Een muis Foetale Skin Model van Scarless Wound Repair

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Walmsley, G. G., Hu, M. S., Hong, W. X., Maan, Z. N., Lorenz, H. P., Longaker, M. T. A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair. J. Vis. Exp. (95), e52297, doi:10.3791/52297 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Foetale huid wonden genezen snel en scarlessly tot laat in de dracht 1. Foetale scarless wondheling wordt gekenmerkt door regeneratie van normaal weefsel architectuur en functie. De overgang van een scarless littekens fenotype optreedt in het derde trimester van de zwangerschap bij de mens en ongeveer embryonale dag 18 (E18) bij muizen 2,3. In vergelijking met volwassen, foetale wondheling gekenmerkt door snelle epithelisatie, bindweefsel en fibroblast migratie.

Vele studies hebben mogelijke verklaringen voor het fenomeen van scarless wondgenezing aangeboden tijdens de vroege ontwikkeling van de foetus. Ontsteking is een fundamenteel onderdeel van volwassen wondheling; echter, foetale wonden gekenmerkt door het ontbreken van acute ontsteking 4. Of dit is een gevolg van de functionele onvolwassenheid van het immuunsysteem tijdens de foetale stadia blijft onduidelijk. Een recente studie suggereert dat de verschillen in de overvloed, maturity en functie van mestcellen in E15 vs E18 foetale huid kan verantwoordelijk zijn voor de overgang van een scarless fenotype, althans in de muis 3 zijn. Andere studies stellen dat verschillen in de eigenschappen en de overvloed van foetale en volwassen wonden macrofagen zijn verantwoordelijk voor de hervorming van normale extracellulaire matrix (ECM) tijdens de foetale wondheling 5.

Verschillen in omgevingsfactoren tijdens de foetale en volwassen ontwikkeling kan ook van invloed wondheling. Longaker en collega's toonden aan dat wondvocht uit de foetus beschikt over een hoog niveau van hyaluronzuur stimulerende activiteit vergeleken met geen bij volwassen wondvocht 6. Bijgevolg kan hogere hyaluronzuur, een glycosaminoglycaan die een micro bevorderlijk celmotiliteit en proliferatie bevordert, in het foetale wondmilieu verantwoordelijk voor de scarless fenotype waargenomen tijdens de vroege foetale ontwikkeling. Andere bewijslijnen wijzen erop dat de fetal wondmilieu is relatief hypoxemisch en ondergedompeld in steriele vruchtwater rijk aan groeifactoren 7. Er is echter geen definitief antwoord is voorzien van een kritieke gebeurtenis of factor tijdens de embryogenese dat de overgang van scarless regeneratie tot fibrotische reparatie triggers.

Inzicht in de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor scarless genezing in de foetus vereist een nauwkeurige en reproduceerbare model. Hier hebben we in detail een reproduceerbaar model van foetale scarless wondheling in het dorsale gedeelte van E16.5 (scarless) en E18.5 (littekens) muis embryo's. Daarnaast kunnen kleine wijzigingen van dit model worden gebruikt om een aantal verdere studies, zoals genexpressie analyse van foetale wonden en huid 8,9 voeren. Gezien het feit dat precies getimede zwangerschappen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle recapitulatie van deze foetale scarless wondgenezing model, hebben we ook detail ons protocol voor superovulatie getimed zwangerschappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures beschreven in dit document worden uitgevoerd op basis van door de Stanford administratieve Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) richtlijnen.

1. Timed zwangerschappen - superovulatie techniek (figuur 1)

OPMERKING: Juist de timing van de zwangerschapsduur van de muis embryo's voor foetale chirurgie bij E16.5 en E18.5 is van cruciaal belang. In deze paragraaf detail ons protocol voor timing muis zwangerschappen behulp drachtige merries serum (PMS) en humaan choriongonadotrofine (HCG) injecties om superovulatie induceren.

