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माउस गुर्दा प्रत्यारोपण: allograft अस्वीकृति के मॉडल

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Tse, G. H., Hesketh, E. E., Clay, M., Borthwick, G., Hughes, J., Marson, L. P. Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection. J. Vis. Exp. (92), e52163, doi:10.3791/52163 (2014).

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Abstract

Introduction

यह लंबाई और जीवन 2 की गुणवत्ता दोनों में सुधार की पेशकश की है, दुनिया भर में अंत मंच वृक्क विफलता के साथ रोगियों के लिए एक क्रांतिकारी उपचार बन गया है तब से गुर्दे की विफलता के इलाज के लिए सफल गुर्दे प्रत्यारोपण के पहले, एकयुग्मनज जुड़वां बच्चों के बीच 1 1955 में वर्णित किया गया था. हालांकि लंबी अवधि के भ्रष्टाचार अस्तित्व पुरानी allograft क्षति 3 में जिसके परिणामस्वरूप रोग प्रक्रियाओं की एक भीड़ द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है.

मानव में प्रत्यारोपित गुर्दे की अस्वीकृति immunosupporessive regimens में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूद, रुग्णता का एक प्रमुख कारण बनी हुई है. गुर्दे के प्रत्यारोपण के एक माउस मॉडल विकसित करने के उद्देश्य बारीकी से मानव गुर्दे प्रत्यारोपण 4 में पाया प्रक्रिया और विकृति को दोहराने के लिए है. Skoskiewicz एट अल. पहले 1973 5 में गुर्दे के प्रत्यारोपण के माउस मॉडल का वर्णन किया. उन्नत microsurgical कौशल की आवश्यकता होती है, यद्यपि यह एक मूल्यवान टी हैकई कारणों से ool: माउस जीनोम अच्छी तरह से विशेषता और प्रयोगात्मक विधियों और माउस के अध्ययन के लिए उपलब्ध तकनीकों की एक महान विविधता है किया गया है.

गुर्दे के प्रत्यारोपण के माउस मॉडल का उपयोग कर कई समूहों हालांकि प्रयोग 4 की अवधि के लिए बगल में छोड़ दिया है अन्य अध्ययनों में और प्राप्तकर्ता माउस के देशी गुर्दे की हमारी वर्णित पद्धति एक में, एक जीवन का समर्थन अंग के रूप में प्रतिरोपित गुर्दे का इस्तेमाल किया है. लाभ माउस जिससे माउस को रुग्णता और एक दूसरे की प्रक्रिया से मौत का खतरा कम करने के लिए एक भी संज्ञाहरण और आपरेशन आए हैं. इसके अतिरिक्त माउस क्रमिक गुर्दे की विफलता के प्रतिकूल प्रभाव से ग्रस्त नहीं है.

अल्लोजीनिक अस्वीकृति के मॉडल इस तरह के दिल और त्वचा के रूप में अन्य अंगों में मौजूद हैं, ये हमेशा गुर्दे प्रत्यारोपण के लिए सीधे प्रासंगिक नहीं हैं. इन मॉडलों अलग प्रकार और उप बटोर कि सबूत नहीं हैअस्वीकृति का namics, उदाहरण के लिए हृदय allograft और गुर्दे allograft में अस्वीकृति का समय बेशक कुछ तनाव संयोजन 6 में काफी अलग है. हम गैर ट्रांसजेनिक FVB / न्यू जर्सी चूहों में BALB / ग दाताओं में तीव्र गुर्दे allograft अस्वीकृति पैटर्न का वर्णन किया है, इस मॉडल टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज 7 के संचय के साथ सेलुलर मध्यस्थता चोट दिखाया. इन चूहों को एक एकल MHC वर्ग द्वितीय loci एमआईएस की विशेषता है के रूप में वैकल्पिक रूप से हम भी बीचवाला फाइब्रोसिस और ट्यूबलर शोष दर्शाती है कि पुरानी allograft क्षति के एक मॉडल का वर्णन किया है, यह C57BL 6 / प्राप्तकर्ताओं में C57BL से / 6 BM12 दाताओं एक गुर्दा प्रत्यारोपण का परिणाम -match 8.

प्रत्यारोपण के कई पहलुओं तीव्र अस्वीकृति, सेलुलर और humoral अस्वीकृति, ischemia reperfusion की चोट, और उपन्यास चिकित्सीय एजेंट trialing सहित गुर्दे प्रत्यारोपण के माउस मॉडल का उपयोग कर अध्ययन किया गया है. हम शल्य टी संशोधित किया हैechnique परिचालन समय को कम करने और सर्जरी की आसानी सुधार करने के लिए. विशेष रूप से हम एक साथ दाता और प्राप्तकर्ता तैयारी और एक सतत महाधमनी पैच सम्मिलन का उपयोग करके एक सरल संवहनी सम्मिलन तकनीक का वर्णन किया है. यह वीडियो और पांडुलिपि इस तकनीक की स्थापना में सहायता करने के लिए कुंजी अंक प्रदान करेगा.

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Protocol

उपयुक्त राष्ट्रीय और स्थानीय संस्थागत नैतिकता पशु प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले जगह में होना चाहिए. प्राप्तकर्ता सर्जन 2.1-2.8 से करता है whilst विशेष रूप से यूनाइटेड किंगडम में निम्नलिखित प्रयोगों दाता सर्जन प्रदर्शन करना चाहिए दो microsurgeons एक साथ संचालित करने के लिए उपलब्ध हैं कहां पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के तहत किए गए, 1.1-1.16 तो 3.1-3.5 कदम . एक ही ऑपरेटर के लिए कदम क्रमिक रूप से पालन किया जा सकता है.

1 दाता तैयारी

नोट: यहां प्रस्तुत प्रक्रिया एक दाता C57BL 6 / BM12 और प्राप्तकर्ता 20 ग्राम से अधिक शरीर के वजन के साथ 8 से 16 सप्ताह की उम्र के बीच के आयु वर्ग C57BL 6 / पुरुष चूहों के लिए है. हालांकि इस प्रक्रिया reproducibly माउस उपभेदों की एक किस्म पर किया जा सकता है. प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत आंकड़ों C57BL / 6, C57BL 6 / BM12 और BALB / ग चूहों से प्राप्त हुई थी.

  1. आचार प्रक्रियाओं usinप्रयासों के साथ जी बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण और उपभोज्य (autoclaved), यथासंभव बाँझ परिचालन क्षेत्र रखने के लिए. दो सर्जन उपलब्ध हैं अगर प्राप्तकर्ता तैयारी के साथ एक साथ दाता तैयारी कर.
  2. Medetomidine (0.5 मिलीग्राम / किग्रा) और ketamine हाइड्रोक्लोराइड (/ किलो 200 मिलीग्राम) की intraperitoneal इंजेक्शन (31G सुई) के साथ माउस anesthetize. पूरी प्रक्रिया के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध कराने के 4 घंटे के लिए बनाए रखा है कि एक संवेदनाहारी विमान में यह परिणाम प्रदर्शन किया जाएगा. पूरक संज्ञाहरण आवश्यक नहीं है.
  3. माउस (पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए कोई जवाब नहीं) anaesthetized है की पुष्टि.
  4. माउस के पेट दाढ़ी और चिपचिपा टेप के साथ किसी भी खुले बाल हटा दें.
  5. एक sterilely लिपटी गरम चटाई पर अपनी पीठ पर माउस रखें और शिथिल बाँझ मास्किंग टेप के साथ अंग स्थिर.
  6. थर्मल जलने के लिए प्रक्रिया के दौरान माउस मॉनिटर. यदि संभव हो तो एक गैर बिजली गर्मी स्रोत का उपयोग करें.
  7. एक आँख स्नेहक और सा लागू करेंएक पतला आयोडीन समाधान के साथ पेट की दीवार nitize.
  8. Peritoneal गुहा दर्ज करें और एक 3 सेमी Calibri पेट प्रत्याकर्षक डालने के लिए पेट में एक midline चीरा.
  9. नम आंतों और शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में रखने और आंत की अनावश्यक सुखाने से बचने के लिए गर्म खारा लागू करें.
  10. बाँझ पर्दे के साथ माउस को कवर किया और महाधमनी, रग कावा और बायां गुर्दा बेनकाब करने के लिए ऑपरेटर की बाईं (माउस का अधिकार) को आंतों चाल है.
  11. पेट के लिए एक ratcheted forcep लागू करें और पूरी तरह से प्रमुख जहाजों और बायां गुर्दा बेनकाब करने के लिए ऊंचा पुल. दूर ऐसे जिगर पालियों, लाभदायक vesicles, और आंत्र के रूप में शल्य चिकित्सा के क्षेत्र से ऊतकों को वापस लेना पेट में बाँझ swabs (2 मिमी x 2 मिमी) नम पैक.
  12. आसपास के adventia, वसा और दो टूक ठीक टिप संदंश का उपयोग संयोजी ऊतक विदारक द्वारा peritoneal गुहा में छोड़ दिया अधिवृक्क ग्रंथि से बायां गुर्दा अलग. पूर्वोत्तर क्षेत्रों है कि बीच संदंश के बंद सुझावों रखेंएड अलग कर दिया और धीरे धीरे forcep सुझावों अंतरिक्ष काटना खोलने के लिए अनुमति होंगे.
  13. Ligating और फिर 9 / ओ नायलॉन के साथ अधिवृक्क नस और छोड़ दिया जननांगों नस बाईं विभाजित करके छोड़ दिया गुर्दे की नस पृथक. गुर्दे की नस के करीब सिवनी रखें.
  14. Ligate और सिवनी छोड़ने मूत्राशय के करीब 7 / ओ रेशम सीवन के साथ मूत्रवाहिनी विभाजित लंबे समय समाप्त होता है. गुर्दे काटा और ureteric सम्मिलन के लिए आवश्यक हैं जब ये लंबे सिवनी सिरों का उपयोग किया जाएगा.
  15. जुटाने और पूरी तरह से गुर्दे की धमनी को ऊंचा और अवर महाधमनी और रग कावा काटना और दो टूक वाहिकाओं के सामने और पक्षों से लसीका वाहिकाओं और वसा काटना ठीक टिप संदंश का उपयोग नस.
  16. महाधमनी और रग कावा और धीरे धीरे फैल संदंश के बीच ऊतक विमान का पता लगाएं. धीरे धीरे कम से कम आघात के साथ ऊतक प्रसार करने के लिए ठीक इत्तला दे दी संदंश के सुझावों खुला.
  17. एक angled ठीक से गुजर रहा वृक्क धमनी के बेहतर और अवर महाधमनी के चारों ओर एक ढीला 7 / ओ रेशम टाईटिप संदंश जहाजों के पीछे के आसपास और के माध्यम से एक सीवन ड्राइंग. ये टांके विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के समाधान की प्रतिगामी छिड़काव अनुमति देने के लिए गुर्दे की पुनर्प्राप्ति करने से पहले कड़ा किया जाएगा.

