Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Bakterien nicht-invasiv direkt in die Lunge von Mäusen zu bringen. Dazu wird zunächst ein 150-Mikroliter-Luftkissen in eine gasdichte Spritze geladen, gefolgt von 50 Mikrolitern der vorbereiteten Bakteriensuspension. Im zweiten Schritt wird eine anästhesierte Maus mit einem 20-Gauge-Katheter intubiert, wobei ein Führungsdraht verwendet wird, um die Platzierung zu unterstützen.

Nachdem der Erfolg der Intubation mit einem einfachen Durchflussmesser bestätigt wurde, wird das bakterielle Inokulum mit einer 22 Gauge langen stumpfen Nadel durch den Katheter direkt in die Lunge eingeführt. Letztendlich kann die Intubations-vermittelte intratracheale oder weggelassene Inokulation verwendet werden, um Erkrankungen der unteren Atemwege bei Mäusen zu untersuchen, wobei die gleichzeitige Beteiligung der oberen Atemwege vermieden wird. Der Hauptvorteil von imit gegenüber internen Inokulationsmethoden besteht darin, dass diese Technik eine genaue und reproduzierbare Abgabe eines Inokulums direkt in die Lunge ermöglicht.

Da es sich bei der IIT um eine nicht-chirurgische Technik handelt, reduziert sie auch das Potenzial für Komplikationen, die mit chirurgischen intratrachealen Eingriffen verbunden sind. Obwohl diese Methode einen zuverlässigen Mechanismus zur Abgabe von Bakterien in die Lunge zur Untersuchung der Pathogenese bieten kann, kann IMA auch auf die Verabreichung anderer Reagenzien angewendet werden, wie z. B. Umweltstoffe zur Untersuchung von Lungenschäden, die gezielte Verabreichung von Therapeutika zur Behandlung und die Verabreichung von bildgebenden Sonden oder SRNA zur Untersuchung der grundlegenden Lungenbiologie. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit dem Intubationsschritt, da der Schritt eine sorgfältige Positionierung des Tieres und das automatische Zielfernrohr für das Einführen des Führungsdrahts erfordert.

visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da die anfängliche Platzierung des Führungsdrahts in der Luftröhre für neue Forscher konzeptionell schwer zu beschreiben ist. 15 Stunden vor der Installation werden drei Milliliter Bouillonkultur mit einer einzigen Bakterienkolonie geimpft und die Kultur bei 37 Grad Celsius und einem Shaker bei 200 U/min gezüchtet. Nach 15 Stunden schleudern Sie einen Milliliter der Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie den Gaumen wieder in einem Milliliter PBS.

Messen Sie anschließend eine Verdünnung der Bakterienstammsuspension von eins bis 10 bei einem OD 600, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen. Verdünnen Sie dann die Bakterienzellen in PBS auf die gewünschte Bakterienkonzentration pro 50 Mikroliter Inokulum. Für die IIT-Installation werden Mäuse auf die IIT vorbereitet, indem einer leicht anästhesierten Maus eine 2%ige Lidocainlösung mit Sondennadelmäusen verabreicht wird.

Eine Rückkehr zur Narkose, während das Lidocain wirkt. Ziehen Sie nun 150 Mikroliter Luft in eine 250-Mikroliter-Gasaufhebungsspritze, die mit einer 22 Gauge langen stumpfen Nadel ausgestattet ist. Schieben Sie dann den Teflonkolben von der 150-Mikroliter-Markierung auf die 200-Mikroliter-Markierung auf dem Spritzenkörper vor, um beim Laden der Spritze 50 Mikroliter des bakteriellen Inokulums aufzusaugen.

LA, eine sedierte Maus, die auf einer Intubationsplattform sitzt und das Tier an den Schneidezähnen an einem Ring sichert, der an einem Velcro-Streifen befestigt ist, der mit der Plattform verbunden ist. Heben Sie die Maus auf eine Neigung von 45 Grad an und ziehen Sie dann mit einem Mikro-Baumwollapplikator die Zunge mit einer rollenden Bewegung mit der dominanten Hand zurück. Verwenden Sie als nächstes mit der nicht-dominanten Hand ein Operationsotoskop mit einem Intubationsspiegel, um sowohl die Zungenretraktion aufrechtzuerhalten als auch die Epiglottis sichtbar zu machen.

