔する前160μgの/ mlで含む10センチメートルシャーレトリカイン緩衝。 5〜10分間待ってから、軽く、彼らが移動しないため、麻酔が動作していることを確認するためにゼブラフィッシュをタッチします。
  4. 胚は麻酔をした後、3%メチルセルロースにそれらをマウントします( 表1を参照してください)解剖顕微鏡下で腹臥位でそれらを向ける。
  5. 蛍光顕微鏡下で前腎の構造を観察した( 表1を参照してください)と、異なる倍率(10倍と20倍)で写真を撮る。

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Representative Results

Wnt5aのノックダウンは、1細胞期のゼブラフィッシュの胚にMO(8月-MO)またはエクソン/イントロン境界スプライスMO(スプライス-MO)をブロック翻訳を導入することによって達成された。 8月-MOは、開始コドンを標的とし、したがって、母体および接合体WNT5Aメッセージの両方を阻害する。スプライス-MOは、第三のスプライスドナー部位を標的とWNT5A( 図1A)の唯一の接合体の転写を阻害する。 AUG-及びスプライスモルファントは中テールダウン体軸と心膜水腫( 図1B)を含む、複数の欠陥が互いにphenocopied。マウスWnt5aのmRNAは、部分的に表現型がオフターゲット効果によるものではないことを実証し、モルファント表現型( 図4B)を救う。 Tgは(wt1b:GFP)、GFPwt1bの内因性発現を再現するようwt1bプロモーターによって駆動されるGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、前腎構造の概要を説明するために使用された。 Tgは(WT1B:フェノールレッドアローンを注射した対照胚が( 図2)横方向に延びる細管との「U」形で融合した糸球体を形成し、通常の前腎発展を表示されたのに対し、GFP)の魚は、48 HPFでWNT5Aノックダウンした後、糸球体嚢胞形成を示した。 72 HPFでは、糸球体構造はさらにAUG-とスプライス-MOSの両方で糸球体および近位尿細管( 図3)で嚢胞を開発し、容易に可視化血管ループを開発した。 72 HPFのモルファント胚の横断組織切片のH&E染色は、嚢胞形成を明らかにした糸球体の構造と拡張した尿細管( 図4A)破壊した。

図1
図1:モルホリノ設計と注射後の72時間後に受精(HPF)でのゼブラフィッシュ胚の光顕微鏡像フェノールレッド制御、8月-MO、またはスプライス-MOと。 (A)図は、ゼブラフィッシュWNT5A遺伝子コード領域、及びAUG-及びスプライスMOによって標的領域を示す。 WNT5A AUGの-MOは、タンパク質翻訳を阻止するATG開始コドンを標的とするように設計された。スプライス-MOはエクソンの境界を標的とするように設計された任意のスプライスジャンクショ​​ンに対して向け3および4スプライス-MOオリゴは、完全または部分的な単一エクソン欠失または完全なまたは部分的な単一のイントロン挿入のいずれかを生成することが期待される。私たちは、特異性を高めるために、母体および接合体のメッセージに影響を与える8月-MO、およびだけ接合体の転写に影響を与えるスプライス-MO、両方でWNT5Aを ​​ノックダウンすることにしました。(B)フェノールレッドを注入した胚を(噴射制御)が正常な身体の曲率、長さ、および心膜を示した。 8月-MOを注入した胚は、下向きの巻き毛の尾部構造と心膜浮腫を示し、スプライス-MOを注入した胚はphenocopied8月-MOを注入した胚の外観。バー= 2ミリメートル。

図2
2:Tgは(wt1b:GFP)の蛍光顕微鏡像。フェノールレッド制御、WNT5A 8月-MOまたはWNT5Aスプライス-MO注射後48 HPFにおけるゼブラフィッシュの胚フェノールレッド噴射制御では、前腎の開発は48で完了したHPF。二つの融合した糸球体および近位尿細管を見ることができます。嚢胞形成は、ゼブラフィッシュ前腎の開発(バー= 100μm)の年末までに48 HPFの両AUG-とスプライス-MO胚で糸球体で観察することができる。

図3
3:Tgは(wt1b:GFP)の蛍光顕微鏡像と注射後72 HPFにおけるゼブラフィッシュの胚フェノールレッド制御、WNT5Aの 8月-MOまたはWNT5Aスプライス-MO。72 HPFでは、糸球体の構造を明確に可視化することができる。フェノールレッド噴射制御では、2つの融合した糸球体および血管ループが観察できる。Wnt5aのノックダウンは、糸球体および近位管状領域(バー=100μm)を含めて可視化することができ、すべてのネフロン構造における嚢胞形成をもたらした。