  1. Injecteer vrouwelijke muizen (<5 per kooi) intraperitoneaal (IP) met 3,0-5,0 internationale eenheden (IE) PMS in een volume van 100 pl PBS 1:00-3:00 gedurende 1 dag.
  2. Tussen 0:00 en 2:00 van dag 3 (vijfenveertig tot 47 uur na injectie PMS), injecteer vrouwelijke muizen IP met 3,0-5,0 IE HCG in een volume van 100 pl PBS.
    OPMERKING: De HCG injectie induceert eisprong ongeveer 12 uur na de injectie.
  3. Onmiddellijk na HCG injecties, paren vrouwen met mannen 8-16 weken oud.
    OPMERKING: We plaatsen doorgaans twee vrouwtjes in een kooi van individuele mannen.
  4. Gescheiden vrouwtjes van de mannetjes op de ochtend van dag 4 (6:00-10:00) en staat van dienst als foetale leeftijd E0.5.
    OPMERKING: Vaginale stekkers kan op dit moment worden gecontroleerd; Echter, de observatie van een vaginale plug niet zwanger te garanderen en vrouwtjes kunnen zwanger worden als er geen stekker is waargenomen. Gezien het feit dat de zwangerschap is meestal waarneembaar door visuele inspectie en / of palpatie bij een zwangerschapsduur E16.5 en E18.5, het controleren voor vaginale stekkers op de ochtend van dag 4 is niet strikt noodzakelijk. In onze ervaring, en afhankelijk van de stam, ongeveer 30-50% van super-geovuleerde vrouwtjes zwanger wordt volgens de hieronder beschreven techniek.

pg "/>
Figuur 1. Schematische voor superovulatie Techniek. Schematische weergave procedure voor superovulatie getimede zwangerschappen bij muizen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Murine foetale chirurgie (Dorsal Verwonding) op E16.5 en E18.5 embryo (figuur 2)

  1. Voordat de procedure, reinig alle oppervlakken van de operatiekamer en de uitrusting met 70% isopropylalcohol. Bovendien steriliseren alle chirurgische benodigdheden en instrumenten die in de procedure gebruikt worden door ze te autoclaveren. Sommige instellingen kunnen latere gebruik van hete kraal sterilisatie mogelijk te maken. Per verrichting, gebruik steriel packs die gaas en chirurgische instrumenten omvatten.
  2. Induceren anesthesie bij zwangere moeders (foetale leeftijd E16.5 of E18.5) minder dan 2,5% isofluraan / zuurstof mengsel bij 2 L per minuut gevolgd door onderhoud anesthesie bij 1 liter per minuut.
  3. Om confirma juiste verdoving, zorgen de diepe pedaal reflexen van de muis worden onderdrukt en plaats de muis in buikligging.
  4. Breng een dierenarts oogzalf zoals Puralube om oogirritatie of droogte tijdens de procedure te voorkomen.
  5. Bereid je buik door het toedienen van een lichte toepassing van ontharingscrème niet langer dan 30 sec (Figuur 2A).
  6. Bereid buik aseptische chirurgie met povidon-jodium en alcohol (figuur 2B en 2C).
  7. Voer middellijn laparotomie onder microscoop met microchirurgische schaar (figuur 2D en 2E).
  8. Voorzichtig bloot baarmoeder en foetus geselecteerd voor een operatie (figuur 2F).
  9. Spoel chirurgisch veld met warm (38 ° C) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een stompe punt naald
    OPMERKING: Men kan gemaakt worden door voorzichtig buigen van de punt van een grote diameter naald. (Figuur 2G en 2H).
  10. Plaats de foetus op een wijze waarmees volledige toegang tot dorsum.
  11. Passeren een beurskoord steek behulp 7-0 nylon hechtdraad door de baarmoeder overliggende de site van beoogde dorsale verwonding (figuur 2I). Plaats beurskoord over een gebied van dorsum links of rechts van het ruggenmerg, en in een gebied van baarmoederwand zonder grote bloedvaten.
  12. Voeg een 3 mm incisie door baarmoederwand en vruchtzak in het midden van de beurskoord (Figuur 2J).
  13. Irrigeren incisie site met warm (38 ° C) PBS.
  14. Met microchirurgische schaar, knippen één volledige dikte excisie wond, ongeveer 1 mm in lengte in het dorsum van de foetus.
  15. Blot de incisieplaats droog met katoen-tip applicator.
  16. Injecteer 3 ul volume-Indische inkt subcutaan in de wond om de locatie van de wond (figuur 2K) te markeren.
  17. Spoelen met een warm (38 ° C) PBS om ervoor te zorgen inkt is binnen wond behouden.
  18. Heb chirurgische assistent inject warm (38 ° C) PBS door stompe-tip 10 G spuit in de vruchtzak als de portemonnee snaar wordt gesloten (Figuur 2L). Intrekken spuit als afsluiting beurskoord nadert voltooiing (Figuur 2 M).
  19. Voorzichtig terug baarmoeder in de buikholte (Figuur 2N).
  20. Evert de huid en het buikvlies.
  21. Hebben chirurgische assistent irrigeren buikholte met warm (38 ° C) PBS.
  22. Sluiten buik snel door nieten huid en het buikvlies gesloten (Figuur 2O). De standaard sluiting in twee lagen; peritoneum en buikspier in één laag, onderhuidse weefsel en de huid in de tweede laag. Voor onmiddellijke opoffering en het oogsten van de foetus, onze demonstratie toont sluiting in één laag.
  23. Plaats het dier onder observatie in een warme incubator ingesteld op 37 ° C gedurende 30 minuten of totdat het dier herwint voldoende bewustzijn borstligging handhaven.
  24. Niet return het dier naar het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld van de procedure.
  25. Na ontwaken uit anesthesie en gedurende de daaropvolgende 48 uur, toedienen subcutane injectie van buprenorfine (0,05 mg / kg) per 12 uur analgesie als nodig is gebaseerd op pijnbeoordeling. Dien carprofen (5 mg / kg) subcutaan extra postoperatieve pijn als nodig.
  26. Terug dieren naar de kooi en hen met voedsel en water ad libitum.
  27. Nauwgezet controleren voor uitingen van pijn.
  28. 48 uur na de operatie, offeren zwangere moeder met een overdosis van isofluraan en oogst gewond foetus. Om dit te doen, passen isofluraan concentratie 5% of hoger en-blootstelling gedurende 1 min na ademstilstand. Bevestig euthanasie met cervicale dislocatie. Oogst een gewonde embryo voor leeftijd gematchte controle. Na embryo een afzonderlijk werkwijze euthanasie overeenstemming met IACUC aanbevelingen hebben, zoals decapitation, cervicale dislocatie, of chemische injectie.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische voor murine foetale chirurgie. Algemene stappen dorsale verwonden E16.5 en E18.5 muizenembryo's. (A) Ontharen van muizen abdomen. (B en C) Bereiding van muis abdomen. (D) microscoop voor chirurgisch procedure. (E) Midline laparotomie. (F) Blootstelling van de baarmoeder. (G) Creatie van stompe-tip naald. (H) Irrigatie van de baarmoeder met warme zoutoplossing. (I) Creatie van beurskoord hechtdraad. (J) incisie door uteriene muur en 1 mm volledige dikte excisional wond generatie. (K) Subcutane injectie van Oost-Indische inkt. (L en M) Sluiting van beurskoord hechtdraad. (N en O)Sluiting van de buik. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor histologische analyse, moet huidwonden in de dorsale huid van E16.5 en E18.5 muizenembryo's geoogst 48 uur na verwonding, in 4% PFA gefixeerd en in paraffine ingebed. In fluorescerende transgene modellen, kan cryopreservatie met oktober passend zijn. Er zijn verschillende vlekken die kunnen worden gebruikt om cellulaire en bindweefsel architectuur visualiseren. Hematoxyline en eosine is een twee-kleuren beits die kernen blauw en eosinofiele structuren (bijv., Cytoplasma en extracellulaire collageen) verschillende tinten rood, roze en oranje vlekken. Mallory's trichroom een ​​driekleurige vlekken van aniline blauw, zuur fuschin en oranje G, meest geschikt voor het onderscheiden van cellen uit omringende bindweefsel.

Figuur 3
Figuur 3. Histologie van Scarless E16.5 Foetale Wonden. (A) hematoxyline en eosine kleuring reveals volledige re-epithelialisatie en een lichte toename van het aantal ontstekingscellen (pijlen). (100x; bar = 100 urn) (B) eosine kleuring toont India inkt (pijlpunten) ongeveer regenereren haarfollikels (pijl) (400x; bar = 25 . urn) (C) Mallory's trichroom kleuring onthult een fijn reticulair dermaal collageen patroon met de aanwezigheid van een haarfollikel (400x; bar = 25 pm). Overgenomen met toestemming van Colwell et al. 10 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Als dorsale excisie wonden van de juiste grootte (1 mm) en diepte (volledige dikte), zal hematoxyline en eosine kleuring van het aantal inflammatoire blijkt dat E16.5 huid genezen met minimale littekenvorming, volledige re-epithelialisatie en slechts een geringe stijging cellen (Figuur 3A). Bovendien zijn deze wounds moeten genezen met ongeveer normale huid architectuur en bevatten regenereren haarzakjes in de plaats van het letsel (pijlen; Figuur 3B). De juiste toepassing van India inkt de vers gemaakt wond zou leiden inkt afzetting op de plaats van letsel (pijlpunten Figuur 3B). Ten slotte moet trichroomkleuring een boete reticular huidcollageen patroon kenmerkend unscarred dermis (Figuur 3C) onthullen.

Figuur 4
Figuur 4. Histologie van Littekens E18.5 Foetale Wonden. (A) hematoxyline en eosine kleuring onthult een toename eosine kleuring in de dermis op de plaats van letsel (pijlen). (200x; bar = 50 urn) (B) Mallory's trichroom kleuring toont dichte dermaal collageen (pijlen) (400x; bar = 25 pm). Overgenomen met toestemming van Colwell et al.10

In vergelijking met wonden die op E16.5, hematoxyline en eosine kleuring van dorsale wonden die op E18.5 en geoogst 48 uur na de verwonding moet dicht litteken verlies van normale huid architectuur aan de plaats van de verwonding (figuur 4A) onthullen. Ook trichroomkleuring onthult een dicht patroon van ongeorganiseerd collageen depositie (pijlen; Figuur 4B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De chirurgische protocol hier gepresenteerde beschrijft een excisional model van foetale muizen scarless genezing voor het eerst gepubliceerd in 2006 door ons laboratorium 10. In aanvulling op de overige modellen van excisional verwonden 11, incisional modellen van foetale muizen scarless genezing bestaan ​​ook 12,13. Onderzoeken van foetale scarless wondgenezing bij de aap, lam, konijn, opossum, en ratten zijn gemeld 14-17. Echter, muizen vormen een ideaal model voor het verkennen van de foetus scarless wondgenezing als gevolg van hun relatief lage per-diem kooi kosten en goed gekarakteriseerde genoom. Bovendien kan temporele en ruimtelijke genetische verlies / winst van functie worden bereikt tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van muis transgene systemen bieden mogelijkheden om de mechanismen van scarless reparatie precies ontcijferen.

Ondanks deze voordelen, muizen presenteren bepaalde technische problemen tijdens de foetale chirurgie vanwege hun kleine omvang. Gezien destress van anesthesie op een zwangere moeder, moet grote zorg worden genomen om het niveau van isofluraan / zuurstof wordt toegediend bewaken. Een mengsel van 2,5% isofluraan / zuurstof bij 2 L per minuut gevolgd door onderhoud anesthesie bij 1 liter per min moeten zorgvuldig worden nageleefd. Afwijkingen of schommelingen in deze kritieke factor kan aanzienlijke gevolgen hebben morbiditeit. Juiste plaatsing van de beurskoord hechtdraad vertegenwoordigt de technisch meest uitdagende aspect van de operatie. Doet u dit steek juiste plaats zal leiden tot het lekken van vruchtwater en PBS post-closing. Een onvoldoende hoeveelheid vloeistof in de baarmoeder zal leiden tot trauma aan het embryo en kunnen premature uteruscontractie induceren. Daarom vervanging vruchtwater verloren bij het openen van de baarmoeder is een kritische stap in deze chirurgische model. Zorg moet worden genomen om voortdurend werpen warm PBS als beurskoord gesloten. Deze factoren vereist aanzienlijke problemen oplossen en we benadrukken dat de aandacht voor deze detailszal de waarschijnlijkheid van een succesvolle operatie verhogen. Maar zelfs die met ervaren chirurgische handen moet plan voor een morbiditeit van ongeveer 40% in E16.5 foetussen.

Inzicht in foetale scarless wondgenezing houdt value for Translational Medicine gericht op het in vivo modulatie van fibrogene gedrag tijdens volwassen stadia van ontwikkeling. In vergelijking tot volwassen huid, foetale huid heeft een ontwikkelingsland dermis, verminderde treksterkte, ontluikende haarzakjes, en verschillende ECM componenten 2,4. Foetale huid heeft een verhoogde verhouding van collageen type III type I in vergelijking met volwassen huid, minder en minder rijpe mestcellen Expressie van Keratine 8 en 19, en hogere niveaus van hyaluronzuur in vergelijking met volwassen huid 4,9. Door het ontcijferen van de mechanismen die ten grondslag liggen scarless genezing in de foetus, kunnen we beginnen met de moleculaire en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor fibrose in de volwassene naar een regeneratieve fenotype te sturen. De opkomst of lineage tracing en andere genetische hulpmiddelen in de muis zijn veelbelovende nieuwe wegen voor onderzoek naar foetale scarless wondgenezing geopend. Gezien de inherent hoge tarieven van ziekten en voortijdige uteruscontractie geassocieerd met foetale chirurgie, onderzoeken van foetale scarless huid wondgenezing in vivo vereisen een nauwkeurige en herhaalbare chirurgische model. Hier hebben we in detail een reproduceerbaar model van foetale scarless wondheling in het dorsale gedeelte van E16.5 (scarless) en E18.5 (littekens) muis embryo's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit werk werd mede ondersteund door een subsidie ​​van de NIH-subsidie ​​R01 GM087609 (tot HPL), een geschenk van Ingrid Lai en Bill Shu ter ere van Anthony Shu (tot HPL), NIH-subsidie ​​U01 HL099776 (tot MTL), de Hagey Laboratorium voor Pediatric Regenerative Medicine en The Oak Foundation (tot MTL en HPL). GGW werd gesteund door de Stanford School of Medicine, de Stanford Medical Scientist Training Program, en NIGMS training subsidie ​​GM07365. MSH werd ondersteund door CIRM Klinische Fellow Training Grant TG2-01159. WXH werd ondersteund door financiering uit de Sarnoff Cardiovascular Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-O MONOSOF Suture eSuture SN-1647G
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Autoclip 9 mm Texas Scientific Instruments 205060
Insulin Syringe Thermo Fisher Scientific 22-272-382
Black Pigment AIMS 242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe BD Biosciences 309596
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS) Millipore 367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG) Sigma-Aldrich CG10
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larson, B. J., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Scarless fetal wound healing: a basic science review. Plastic and reconstructive surgery. 126, 1172-1180 (2010).
  2. Wilgus, T. A. Regenerative healing in fetal skin: a review of the literature. Ostomy/wound management. 53, 16-31 (2007).
  3. Wulff, B. C., et al. Mast cells contribute to scar formation during fetal wound healing. The Journal of investigative dermatology. 132, 458-465 (2012).
  4. Lorenz, H. P., Adzick, N. S. Scarless skin wound repair in the fetus. The Western journal of medicine. 159, 350-355 (1993).
  5. Longaker, M. T., et al. Wound healing in the fetus. Possible role for inflammatory macrophages and transforming growth factor-beta isoforms. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 2, 104-112 (1994).
  6. Longaker, M. T., et al. Studies in fetal wound healing. IV. Hyaluronic acid-stimulating activity distinguishes fetal wound fluid from adult wound fluid. Annals of surgery. 210, 667-672 (1989).
  7. Colombo, J. A., Napp, M., Depaoli, J. R., Puissant, V. Trophic influences of human and rat amniotic fluid on neural tube-derived rat fetal cells. International journal of developmental neuroscience : the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 11, 347-355 (1993).
  8. Colwell, A. S., Longaker, M. T., Peter Lorenz, H. Identification of differentially regulated genes in fetal wounds during regenerative repair. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16, 450-459 (2008).
  9. Hu, M. S., et al. Gene expression in fetal murine keratinocytes and fibroblasts. The Journal of surgical research. (2014).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. An in vivo mouse excisional wound model of scarless healing. Plastic and reconstructive surgery. 117, 2292-2296 (2006).
  11. Wilgus, T. A., et al. The impact of cyclooxygenase-2 mediated inflammation on scarless fetal wound healing. The American journal of pathology. 165, 753-761 (2004).
  12. Iocono, J. A., Ehrlich, H. P., Keefer, K. A., Krummel, T. M. Hyaluronan induces scarless repair in mouse limb organ culture. Journal of pediatric surgery. 33, 564-567 (1998).
  13. Chopra, V., Blewett, C. J., Krummel, T. M. Transition from fetal to adult repair occurring in mouse forelimbs maintained in organ culture. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 5, 47-51 (1997).
  14. Adzick, N. S., Longaker, M. T. Animal models for the study of fetal tissue repair. The Journal of surgical research. 5, 47-51 (1991).
  15. Block, M. Wound healing in the new-born opossum (Didelphis virginianam). Nature. 187, 340-341 (1960).
  16. Longaker, M. T., Dodson, T. B., Kaban, L. B. A rabbit model for fetal cleft lip repair. Journal of oral and maxillofacial surgery : official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 48, 714-719 (1990).
  17. Longaker, M. T., et al. A model for fetal cleft lip repair in lambs. Plastic and reconstructive surgery. 90, 750-756 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics