Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA
1Department of Biology, University of Rochester, 2W. M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer, and Scripps Colleges

Published 1/06/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Larracuente, A. M., Ferree, P. M. Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes. J. Vis. Exp. (95), e52288, doi:10.3791/52288 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Deze aanpak is vooral effectief bij het in kaart brengen van zeer repetitieve sequenties te heterochromatische regio's, waar computationele benaderingen geconfronteerd onbetaalbaar uitdagingen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde protocol voor DNA-ISH dat formamide wast die standaard stappen in andere DNA-ISH protocollen zijn omzeilt. Ons protocol is geoptimaliseerd voor hybridisatie met korte enkelstrengs DNA probes die fluorescente kleurstoffen, die effectief markeren repeterende DNA sequenties binnen heterochromatic chromosomale regio's in een aantal verschillende insecten weefsel dragen. Echter, kunnen aanvragen worden uitgebreid om te gebruiken met grotere sondes en visualisatie van enkele kopie (niet-repeterende) DNA-sequenties. We tonen deze methode in kaart brengen van verschillende repetitieve sequenties te geplet chromosomen van Drosophila melanogaster neurale cellen en Nasoniavitripennis spermatocyten. We tonen hybridisatie patronen voor zowel kleine, commercieel gesynthetiseerde probes en voor een grotere probe voor vergelijking. Deze procedure maakt gebruik van eenvoudige laboratoriumbenodigdheden en reagentia, en is ideaal voor onderzoekers die weinig ervaring hebben met het uitvoeren van DNA-ISH.

Introduction

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Probes om enkele kopie gebieden in euchromatin kan worden opgewekt door een handvol benaderingen, zoals nick-translatie of end-labeling van lange DNA-producten 1,2 en de opname van deoxygenin (DIG) -attached nucleotiden en hun herkenning door allerlei -groep geconjugeerde antilichamen 1-3. Visualisatie van euchromatic sequenties in enkele of enkele kopie nummer vereist het gebruik van één enkele, grote probes met een hoge specifieke activiteit of een cocktail meerdere kleinere probes die gezamenlijk versterken signaal.

In tegenstelling, zeer repetitieve sequenties gevonden in heterochromatine, zoals satelliet-DNA's, zijn gemakkelijker doelwitten voor DNA-ISH, omdat ze normaal bestaan ​​als tientallen tot duizenden herhalingen geclusterd in één chromosoom regio bekend als blokken. Transposons kunnen ookgevonden bij hoge kopie nummers op verschillende chromosomale loci 2. In deze gevallen kan één probes met een lage specifieke activiteit effectief labelen heterochromatic sequenties vanwege hun hybridisatie op meerdere plaatsen. Probes repeterende sequenties kunnen worden gesynthetiseerd commercieel als korte oligonucleotiden (30-50 bp) en chemisch geconjugeerd met een van meerdere verschillende fluorescerende groepen. In kaart brengen van repetitieve sequenties binnen heterochromatinevorming met behulp van genoom-sequencing technologie is moeilijk te wijten aan uitdagingen in de bouw steigers binnen zeer repetitief satelliet blokken 4-6,7. Momenteel ISH staat als de meest effectieve manier van het in kaart brengen van deze sequenties op de sub-chromosoom niveau. Deze strategie is belangrijk voor het in kaart brengen van grote aantallen repetitieve sequenties die worden ontdekt door aanhoudende genoom en transcriptoom sequencing studies.

De efficiëntie en het gemak van het in kaart brengen repetitieve sequenties on-slide gemonteerd chromosomen zou worden greAtly versterkt door een vereenvoudigde protocol voor DNA ISH. Bijvoorbeeld, bestaande protocollen voor DNA-ISH betrekken meerdere wasbeurten van gehybridiseerd weefsels in formamide oplossing 2,8, dus aanzienlijk toe te voegen aan de vereiste tijd voor het in kaart brengen van sequenties en ook de productie van grote hoeveelheden chemisch afval voor deze dure reagens. Hier beschrijven we een gewijzigde DNA ISH methode de noodzaak van formamide wassingen omzeilt en gebruikt elementaire laboratoriumapparatuur en reagentia. Deze methode werd oorspronkelijk ontworpen voor de snelle kartering van sterk herhaalde DNA-sequenties in heterochromatic gebieden van Drosophila larven neuroblasts met commercieel gesynthetiseerde oligo's die zijn geconjugeerd met fluorescentie kleurstoffen. Deze methode werkt ook voor het in kaart brengen repetitieve sequenties door grotere probes gesynthetiseerd via andere middelen 9,10 en in meerdere verschillende weefsels en chromosoom types. Daarnaast kan deze methode gebruikt worden om euchromatic sequenties in kaart met behulp van langere of multiple, korte sondes binnen de euchromatic sequentie van belang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tissue Dissection en Fixatie (60 min)

  1. Voor Drosophila hersenen, plaats 3 e instar larven in een druppel 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing). Kies groot 3 e instar larven die actief kruipen uit flesjes of flessen die niet overvol zijn.
    1. Gebruik een ultrafijne pincet paar te houden van de mond haken en andere pincet pair te grijpen 2/3 de lengte van het lichaam (Figuur 1A, B) grijpen. Trek de mond haken aan de hersenen, ventrale ganglia, speekselklieren en een deel van de larvale spijsverteringskanaal bloot. Gebruik de pincet naar de hersenen en ventrale ganglia scheiden (Figuur 1A, B) van de andere weefsels en in een druppel 1x PBT (fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween) op een plastic Petri schaal.
  2. Voor Nasonia testis dissecties, kiest mannelijke 3-dagen oude poppen (geel lichaam met rode ogen). Man Nasonia hebben kleine vleugel pad lengtes ten opzichte van females tijdens het popstadium (figuur 1C).
    1. Houd de pop bovenaan de buik bij de thoracale gebied met een pincet paar en met de andere pincet paar, pak het distale uiteinde van de buik en trek de traan-vormige testes (ze worden omringd door fat lichaam die zachtjes kan worden geschud weg; figuur 1D). Losmaken elke uitwendige lichaamsdelen van de testes, die zal voorkomen dat de juiste kneuzingen, en plaats in een druppel 1x PBT op een plastic Petri plaat.
  3. Voor elk objectglaasje, ontleden totaal vier of vijf weefselmonsters (bv. Drosophila larven hersenen of Nasonia testes).
    OPMERKING: Meer dan vijf monsters zal leiden tot overvolle kernen en chromosomen.
  4. Eventueel enkele scheiding van zusterchromatiden in euchromatic gebieden van mitotische chromosomen bereiken, behandelen van het weefsel met een hypotone oplossing overbrengen hersenen van 1x PBT tot een daling van 0,5% natriumcitraat 5-10 (niet meer dan 10) min.
    OPMERKING: Colchicine (a Antimitoticum) kunnen nuttig voor het verhogen van het aantal mitotische figuren aan metafase 11 zijn. Echter, het gebruik ervan is niet nodig als zeer grote gezonde larven worden, en zelfs ongewenst, omdat het een negatieve invloed heeft op de chromosoom resolutie verspreiden en morfologie.
  5. Plaats een druppel (~ 20 pi) fixeeroplossing (2,5% paraformaldehyde in 45% azijnzuur) op het oppervlak van een schone Sigmacote behandelde dekglas.
    OPMERKING: Zorg fixeeroplossing vers voor elke dag van gebruik. Fixatief oplossingen gaande 1,8-3,7% paraformaldehyde in 45% azijnzuur geven de beste resultaten voor FISH. Het gebruik van andere dan de hersenen of testes weefsels, of het aanpassen van dit protocol voor immuno-FISH kan verlangen te experimenteren met verschillende fixatieven (voor een lijst van verschillende fixatieven, zie 12).
  6. Breng zorgvuldig elk weefselmonster van het ontleden buffer (1x PBT) in de fixatief druppel met ultrafijne pincet, minimizing van de overdracht van het ontleden van buffer in de fixeeroplossing. Plaats de weefselmonsters zodat zij op gelijke afstand van elkaar in het fixeermiddel druppel. Incubeer de weefsels in fixeermiddel gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Plaats een poly-lysine-gecoate slide gezicht voorzichtig naar beneden op het weefsel en dekglas. Druk niet op dit punt, maar in plaats daarvan laat de twee tot licht contact, zodat het dekglas plakt op de onderkant van de dia. Keer de glijbaan zodat het deksel slip is op de top.
  8. Sandwich de dia / weefsel / dekglas in een opgevouwen stuk filterpapier. Op een stabiele ondergrond, met de duim, drukt zeer stevig recht naar beneden op de locatie direct boven het deksel slip. Wees voorzichtig om te voorkomen dat zijdelingse schuifdeuren van het dekglas (dit zal vegen veroorzaken van het weefsel).
  9. Dompel de dia / weefsel / dekglas in vloeibare stikstof (zie apparaat in figuur 1E, F), en laat het staan ​​totdat de Stikstof stopt met koken (langer is fine). Verwijder de glijbaan en onmiddellijk snap het deksel slip met een frisse scheermesje door flicking een hoek van het dekglas in een opwaartse richting (geen krassen op de vaste weefsel met het scheermesje).
    1. Pre-koeling van de dia / weefsel / dekglas op een blok van droog ijs, dekking slip up, voor 1-2 min voorafgaand aan het onderdompelen in vloeibare stikstof zal helpen voorkomen dat de dia's van kraken.
  10. Onmiddellijk de dia met weefsel in een pot Coplin gevuld met 100% ethanol bij kamertemperatuur en laten staan ​​gedurende ten minste 5 minuten (deze tijd kan langer indien nodig).
    OPMERKING: koude 100% ethanol kunnen worden gebruikt.
  11. Verwijder de dia met weefsel, lont overtollige ethanol met een Kimwipe weg (zonder het aanraken van de vaste weefsel), en laat de schuif aan de lucht drogen gedurende 1 uur.
    1. Ga dan naar stap 2 of houden dia droog in de lage luchtvochtigheid of in een verdroging kamer voor weken tot zelfs maanden voor het uitvoeren van de hybridisatie.