2 प्राप्तकर्ता तैयारी

दाता तैयारी पालन के अनुसार 1.2-1.8 कदम.

  1. महाधमनी, रग कावा का पर्दाफाश करने के लिए ऑपरेटर के अधिकार (माउस के बाएं) को आंतों ले जाएँ. एक बाँझ खारा लथपथ झाड़ू से आंतों को कवर किया.
  2. सही गुर्दे धमनी ligating द्वारा एक सही nephrectomy प्रदर्शन और 7/0 रेशम सीवन के साथ एक साथ नस और फिर विभाजित.
  3. 7 / ओ रेशम सिवनी और विभाजन के साथ सही मूत्रवाहिनी ligate.
  4. जुटाने और कदम 1.14 और 1.15 में वर्णित के रूप में पूरी तरह से गुर्दे धमनी और शिरा को नीचा महाधमनी और रग कावा काटना. महाधमनी और रग कावा के बीच पूरा विच्छेदन सुनिश्चित करें. रग कावा और aort पूर्वकाल चलाता है जो आंतरिक वृषण धमनी की रक्षा करने के लिए ध्यान रखनाएक लसीका बंडल के साथ.
  5. , रीढ़ की हड्डी में रग कावा और शिरा से retroperitoneum में चल काठ वाहिकाओं को पहचानें निरंतरता में 9 / ओ रेशम के साथ ligate, वाहिकाओं को विभाजित करने की कोई जरूरत नहीं है.
  6. नाड़ी anastomoses के लिए के बीच अंतरिक्ष के साथ microvascular clamps स्थान के लिए पर्याप्त स्थान की पहचान करें.
  7. पृष्ठीय penile नस के माध्यम से नसों में हेपरिन (5 इकाइयों) प्रशासन.

3 दाता गुर्दा रिट्रीवल

धमनी संचलन से गुर्दे को अलग करने के लिए अवर और बेहतर महाधमनी के आसपास रखा गया है कि 7 / ओ रेशम संबंधों कसो.

  1. महाधमनी में एक सुई (31G) के साथ विश्वविद्यालय के विस्कॉन्सिन समाधान के 0.5 मिलीलीटर - प्रतिगामी ठंड 0.2 दिखे.
  2. टांके के भीतर महाधमनी फूट डालो और गुर्दे और महाधमनी की लंबाई के साथ गुर्दे की धमनी को दूर करने के रग कावा के साथ अपने जंक्शन पर गुर्दे की नस विभाजित करते हैं. वे मौजूद हैं, डब्ल्यू, महाधमनी से उत्पन्न होने वाली काठ जहाजों फूट डालोithout बंधाव.
  3. एक संस्कृति डिश में एक बाँझ झाड़ू पर ठंड खारा में गुर्दे रखें.
  4. ग्रीवा अव्यवस्था से दाता माउस euthanize.

4 गुर्दा प्रत्यारोपण - गुर्दा तैयारी

  1. गुर्दे की धमनी विपरीत longitudinally सीधे महाधमनी दीवार विभाजित करके एक महाधमनी पैच बनाएँ. धमनी सम्मिलन जब प्रदर्शन ligated या परहेज करने की आवश्यकता है कि पैच में किसी भी पोत lumens पहचानें.
  2. Inferiorly ऊंचा गुर्दे की नस लुमेन और एक दूसरे अलग सीवन के अंदर करने के लिए बाहर से एक 10 / ओ सिवनी रखें. टांके अधिवृक्क नस विभाजित करने के लिए इस्तेमाल किया और जननांगों नस पोत मालूम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. प्राप्तकर्ता (चित्रा 1.1) की सही दिशा में गुर्दे प्लेस और टांके अच्छी तरह संवहनी anastomoses swabs या अन्य उपकरणों में जुड़ बनने टांके के बिना पूरा किया जा सकता है यह सुनिश्चित करने के लिए रखा जाता है सुनिश्चित करते हैं.

5 गुर्दा Transplantation - संवहनी सम्मिलन

पहले inferiorly फिर से ऊंचा रग कावा और महाधमनी शामिल microvascular clamps लागू करें.