図4
図4:72のHPFモルファント胚の横断組織切片の(A)のH&E染色は、嚢胞形成を明らかにした糸球体の構造と拡張した尿細管を破壊した。矢印:前腎糸球体。矢じり:拡張型腎尿細管。バー=20μmである。(B)AUG-MO表現型は、部分的に、一次塩基対の構造の違いにMOに耐性マウスのWnt5aで救出することができこれにより表現型がオフターゲット効果によるものではなかったことを示している。差はP <0.05で統計的に有意であった(* P <0.05フェノールレッドグループVS;#のP <0.05 8月-MO 15 ngのグループVS)。

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Discussion

多発性嚢胞腎(PKD)は、ヒトにおける末期腎疾患の主要な原因の一つであり、進行性の嚢胞形成、腎肥大、および異常な尿細管発生14によって特徴付けられる。常染色体優性PKD(ADPKD)ポリシスチン1(PC1)、またはPKD2、符号化ポリシスチン2(PC2)、多嚢胞性腎臓で結果をコードする、PKD1どちらのどの突然変異の遺伝的疾患である。多くの他の遺伝子、一次繊毛に見出さ特にコードするタンパク質は、腎嚢胞の発症に関与すると考えられ、これまでのところ、これらの遺伝子をスクリーニングするための理想的なツールは存在しない。我々はゼブラフィッシュにおける遺伝子ノックダウン後に腎嚢胞形成を観察するために迅速かつ簡単な方法を説明します。この方法は、おそらく他の候補PKD遺伝子をスクリーニングすることができる。

この技術の強みの一つは、その単純です。 Tgは(wt1b:GFP)でゼブラフィッシュ、GFPの発現は、特定なっている、糸球体、尿細管とダクト内にあるLY適切なモデルは、全体の前腎腎臓の構造を研究する。 Tgは(wt1b:GFP)ゼブラフィッシュは、ノックダウン遺伝子の後に直接前腎構造の可視化と腎嚢胞形成を可能にします。それは、Wnt5aのノックダウン PCP経路欠損マウスにおける腎嚢胞形成を引き起こす可能性があることが疑われた。しかし、Wnt5aのグローバルノックアウトは、マウスの致死出生後で、出産後に腎嚢胞形成を観察するために使用することができなかった。ここで説明する方法を使用することにより、短時間ではゼブラフィッシュにおけるWNT5Aのノックダウンは、腎嚢胞形成をもたらしたことが決定された。この結果、次のステップは、腎臓特異的Wnt5aのノックアウトマウスを生成することになる。

この技術はまた、いくつかの制限を有する。良好な抗体なしのMOの有効性を推定するために、およびMOが表現型を引き起こすために無関係の遺伝子の機能を阻害し得る可能性を排除することは困難である。豊富な制御experime国税庁は、これらの問題を克服するために必要とされる。二つの異なるMOは、8月-MOとスプライスMOがWNT5Aのノックダウンを評価した。両方モルファントが互いにphenocopied、マウスWnt5aの mRNAの注入は、主要塩基対の構造の違いに起因したMOの耐性表現型MOの「オフターゲット」効果によるものではなかったことを実証し、異常な表現型を救出した。

我々のモデルは、WNT5Aのノックダウンは、ゼブラフィッシュ胚における腎嚢胞形成を引き起こすことを示している。それは単純で、より少ない時間がかかるので、この方法は、腎嚢胞形成を引き起こすことが疑われている多くの他の遺伝子を試験するために使用することができる。それはゼブラフィッシュにおける腎嚢胞形成における遺伝子変異の結果ことが実証された後、さらなる実験は、腎嚢胞形成の詳細なメカニズムを調べるために実施することができる。 Wnt5aのグローバルノックアウトマウスは生後致死であり、使用することができないため、この実験では、OBに出生後腎嚢胞形成に役立つ、次のステップは、Cre-lox系を用いて、腎臓固有のWnt5aのノックアウトマウスを生成することになります。

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Acknowledgments

この作品は、NIH(JHLにLH、およびDK069909とDK047757にDK093625)およびVA(JHLに優秀賞I01BX000820)によってサポートされていました。私たちは本質的な支援を提供するためのペンシルベニア州ゼブラフィッシュコアの大学の博士マイケル·パックと博士傑彼に感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Phenol-Red Sigma P0290 Color indicator for injection
Morpholino Genn Tools, LLC (customized) Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle Tritech Research MINJ-PP If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit Ambion 1344 For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea Sigma P7629 For prevention of melanization
Tricaine Sigma A5040 Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose Sigma M-0387 For position of zebrafish 
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix Promega U1511 For PCR
Tag DNA Polymerase Invitrogen 10342-053 For PCR
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000 For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor Werther International, Inc. Panther Compact 106 Air source for injection
Pico micro-injection pump World Precision Instruments Inc PV830 Pnematic PicoPump Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator World Precision Instruments Inc MMJR Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder World Precision Instruments Inc 5430-ALL To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers Fine Surgical Tools 11253-20 For breaking off the needle tip
Dissecting microscope Leica M205C  For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope Zeiss Axio Obserer D1m   For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm) VitroCom CV1525Q-100 For measure the volume of each injected drop

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References

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