Figuur 1: (A) Een 3 e instar Drosophila larve (rechts), met posities geïndiceerd voor waar aan de mond haken grijpen (aangeduid met *) en 2/3 van de weg naar beneden de larven aan hersenen ontleden; (Links) een schema van een larve een gelijk ontwikkelingsstadium, die de relatieve positie van de hersenen in het larvale weg. (B) De hersenen en ventrale ganglia ontleed een 3e instar Drosophila larve (rechts) en een schema van deze weefsel (links). (C) 3 dagen oude Nasonia pop bij de gele body-rode ogen stadium. (D) een testis paar ontleed van een 3 dagen oude Nasonia mannelijke pop (rechts) met posities aangeeft waar de pop grijpen aan de achterkant van het abdomen (aangegeven met *) en halverwege op het lichaam; (Links) schematische beeltenis van mannelijke en vrouwelijke wasp poppen; mannelijke poppen kunnen worden onderscheiden door vleugels die niet voorbij de sagittale profiel (zwarte pijl), in tegenstelling tot vrouwen die vleugels die zich uitstrekken langs het profiel; de relatieve positie van de testis paar wordt getoond in de mannelijke pop. (E) De inrichting-een reeks paperclips-en (F) methode om dia dompelen in een vat van vloeibare stikstof. Meerdere paperclip strings kan worden gebruikt voor gelijktijdige onderdompeling van meerdere dia.