  1. रग कावा के पूर्वकाल दीवार puncturing द्वारा एक सुई (31G) के साथ एक ventomy बनाओ. 0.9% NaCl के लगभग 50 μl इंजेक्शन द्वारा रग कावा से बहा खून.
  2. लंबाई दाता गुर्दे की नस के व्यास के बराबर है कि इतनी venotomy भीतर उन्हें खोलने से ठीक टिप संदंश का उपयोग venotomy चौड़ा.
  3. Venotomy (चित्रा 1.2) के शीर्ष पर प्रथम (वृक्क शिरा के लुमेन में पहले से ही है) 10 / ओ बेहतर सिवनी प्लेस और अवर शीर्ष तक पहुँच जाता है (चित्रा एक चल सीवन में सम्मिलन के पीछे की दीवार में शामिल होने 1.3).
  4. 10 / ओ अवर सिवनी प्लेस और फिर पीछे की दीवार से चल सीवन को टाई एक एकल गाँठ (चित्रा 1.4) के साथ पहले टाई.
  5. सामने वाल बनाने के अवर सीवन का उपयोगसम्मिलन के एल एक चल सीवन के साथ (चित्रा 1.5) और बेहतर एपेक्स (चित्रा 1.6) पर बेहतर सिवनी अंत करने के लिए टाई.
  6. संदंश के साथ महाधमनी दीवार उठा और कैंची के साथ एक अंडाकार पैच (लगभग aortotomy महाधमनी की परिधि और लंबाई में तीन बार गुर्दे धमनी लुमेन का पांचवां हिस्सा होना चाहिए) काटने से एक aortotomy बनाएँ.
  7. अंदर करने के लिए बाहर से महाधमनी पैच के श्रेष्ठ बिंदु (चित्रा 1.7) पर एक 10 / ओ सिवनी प्लेस और aortotomy के श्रेष्ठ शिखर पर जहाजों के बाहर टाई करने के लिए महाधमनी के माध्यम से गुजरती हैं.
  8. बहुत तंग सिवनी (चित्रा 1.9) बांधने से सम्मिलन कसना नहीं ख्याल रखना, एक चल सिवनी से ऊंचा प्राप्तकर्ता महाधमनी को दाता पैच anastomosing (चित्रा 1.8) शुरू करने के साथ धमनी सम्मिलन बनाएँ.
  9. (गुर्दे reperfuse के लिए सबसे पहले तो बेहतर दबाना अवर संवहनी clamps निकालेंचित्रा 1.10 और 1.11). मूत्रवाहिनी के लिए पर्याप्त रक्त की आपूर्ति हासिल की है अगर मूत्रवाहिनी के दर्शनीय peristalsis को शायद देखा.

6 गुर्दा प्रत्यारोपण - ureteric सम्मिलन

  1. पेट की दीवार से मूत्राशय की किसी भी संलग्नक फूट डालो.
  2. दोनों दीवारों के माध्यम से मूत्राशय के बाएं से दाएं एक सुई (21G) पास.
  3. सुई लुमेन में सीधे forcep सुझावों प्लेस और पारित दोनों वापस संदंश अब मूत्राशय के बाईं ओर से बाहर छोड़ दिया सही से गुजर रहे हैं कि इस तरह के मूत्राशय के माध्यम से.
  4. मूत्रवाहिनी दाएं से बाहर तो बाएं मूत्राशय दोष में गुजरता है कि इस तरह के मूत्राशय के माध्यम से दाता मूत्रवाहिनी पर सिवनी ड्रा.
  5. एक दौर शरीर सुई पर 9 / ओ नायलॉन सीवन के साथ प्रवेश बिंदु के आसपास तीन एकल बाधित sutures के साथ मूत्राशय की बाह्यकंचुक को मूत्रवाहिनी की बाह्यकंचुक सीवन.
  6. संयुक्ताक्षर को मूत्रवाहिनी समीपस्थ कट, इस प्रकार खोलने वेंई मूत्रवाहिनी मूत्र प्रवाह और मूत्रवाहिनी अंत मूत्राशय के शरीर में वापस लेना करने की अनुमति की अनुमति है. मूत्र के दर्शनीय उत्पादन पेरी ureteric वाहिकाओं से खून बह रहा है के साथ देखा जा सकता है.
  7. एक भी बाधित 9 / ओ रेशम सीवन के साथ दाएं मूत्राशय दोष को बंद करें.

7 रिकवरी और पोस्ट ऑपरेटिव केयर

उनके मूल ओरिएंटेशन में पेट में जठरांत्र आंत बदलें और 6 / ओ absorbable सीवन के साथ rectus मांसपेशियों का अनुमान करने से पेट की दीवार को बंद करें.

  1. धातु त्वचा क्लिप के साथ त्वचा लगभग.
  2. आंशिक रूप से atipamazole हाइड्रोक्लोराइड (10 μl / छ) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ संज्ञाहरण रिवर्स.
  3. चमड़े के नीचे 0.9% NaCl के 1 मिलीलीटर चमड़े के नीचे buprenorphine हाइड्रोक्लोराइड (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा और द्रव समर्थन इंजेक्शन के लिए पीड़ानाश प्रशासन.
  4. 24 से 48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर एक वार्मिंग कैबिनेट में माउस की वसूली. बीमारी के लिए माउस का निरीक्षणप्रयोग के पूरा.
  5. 10 दिन ऑपरेशन पोस्ट - धातु त्वचा क्लिप 7 निकालें.
  6. प्रयोग पूरा हो गया है एक बार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस euthanize.
  7. निकालें और ऊतकीय विश्लेषण के लिए contralateral गुर्दे और allograft इकट्ठा.

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Representative Results

गुर्दे allograft अस्वीकृति प्रतिरोपित गुर्दे (चित्रा 2) के methacarn तय आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों की ऊतकीय विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. गुर्दे इस्कीमिक reperfusion चोट में syngeneic चूहों परिणामों के बीच गुर्दे की Isograft प्रत्यारोपण, लेकिन 4 सप्ताह से नलिकाओं बरामद और देशी गुर्दे को histologically तुलना कर रहे हैं. एक्यूट अस्वीकृति गुर्दे पैरेन्काइमा भर में फैलाना मोनोन्यूक्लियर सेल घुसपैठ interstitium, ग्लोमेरुली और नलिकाओं शामिल है 1 सप्ताह के भीतर, BALB / ग प्राप्तकर्ताओं में C57BL 6 / गुर्दा प्रत्यारोपण से मॉडलिंग की जा सकती है. पुरानी allograft क्षति C57BL 6 / प्राप्तकर्ताओं में प्रतिरोपित C57BL 6 / BM12 गुर्दे से मॉडलिंग की जा सकती है, इस बीचवाला फाइब्रोसिस और क्रमिक छोटी नली नुकसान से मिलकर मानव पैथोलॉजी में पाया विशिष्ट सुविधाओं में यह परिणाम है. उच्चस्तरीय क्षेत्र (X200 बढ़ाई) के अनुसार सकल छोटी नली गणना (फाई कार्यात्मक नेफ्रॉन जन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता हैgure 3), नलिकाओं का नुकसान अस्वीकृति की वजह से ट्यूबलर चोट को दर्शाता है. बीचवाला फाइब्रोसिस अखिल कोलेजन दाग picrosirius लाल (चित्रा 4) का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. सामान्य अंतर्जात कोलेजन हालांकि प्रगतिशील फाइब्रोसिस में जिसके परिणामस्वरूप जमा है पुरानी क्षति नए कोलेजन के दौरान मनाया जाता है. पुरानी क्षति प्रत्यारोपण के बाद स्पष्ट 8 और 12 के बीच सप्ताह (चित्रा 5) हो जाता है.

एक महत्वपूर्ण सीखने की अवस्था मॉडल (चित्रा 6) स्थापित करने के लिए दूर करने की जरूरत है. एक अनुमान के अनुसार 40 प्रक्रियाओं एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संवहनी सम्मिलन समय जटिलताओं से मुक्त स्वीकार्य अस्तित्व के साथ पहुँच गया था पहले बरामद चूहों में प्रदर्शन किया गया. माउस euthanizing के लिए सबसे आम कारण हमारे अनुभव प्रणालीगत heparization इस की घटनाओं को कम कर देता है तथापि में, और घनास्त्रता धमनियों से संबंधित रीढ़ की हड्डी ischemia-अंग कम करने के लिए माध्यमिक पिछले अंग पक्षाघात की वजह से था. चूहे नियमित मो थेप्रयोगों समाप्त करने के लिए स्थानीय स्तर पर सहमत हुए मापदंड के अनुसार nitored. सीखने की अवस्था के पठार चरण में प्रदर्शन जीवन रक्षा प्रयोगों 28.9 ± 0.47 मिनट का एक मतलब संवहनी सम्मिलन समय में हुई.

चित्रा 1
संवहनी सम्मिलन तकनीक की संख्या 1 चित्रात्मक प्रस्तुति. दाता गुर्दे प्राप्तकर्ता माउस का सही दिशा में रखा गया है. दाता गुर्दे की नस एक को समाप्त करने के पक्ष फैशन में anastomosed है और महाधमनी का एक पैच पर दाता गुर्दे धमनी प्राप्तकर्ता महाधमनी को anastomosed है.

चित्रा 2
प्रतिरोपित गुर्दे में चित्रा 2 प्रतिनिधि ऊतकीय ट्यूबलर चोट. मिथाइल Carnoyl के समाधान के ऊतकों में निर्धारण के बाद paraf में एम्बेडेड गया4μm के पंख और ऊतक वर्गों Hemotoxylin और eosin से दाग रहे थे. गुर्दे ट्यूबलर चोट प्रदर्शन और दिखने में देशी गुर्दे से तुलना कर रहे हैं नहीं है isograft प्रत्यारोपण निम्नलिखित 4 सप्ताह में. BALB / ग प्राप्तकर्ताओं में प्रतिरोपित C57BL 6 / BM12 गुर्दे फैलाना मोनोन्यूक्लियर सेल पैठ (*) और परिगलित नलिकाओं (**) और tubulitis साथ तीव्र allograft अस्वीकृति गुजरना. परिवाहकीय लिम्फोसाईटिक पैठ (ब्लॉक तीर ⬆) द्वारा विशेषता पुरानी allograft क्षति और बीचवाला फाइब्रोसिस और ट्यूबलर शोष (खोखला तीर ⇧) में C57BL 6 / परिणामों में प्रत्यारोपित C57BL 6 / BM12 गुर्दे. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
टीआर में ट्यूबलर चोट की चित्रा 3 मात्रा ansplanted गुर्दे. स्वस्थ नलिकाओं (एक अक्षुण्ण तहखाने झिल्ली बरकरार छोटी नली लुमेन, स्वस्थ cytoplasmic मात्रा और एक बनाए रखा शिखर माइक्रोविली ब्रश सीमा की उपस्थिति द्वारा परिभाषित) कार्य नेफ्रॉन जन दर्शाती क्षेत्र प्रति नलिकाओं की औसत संख्या की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (X200 बढ़ाई ) (एन = 6, लगातार 10 क्षेत्रों के औसत, ** पी <0.01).

चित्रा 4
चित्रा 4 जीर्ण allograft क्षति प्रतिरोपित गुर्दे कोलेजन की picrosirius लाल धुंधला का पता लगाने के द्वारा स्पष्ट है के भीतर मध्य फाइब्रोसिस (प्रतिनिधि तस्वीरें). कोलेजन बयान से पहचाना जा सकता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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बीचवाला फाइब्रोसिस के 5 चित्रा मात्रा. लाल सकारात्मकता C57BL / 6BM12 में उठाया है picrosirius द्वारा मापा बीचवाला फाइब्रोसिस (एन = प्रत्यारोपण निम्नलिखित C57BL 6 / प्राप्तकर्ताओं बारह सप्ताह ⇒ 6, लगातार 10 क्षेत्रों के औसत, ** पी <0.01, * पी ​​< 0.05).

चित्रा 6
चित्रा 6 सीखने की अवस्था. टर्मिनली anaesthetized चूहों में प्रारंभिक गैर वसूली प्रयोगों सर्जिकल तकनीक विकसित करने के लिए प्रदर्शन किया गया. इस जटिलताओं के बिना एक जीवित माउस के साथ एक सफलतापूर्वक फिर से perfused प्रतिरोपित गुर्दे प्राप्त करने के लिए वसूली प्रयोगों के द्वारा किया गया.

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Discussion

धमनी सम्मिलन प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छी तरह से वर्णित ढंग प्राप्तकर्ता महाधमनी के लिए एक अंत की ओर ढंग से, निरंतरता में गुर्दे की धमनी के साथ, दाता के बाहर का महाधमनी का उपयोग करने के लिए है. हम और अधिक सुविधाजनक हो सकता है हमें विश्वास है कि जो मानव गुर्दा प्रत्यारोपण में प्रदर्शन किया है कि 'Carrell पैच' मिरर के समान एक महाधमनी पैच, के उपयोग का वर्णन. दाता और प्राप्तकर्ता ऑपरेटिव समय के साहित्य में रिपोर्ट विरल हैं हालांकि हम प्राप्तकर्ता महाधमनी को समाप्त करने के पक्ष दाता महाधमनी की बजाय प्राप्तकर्ता महाधमनी के लिए एक महाधमनी पैच का उपयोग बेहतर है कि विश्वास करते हैं. एक पैच का उपयोग करते समय काठ दाता महाधमनी शाखाओं काटना जरूरत नकारती है, और भी समय स्वाभाविक रूप से इन शामिल नहीं एक पैच anastomosing के रूप में, उन्हें व्यक्तिगत रूप से ligate के लिए ले लिया.

इस मॉडल को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम के रूप में धमनी पैच सम्मिलन के भीतर गुर्दे की धमनी के अलावा अन्य कोई अन्य धमनी lumens कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के ख्याल रख रही शामिल वेसूक्ष्म नाड़ी clamps हटा रहे हैं जब रिसाव जाएगा. anastamoses निर्माण टांके अण्डाकार aortotomy प्रदान की है कि हम देखा है व्यावहारिकता में, सम्मिलन और कारण ischemia संकीर्ण या किसी भी रक्त प्रवाह को बाधित कर सकते हैं जो पर्स स्ट्रिंग प्रभाव के बारे में पता होना कस लेकिन बांधा जा सकता है पर्याप्त आकार पर्स स्ट्रिंग की है प्रभाव का सामना नहीं कर रहा है. venotomy तो संदंश के साथ खींच द्वारा चौड़ी एक सुई के साथ किया जाता है, हम इस संदंश के साथ खींच के रूप में काटने के लिए बेहतर है एक स्थिर सम्मिलन बनाने के लिए शिरापरक आसानी से देखा जा सकता है जो ऊतकों और सहायता suturing की एक अंगूठी बनाता है विश्वास करते हैं. मूत्राशय के लिए ureteric सम्मिलन हम मूत्र रिसाव और ureteric स्टेनोसिस शायद कारण ischemia के साथ संबद्ध किया गया है कि मूत्राशय फिर से निर्माण करने के लिए एक मूत्राशय गुंबद के बजाय यहाँ वर्णित तकनीक की वकालत, विचार करने के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण घटक है. हमारे वर्णित तकनीक यह सीधे bladd को anastomosed है के रूप में एक छोटी दाता ureteric लंबाई में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता हैएर 5. इन तकनीकी सुधार का उपयोग करके हम काफी इस प्रयोगात्मक मॉडल को पूरा करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा को कम करने में सक्षम है. दरअसल एक साथ पांच प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं काम कर रहे दो ऑपरेटरों के साथ चूहों की वसूली और निगरानी की अनुमति के लिए पर्याप्त समय के साथ प्रति दिन किया जा सकता है.

इस पत्र में वर्णित मॉडल और तकनीक का एक प्रमुख सीमा माउस माउस अस्तित्व के लिए गुर्दे पर निर्भर नहीं है कि इस तरह के बगल में अपने मूल गुर्दे में से एक के साथ छोड़ दिया जाता है. कुछ लेखक इस प्रकार प्रतिरोपित गुर्दे पर निर्भर माउस छोड़ने तुरंत प्रत्यारोपण के समय या प्रत्यारोपण के बाद पांच से दस दिनों में दूसरी देशी गुर्दे को हटाने की सूचना दी है. यह अस्तित्व में इस तरह के सीरम क्रिएटिनिन या रक्त यूरिया के रूप में गुर्दे समारोह के मार्कर को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक परिणाम के साथ ही नमूना रक्त के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति होगी. हालांकि ऊतकीय परिणामों में कोई अंतर नहीं हैallograft पर निर्भर है और एक भी देशी गुर्दे 9 के साथ उन चूहों की तुलना करते समय. हमारी इस बाधा नहीं वर्णित प्रोटोकॉल और वास्तव में दूसरे देशी गुर्दे एक निश्चित समय अंतराल पर हटाया जा सकता है. एक अतिरिक्त सीमा उन्नत सूक्ष्म शल्य विशेषज्ञता हालांकि प्रशिक्षण के साथ और इस पर काबू किया जा सकता है शिक्षा के लिए तकनीकी आंकड़ा उपयोग करके, एक धमनी और शिरापरक सम्मिलन प्रदर्शन करने के क्रम में आवश्यक है. संवहनी जटिलताओं, ये जा रहा है गुर्दे धमनी या शिरा घनास्त्रता हो सकता है, यह हमेशा संकट के संकेत, खराब स्वास्थ्य या विशेष रूप से हिंद अंग पक्षाघात प्रदर्शित माउस में यह परिणाम है. इस मॉडल का उपयोग करते हैं, इसलिए सख्त शासन और चूहों की निगरानी जरूरी है.

गुर्दे प्रत्यारोपण की तीव्र अस्वीकृति काफी हद तक हालांकि सेल की मध्यस्थता अस्वीकृति के एपिसोड अभी भी गुर्दे ग्राफ्ट भर में हो सकता है, प्रतिरक्षादमन और प्रेरण चिकित्सा घट घूम लिम्फोसाइटों द्वारा इलाज किया गया हैजीवन. इसलिए यह अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन अभी भी प्रासंगिक हैं और इलाज के लिए उपन्यास रास्ते की पहचान कर सकते हैं. ऐसे C57BL / BALB / सी में 6 ही पूरा MHC बेमेल, में, गुर्दा प्रत्यारोपण पर निर्भर अस्तित्व 7.4 दिनों के रूप में 10 के रूप में कम होने की सूचना दी गई है मतलब है. Histologically तीव्र सेलुलर और नाड़ी अस्वीकृति केशिकागुच्छीय और ट्यूबलर परिगलन साथ लिम्फोसाईटिक घुसपैठ, नकसीर और शोफ interstitium में, tubulitis, वाहिकाशोथ, से पहचाना जा सकता है. पुरानी allograft क्षति के लिए योगदान संयुक्त प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस क्षेत्र के लिए मुश्किल बना दिया है. ऊतकीय सुविधाओं बीचवाला फाइब्रोसिस, ट्यूबलर शोष, ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस और intimal प्रसार शामिल है. प्रगतिशील चोट हालांकि यह तेजी कई अन्य कारकों को शामिल किया जा सकता है की सराहना की है, लगातार टी सेल घुसपैठ के साथ जुड़ा हुआ है. लगातार चोट की क्षमता मध्यस्थता के कारण दाता विशिष्ट एंटीबॉडी, बी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं को पूरक बयान शामिलऐसे अन्तःचूचुक 3 के रूप में, मैक्रोफेज, और भ्रष्टाचार के लिए आंतरिक कोशिकाओं. इसलिए इस मॉडल अस्वीकृति के इन विभिन्न पहलुओं के अध्ययन की अनुमति देता है.

अपनी प्रारंभिक वर्णन 4 बावजूद इस मॉडल का उपयोग लगभग 70 प्रकाशित अध्ययन किए गए हैं, यह कई सौ लेख किया गया है जहां गुर्दे ischemia-reperfusion की चोट के माउस मॉडल की तुलना में है. अंतर पेट गुर्दा प्रत्यारोपण के इस माउस मॉडल का महत्व इसके अलावा यह अस्वीकृति का अलग तंत्र मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अच्छी तरह से परिभाषित जन्मजात माउस उपभेदों के उपयोग से लाभ, यह सीधे मानव गुर्दा प्रत्यारोपण की प्रक्रिया recreates है. इसलिए इस मॉडल का उपयोग कर पढ़ाई अत्यधिक अनुवाद कर रहे हैं. इस मॉडल के अन्य भविष्य अनुप्रयोगों विशिष्ट प्रकार के जंगली चूहों में पीटकर मॉडल से phenotypes या आनुवंशिक रूप में इसके विपरीत जंगली प्रकार गुर्दे के साथ गुर्दे प्रत्यारोपण द्वारा आंतरिक गुर्दे असामान्यताओं का अध्ययन शामिलबदल प्राप्तकर्ताओं.

इस मॉडल को सफलतापूर्वक मानव गुर्दे प्रत्यारोपण की प्रक्रिया को दोहराने कर सकते हैं. जन्मजात माउस उपभेदों का उपयोग MHC मतभेद बदलती के दाता प्राप्तकर्ता संयोजन का चयन अनुमति देता है. इसके अलावा चूहों का उपयोग अस्वीकृति के विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए पीटा और inducible प्रणाली सहित विभिन्न तकनीकों के उपयोग की अनुमति देता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

किडनी रिसर्च यूके से धन, एडिनबर्ग और अंग प्रत्यारोपण के यूरोपीय सोसायटी के सर्जन के रॉयल कॉलेज इस अध्ययन का समर्थन किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments
Blunt Dissecting Scissors Fine Science Tools  14072-10 For skin cutting
Curved Castoviejo scissors Fine Science Tools 15017-10 For tissue cutting
Spring Scissors – straight Fine Science Tools 15000-08 For suture cutting
Toothed forceps 1x2 teeth Fine Science Tools 11021-12
2 x Fine Tip forceps (Dumont No.5) Fine Science Tools 11251-20
Angled Fine Tip forceps (Dumont No. 5/45) Fine Science Tools 11253-25 For blunt dissecting
Curved Fine Tip forcep (Dumont No.7) Fine Science Tools 11273-22 Useful to pass around vessels
Curved Crile Haemostat Fine Science Tools 1300-04
Micro clip applicator with lock Fine Science Tools 18056-14
2 x Micro serrefines spring width 2mm, jaw length 4mm Fine Science Tools 18055-04 Microvascular clamps
2 x Colibri 3cm wire retractor Fine Science Tools 17000-03
Castroviejo needle holder with lock Fine Science Tools 120660-01
Wound clip applicator Fine Science Tools 12031-07
7mm wound clips Fine Science Tools 12032-07 Remove 7 to 10 days after surgery
Equipment
OPMI pico microscope Carl Zeiss S100
Thermal cautery unit with fine tip Geiger 150A
Heat electronic pad Cozee Cumfort n/a
Euroklav 23-S Melag n/a Autoclave
Disposable equipment
7/O Silk braided suture Pearsall 30514
10/O Dafilon (polyamide) suture B-Braun  G1118099
6/O Vicryl (plygalectin) Ethicon W9537
Regular bevel needle, 1 inch, 21G Bection, Dickinson and Company 305175 For ureteric anastamosis
Regular bevel needle, 5/8 inch, 25G Bection, Dickinson and Company 305122
Regular bevel needle, 1/2 inch, 30G Bection, Dickinson and Company 304000
Insulin needle 1ml, 29G Bection, Dickinson and Company 324827
Insulin needle 0.3ml, 30G Bection, Dickinson and Company 324826
1 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 300184
5 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 302187
Wypall paper swabs Kimberley-Clark L40 sterilised by autoclave
Cotton wool buds Johnson and Johnson n/a sterilised by autoclave
Plain drapes Guardian CB03 sterilised by autoclave
Cell culture dish 60mm x 15mm Corning Incorporated 430166
Dispensing Pin B-Braun DP3500L / 413501 Used with NaCl 0.9%
Re-agents and Drugs
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% Allergan Ltd 21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride Pfizer Animal Health Vm 42058/4165 100mg/ml solution (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidine hydrochloride  Orion Pharma Vm 06043/4003 1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride  Alsto Animal Health Vm 00063/4002 0.3mg/ml (dose 0.05mg/kg)
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride Orion Pharma Vm 06043/4004 5mg/ml (dose 2mg/kg)
University of Wisconsin Solution Belzer Bridge to Life n/a dose approximately 500 microlitres/mouse
NaCl 0.9% Baxter FKE1323
Heparin Sulphate non-proprietary n/a 5000units/ml (dose 5units/mouse)

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References

  1. Guild, W. R., Harrison, J. H., Merrill, J. P., Murray, J. Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin. Trans. Am. Clin. Climatol Assoc. 67, 167-173 (1955).
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  3. Nankivell, B. J., Alexander, S. I. Rejection of the Kidney Allograft. N. Engl. J. Med. 363, 1451-1462 (2010).
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