Halten Sie dann einen Führungsdraht, der durch einen 20-Gauge-Katheter gefädelt ist, in die dominante Hand, intubieren Sie die Maus bis zu einer Tiefe von 10 Millimetern in der Luftröhre und entfernen Sie das Otoskop. Befestigen Sie den Katheter mit der nicht dominanten Hand. Befestigen Sie dann kurz eine mit dem Köder verbundene Länge eines 16. durchsichtigen Schlauchs, der einen farbigen Farbstoff enthält, am Katheter.

Der Farbstoff sollte als Reaktion auf die Atmung des Tieres schnell hin und her wandern, wenn das Tier erfolgreich intubiert wurde. Führen Sie die stumpfe 22-Gauge-Nadel in den Katheter ein und geben Sie das Inokulum in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung direkt in die Lunge ab. Entfernen Sie dann sofort die Nadel und den Katheter vom Tier und bringen Sie die Maus unter Überwachung in ihren Käfig zurück, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat.

Um die bakterielle Belastung durch das infizierte Lungengewebe zu bewerten, entfernen Sie die Lunge mit steriler Technik und legen Sie das Gewebe in einen sterilen, vorgewogenen Probenbeutel von einer Unze. Geben Sie nach dem Wiegen des Probenbeutels und der Lunge einen Milliliter steriles PBS in das Gewebe und verkaufen Sie den Probenbeutel weiter. Rollen Sie dann vorsichtig eine 25-Milliliter-Serologiepipette über den Probenbeutel, um das Gewebe zu homogenisieren.

Entfernen Sie das verbundene Gewebe durch einen sterilen Polyester-Wandschichtfilter und behandeln Sie das Homogenat mit Tritton X 100 in einer Endkonzentration von 1 %, um die Bakterien freizusetzen. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um eine sechsfache serielle Verdünnung des Homogenats in einer UBO 96-Well-Platte durchzuführen. Verwenden Sie dann einen Mehrkanal mit acht Vertiefungen, um das Homogenat dreifach mit 10 Mikrolitern Aliquoten auf eine LBA-Agarplatte zu plattieren.

Zum Schluss inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und zählen am nächsten Tag die koloniebildenden Einheiten auf. Die Abgabe der Bakterien ist bei dieser Methode hocheffizient, wobei über 98% des Pseudomonas aerogen-Inokulums aus der Lunge der in diesem repräsentativen Experiment eingeträufelten Tiere gewonnen werden. Darüber hinaus ist die IIT-Installation unabhängig von der Konzentration des verabreichten Inokulums in hohem Maße reproduzierbar.

Um die Verteilung des instillierten Materials über die IIT-Methode zu visualisieren, können 50 Mikroliter 0,1%iger Kumasi Brilliant Blue Farbstoff in die Lunge abgegeben werden, wie gerade für das Inokulum demonstriert. Beachten Sie, dass die Verteilung des Farbstoffs auf alle Lungenlappen einmal beherrscht ist. Diese Methode kann mit einem Team von zwei Forschern in einer durchschnittlichen Zeit von zwei bis drei Minuten schnell durchgeführt werden, einschließlich Anästhesie, IMA-Impfung und Erholung von der Narkose.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, nicht mehr als zwei fehlgeschlagene Versuche zu unternehmen, die Maus zu intubieren. Eine fehlgeschlagene Intubation kann zu einem möglichen Trauma führen, wenn der Katheter in die Speiseröhre und nicht in die Luftröhre eingeführt wird. Viele Krankheitserreger der Atemwege, einschließlich solcher, die ein ABS L 3-Containment erfordern, können von imed effektiv abgegeben werden, da dieses Verfahren durchgeführt werden kann, wie in Sicherheitswerkbänken und zusätzlich von Forschern mit vollständigem Atemschutz einschließlich eines Gesichtsschutzes gezeigt wird.

Wir haben gezeigt, dass imit eine sehr genaue und effiziente Methode für die direkte Verabreichung von Materialien in die Lunge von Mäusen ist. Aufgrund dieser Eigenschaften eignet sich imit gut für GLP-Typstudien, die hochgradig reproduzierbare Modellsysteme erfordern.