2. In situ hybridisatie (30 minuten op dag 1, 1 uur, 2,5 uur lange probes op dag 2)

  1. Voeg 1 pl (100 ng) van elke probe 20 gl 1,1 x hybridisatiebuffer. Pipet sonde / hybridisatie buffer op het oppervlak van de vaste weefsel (vermijd contact met het weefsel).
  2. Plaats voorzichtig een dekglaasje direct op de sonde / hybridisatie buffer, en zorg ervoor dat het deksel slip direct wordt gecentreerd over het weefsel. De buffer moet migreren naar the buitenrand van het deksel slip, waardoor er geen luchtbellen.
    OPMERKING: Kleine bubbels die geen contact met het weefsel hebben geen problemen om de procedure niet opleveren. Verwijder grote luchtbellen door voorzichtig een tipje van de dekglas en voorzichtig laten vallen terug op de dia.
  3. Plaats de dia / weefsel / dekglas op het oppervlak van een blok voorverwarmd tot 95 ° C (cover slip up). Dek af met een groot stuk aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Laat de schuif incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min.
    OPMERKING: Een typische warmte blok met gaten voor buizen kan worden omgedraaid om een ​​plat oppervlak waarop de dia / weefsel / dekglas plaatsen bieden.
  4. Verwijder de glijbaan, laat het iets afkoelen totdat het warm aanvoelt. Wikkelen zorgvuldig een stuk uitgerekt Parafilm rond het dekglas om de vloeistof af te dichten eronder.
  5. Plaats de gesloten schuif in een vochtige kamer en plaats de kamer in een incubator voorverwarmd tot 30 ° C. Incubeer bij 30 ° C gedurende 4 uur tot overnacht.
    1. Maak een vochtige kamer van een lege tip doos of met deksel Tupperware container met vochtige Kimwipes of papieren handdoeken geplaatst op de bodem.
      OPMERKING: enkelstrengs DNA-oligo-probes werden ontworpen om 28-33 basen theoretische smelttemperatuur (Tm) van 45-47 ° C bereiken. Deze lengte en Tm reeksen weerspiegelen het feit dat veel repetitieve sequenties die we hebben bestudeerd zijn AT-rijk en hebben een zeer lage GC-gehalte dus. Langere probes zullen waarschijnlijk hogere Tm-waarden; Dit kan resulteren in hogere achtergrond hybridisatie bij standaard hybridisatie temperatuur van 30 ° C. Zo kunnen sommige problemen hybridisatie temperaturen gehouden de beste resultaten. Om de beste hybridisatietemperatuur, verhoging (of verlaging) van de temperatuur met 5 ° C vinden, stapsgewijs.
  6. Verwijder voorzichtig de Parafilm van de glijbaan en dan verwijder voorzichtig het deksel slip door langzaam te tillen één hoek. Wash de dia drie keer voor elk 15 minuten wassen in 0,1x SSC buffer. Bedek de Coplin pot met aluminiumfolie tijdens het wassen aan het licht blootstelling te minimaliseren.
  7. Als u geen lange gebiotinyleerde sonde, ga dan naar stap 2.8.
    1. Bij gebruik van een lange gebiotinyleerd sonde, droog het gebied rond het weefsel met een Kimwipe, zorg dat het weefsel zich niet aan te raken. Plaats 100 ul van het blokkeren oplossing over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, en zorg ervoor dat het opsluiten luchtbellen te vermijden. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min.
    2. Verwijder voorzichtig het dekglaasje en dep rond het weefsel met een Kimwipe. Pipet 100 ul van rhodamine-avidine verdund 1: 1.000 in SBT over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, de zorg om te voorkomen dat het vangen bubbels. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min.
    3. Verwijder het dekglaasje voorzichtig en was de glijbaan 3 keer gedurende 5 minuten elk in 4x SSCT en dan3 maal gedurende 5 minuten elk in 0,1x SSC.
      OPMERKING: Dia's kunnen worden gewassen voor een langere periode van tijd.
  8. Verwijder de glijbaan en dep rond het weefsel met een droge Kimwipe om overtollige buffer te verwijderen (vermijd contact met het weefsel). Plaats de dia weefsel kant naar boven op een donkere plaats voor 10-15 minuten of tot het vocht volledig verdwijnt.
  9. Pipetteer 11 ul Vectashield fixeermiddel (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool-DAPI) op het weefsel. Plaats een schoon dekglaasje (niet behandeld met Sigmacote) over het middelpunt van het fixeermiddel en de weefsels voorzichtig. Het fixeermiddel moet langzaam naar buiten migreren naar de randen van het dekglas.
    Opmerking: Als het fixeermiddel niet aan de rand van het dekglas rondom bereiken, wordt een 1-2 pi fixeermiddel worden aangebracht op één positie aan de rand van het dekglas van de benodigde volume te vullen. In dit geval moet u weg te vegen overtollige medium van de glijbaan oppervlak voordatafdichting.
  10. Dicht de randen van het dekglas met nagellak. Vermijd het schilderen van de nagellak over het weefsel monster.
  11. Plaats de dia rechtop in een donkere plaats en laat de nagellak droog tot het volledig vaste schijf (meestal 30 min of meer). Op dit punt, beeld het weefsel of bewaar bij -20 ° C gedurende 1 week later beeldvorming.

Buffer / Solution Recepten

10x PBS

  • 80 g NaCl
  • 2,0 g KCl
  • 14,4 g Na 2 HPO 4
  • 2,4 g KH 2 PO 4
  • pH 7,4, H 2 O tot 1 L

1x PBT

  • 5 ml 10x PBS
  • 45 ml H2O
  • 0,1% Tween 20

20x SSC

  • 175.3 g NaCl
  • 88,2 g Nacitraat
  • in 800 ml H2O
  • pH 7 H 2 O tot 1 L

4x SSCT

  • 200 ml 20x SSC
  • 799 ml H2
  • 0,1% Tween 20

0.1x SSC

  • 5 ml 20x SSC
  • 995 ml H2O

Hybridisatie mix (20 pl, gemodificeerd van 11)

  • 10 pl formamide
  • 4 ui 50% dextransulfaat
  • 2 pl 20x SSC
  • 4 ui H2O

SBT 8 (10 ml)

  • 2 ml 20x SSC
  • 0,01 g runderserumalbumine (BSA)
  • 10 ul Tween 20
  • 7,9 ml H2O

Blokkeeroplossing 8 (10 ml)

  • 0,3 g BSA
  • 10 ul Tween 20
  • 2 ml 20x SSC
  • 8 ml H2O

Fixatief met paraformaldehyde (1 ml)

  • 393,75 pi H 2 O (water toevoegen als eerste)
  • 450 ul ijsazijn
  • 156,25 pl 16% paraformaldehyde

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om deze methode te demonstreren we gehybridiseerd een reeks kleine commercieel gesynthetiseerde oligonucleotiden die chemisch zijn gemodificeerd met fluorescente conjugaten (figuur 2) en een langere gebiotinyleerd probe (gemaakt door nick translatie van een PCR-product Figuur 2B) om chromosomen van verschillende weefsels soorten (zie tabel 1). De doelwitsequenties satelliet opgenomen herhalingen gelegen in pericentromerische (heterochromatische) regio's van mitotische chromosomen van D. melanogaster larven neuroblasts (Figuur 2A-C) en meiotische chromosomen van popstadium N. vitripennis testes (figuur 2D). De hybridisaties in elk van deze gevallen bleek discrete bandenpatronen op sub-chromosomale regio. Een punt vermelden waard is dat de sonde naar de D. melanogaster 359 bp satelliet repeat zowel een grote multi-megabase paar blok op de X, en een veel kleiner gebied op chromosoom 3 erkent(Figuur 2A). Een langere sonde tegen de Responder satelliet detecteert ook herhaalde blokken bestaande uit relatief lage aantallen kopie herhalen (~ 700 kopieën; figuur 2B). Aldus maakt deze werkwijze visualisatie van zeer kleine satelliet blokken. Om u te helpen onthullen chromosoom structuur en hulp in chromosoomidentificatie, kan het nuttig zijn om de chromosomen te behandelen met een hypotone oplossing (in stap 1.5 beschreven) zijn. De weefsels in figuur panelen 2B en 2C werden behandeld met een hypotone oplossing 5 en 10 minuten respectievelijk. Let op de scheiding van zusterchromatiden groter met de langere behandeling (figuur 2C).

Figuur 2
Figuur 2: DNA in situ hybridisatie (A) larven neuroblast chromosomen van D. melanogaster /D. simulans hybriden; (B) en (C) larvale neuroblast chromosomen van D. melanogaster behandeld met hypotone oplossing (zie Dissection en Fixatie stap 1); (D) meiose chromosomen van pupal testis weefsel van het juweel wesp Nasonia vitripennis. In (A), groene pijlen geven kleine gebieden van AATAT satelliet op D. simulans 4e chromosoom, terwijl de groene pijlpunt wijst naar AATAT op D. melanogaster X-chromosoom. Rode pijl wijst op een klein gebied van 359 bp satelliet op de D. melanogaster 3e chromosoom, terwijl de rode pijl markeert 359 bp sequenties op X. Alle satellieten (A) werden gehybridiseerd met korte, fluorescent gelabelde oligo. In (B), de groene correspondeert met de AAGAG satelliet (gesynthetiseerd oligo) en het rode signaal 120 bp Responder satelliet (een gebiotinyleerde probe; gemarkeerdmet rode pijlen). (C) Dezelfde Responder satelliet met een korte fluorescent gelabelde oligo (rode pijl). In (D), de rode pijl markeert een satelliet die uniek is gelegen op het paternale sex ratio (PSR) chromosoom, dat is een niet-essentieel, boventallige B-chromosoom gevonden in natuurlijke populaties van N. vitripennis 13, terwijl de groene pijl geeft een satelliet op een van de normale chromosomen; Deze hybridisatie werd uitgevoerd door gebruik van korte, fluorescent gelabelde oligo. Alle sondes zijn in Tabel 1. Schaal bar in paneel (A) is 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Sonde naam Voelertype Oligo
AAGAG satelliet Oligo (AAGAG) 7 5 '6-FAM (Fluoresceïne)
AATAT satelliet Oligo (AATAT) 6 5'-Cy3
359-bp satelliet Oligo TTT TCC AAA TTT CGG TCA TCA AAT AAT CAT 5'-Alexa555
PSR satelliet Oligo TGT AAC TGG AAA AGG AAA ATG TAT TAT TGA 5'-Alexa555
Nasonia autosoom satelliet Oligo AAT TTT GTG AAT TTT GGT GTC TCC ATC 5'-Alexa633
Responder PCR F-5 'GGA AAA TCA CCC ATT TTG ATC GC Biotine-14-dATP
R-5 'CCG AAT TCA AGT ACC AGA C

Tabel 1: Probe soorten gebruikt in figuur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA ISH wordt vaak gebruikt om specifieke sequenties met chromosomen in kaart. We hebben een eenvoudige methode voor DNA-ISH geoptimaliseerd voor een groot aantal kopieën, heterochromatische sequenties beschreven. In plaats van het gebruik wast in een formamide oplossing, wat een vereiste is in andere bestaande DNA-ISH protocollen, plaatsen we weefsel gemonteerde dia's direct op een voorverwarmd blok aan DNA denatureren. Deze werkwijze omzeilt het gebruik van grote hoeveelheden formamide. Een cruciale stap voor het produceren van scherpe hybridisatiesignalen is om vers gemaakte fixatie oplossing te gebruiken; niet te doen (of het maken van nieuwe oplossing met paraformaldehyde, dat geopend is geweest voor meer dan een maand) kan het signaal resolutie moeten verlagen. Een beperking van deze methode is dat, net als andere DNA- ISH protocollen, de hybridisatietemperatuur kan optimalisering vereisen teneinde valse hybridisatie met off-target sequenties elimineren.

Dit protocol is gevoelig-korte, ssDNA sondes geconjugeerd met een enkele fluorophore per molecuul kunnen blokken van herhalingen op te sporen met een nog relatief lage aantallen kopie herhalen (bv ~ 700 Rsp herhaalt; figuur 2C). Signalen satelliet blokken met minder herhalingen worden gevisualiseerd korte ssDNA probes met een zeer gevoelige camera. Hoewel hier niet getoond, deze werkwijze ook effectief voor het in kaart brengen van niet-repetitieve sequenties in euchromatin 10. Met behulp van lange, gebiotinyleerde sondes biedt meer flexibiliteit bij het ​​opsporen van laag aantal kopieën sequenties als het signaal gemakkelijk kan worden versterkt door herhaalde behandelingen van gebiotinyleerd anti-avidine en rhodamine-avidine 9. Om losse sequenties visualiseren, kunnen meerdere sondes verspreid over de volgorde nodig zijn. Alternatief bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs) die de sequentie van belang door nick-translatie of willekeurige priming worden gemerkt voor gebruik als een probe voor niet-repeterende sequenties 10. Sequenties in kaart op een mooie schaal, sondes targeting different herhalingen (elk met verschillende fluoroforen) tegelijkertijd worden gebruikt om de positie van doelsequenties ten opzichte van andere repeats en structurele oriëntatiepunten op de chromosomen verkrijgen. Terwijl we twee sondes here (figuur 2A, B, D), kan het aantal probes gemakkelijk worden verhoogd tot drie 10 of meer, afhankelijk van het aantal verschillende fluorescentie microscoop filters beschikbaar. Dit protocol kan worden uitgebreid naar andere weefsels, we hebben vastgesteld dat het protocol werkt goed op polytene chromosoom pompoenen uit speekselklieren. Het is denkbaar dat deze methode worden gekoppeld met immuno-kleuring van chromatine eiwitten; Het is echter raadzaam dat de immuno-kleuring uitgevoerd als een eerste stap en vervolgens opnieuw fixatie met paraformaldehyde voor DNA ISH om antilichamen verlies tijdens DNA ISH voorkomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge) Dumont
22 x 22 mm cover slips Fisher Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear
Sigmacote Sigma
Filter paper 75 - 150 mm
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes
Coplin jars with slide grooves
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 ml microfuge tubes
Nail polish clear or colored
P20 micropipette and plastic tips
Paperclips 20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde Electron Microscopy Reagents
Acetic acid Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen
Rhodamine-Avidin Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 for detection of long biotinylated probe
Hybridization buffer Recipe above
4x SSCT Recipe above saline-sodium citrate + Tween
0.1x SSC Recipe above saline-sodium citrate
Blocking solution Recipe above
SBT Recipe above SSC, bovine serum albumin, Tween
1x PBT Recipe above phosphate-buffered saline + Tween
1x PBS phosphate-buffered saline
Hypotonic solution 0.5% sodium citrate in H2O
Formamide Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI Vector laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (9), (2009).
  2. Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
  3. Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (8), 1003-1006 (2011).
  4. Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3, (12), (2002).
  5. Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, (58331), 1625-1628 (2007).
  6. Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13, (1), 36-46 (2012).
  7. He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22, (12), 2507-2519 (2012).
  8. Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (3), (2010).
  9. Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27, (7), 1612-1620 (2010).
  10. Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7, (10), e1000234 (2009).
  11. Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118, (4), 759-773 (1992).
  12. Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
  13. Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117, (1), 85-101 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats