Eine Maus fetalen Hautmodell von Scarless Wound Repair

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Walmsley, G. G., Hu, M. S., Hong, W. X., Maan, Z. N., Lorenz, H. P., Longaker, M. T. A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair. J. Vis. Exp. (95), e52297, doi:10.3791/52297 (2015).

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Abstract

Introduction

Fetal Haut Wunden heilen schneller und scarlessly bis spät in der Schwangerschaft ein. Fetal narben Wundheilung wird durch Regeneration der normalen Gewebearchitektur und Funktion. Der Übergang von einer narben Vernarbung Phänotyp tritt im dritten Trimester der Schwangerschaft beim Menschen und um embryonale Tag 18 (E18) in den Mäusen 2,3. Im Vergleich zu Erwachsenen ist fetalen Wundheilung durch schnelle Epithelisierung, Bindegewebsablagerung und Fibroblasten-Migration aus.

Viele Studien haben mögliche Erklärungen für das Phänomen der narbenfreien Wundheilung während der frühen fetalen Entwicklung angeboten. Die Entzündung ist eine grundlegende Komponente der Erwachsenen Wundheilung; jedoch fötalen Wunden durch einen Mangel an akuter Entzündung 4 gekennzeichnet. Ob dies eine Folge der funktionellen Unreife des Immunsystems während der fötalen Stadien bleibt unklar. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die Unterschiede in der Fülle, matturity und Funktion von Mastzellen in E15 vs. E18 fötalen Haut kann für den Übergang von einer narben Phänotyp, zumindest in der Maus 3 durchgeführt wird. Andere Studien postulieren, dass Unterschiede in den Eigenschaften und Fülle von fötalen und erwachsenen Wund Makrophagen für die Reformierung von normalen extrazellulären Matrix (ECM), während der fetalen Wundheilung 5 zuständig sind.

Unterschiede in der Umweltfaktoren während der fetalen und adulten Entwicklung kann auch Auswirkungen auf die Wundheilung. Longaker und Kollegen zeigten, dass Wundflüssigkeit vom Fötus im Vergleich zu keiner in der Erwachsenenwundflüssigkeit 6 besitzt ein hohes Maß an Hyaluronsäure-stimulierende Aktivität. Folglich können höhere Niveaus von Hyaluronsäure, Glycosaminoglycan, das eine Mikroumgebung zuträglich Zellmotilität und Proliferation fördert, in der fetalen Wundumgebung zur narben Phänotyp während der frühen Entwicklung des Fötus gesehen verantwortlich. Andere Beweislinien weisen darauf hin, dass die Fetal Wundumgebung ist relativ hypoxämischen und in sterile Fruchtwasser reich an Wachstumsfaktoren 7 getaucht. Es wurde jedoch keine definitive Antwort für ein kritisches Ereignis oder Faktor während der Embryogenese, die den Übergang von der narbenfreien Regeneration fibrotische Reparatur löst vorgesehen.

Das Verständnis der Mechanismen für narbenheil im Fötus verantwortlich erfordert eine präzise und reproduzierbare Modell. Hier werden wir ausführlich ein reproduzierbares Modell der fetalen narben Wundheilung im Rücken E16.5 (narben) und E18.5 (Vernarbung) Maus-Embryonen. Zusätzlich können kleinere Abweichungen von diesem Modell verwendet werden, um eine Reihe von weiteren Untersuchungen wie Genexpressionsanalyse von fötalen Wunden und Haut 8,9 durchzuführen. Da die zeitgenaue Schwangerschaften sind entscheidend für eine erfolgreiche Wiederholung des fetalen narben Wundheilung Modell haben wir auch ausführlich unser Protokoll für die Superovulation zeitlich Schwangerschaften.

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Protocol

HINWEIS: Alle in diesem Dokument beschriebenen Verfahren werden nach den Richtlinien der Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) errichtet wird.

1. Timed Schwangerschaften - Superovulation Technik (Abbildung 1)

HINWEIS: Präzise Zeitmessung der Schwangerschaftsdauer von Maus-Embryonen für die fetale Chirurgie an E16.5 und E18.5 ist von entscheidender Bedeutung. In diesem Abschnitt wird detailliert unser Protokoll für Zeit Maus Schwangerschaften mit trächtigen Stuten Serum (PMS) und humanes Choriongonadotropin (HCG) Injektionen Superovulation induziert.

  1. Injizieren weiblichen Mäusen (<5 pro Käfig) intraperitoneal (IP) mit 3,0-5,0 internationalen Einheiten (IU) des PMS in einem Volumen von 100 ul PBS 1.00 bis 3.00 für 1. Tag.
  2. Zwischen 00.00 und 02.00 Uhr des Tages 3 (fünfundvierzig bis 47 Stunden nach der Injektion PMS), spritzen weibliche Mäuse IP mit 3,0-5,0 IU von HCG in einem Volumen von 100 ul PBS.
    HINWEIS: Die HCG-Injektion induziert Eisprung etwa 12 Stunden nach der Injektion.
  3. Unmittelbar nach HCG-Injektionen, mate Frauen mit Männern im Alter von 8 bis 16 Wochen.
    HINWEIS: Wir legen in der Regel zwei Weibchen in einen Käfig einzelner Männchen.
  4. Separate Weibchen von Männchen am Morgen des 4. Tag (6.00 bis 10.00 Uhr) und Rekord als Fetalalter E0.5.
    HINWEIS: Vaginal Stecker können zu diesem Zeitpunkt überprüft werden; Allerdings ist die Beobachtung eines Vaginalpfropf nicht garantieren, Schwangerschaft und Frauen können schwanger werden, wenn kein Stecker eingehalten wird. Da die Schwangerschaft ist typischerweise beobachtbaren durch visuelle Inspektion und / oder Abtasten in verschiedenen Schwangerschaftsstadien E16.5 und E18.5, Überprüfung auf Vaginalpfropf am Morgen des Tages 4 ist nicht unbedingt erforderlich. Nach unserer Erfahrung und in Abhängigkeit von der Belastung, etwa 30-50% der super Eisprung Frauen schwanger werden, mit der hier beschriebenen Technik.

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Abbildung 1. Schematische für Superovulation Technik. Schema, das Verfahren für die Superovulation zeitlich Schwangerschaften bei Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

2. Murine Fetale Chirurgie (Rücken Verwundung) auf E16.5 und E18.5 Embryonen (Abbildung 2)

  1. Vor dem Eingriff, Reinigen Sie alle Oberflächen des Operationssaals und Ausrüstung mit 70% Isopropylalkohol. Zusätzlich zu sterilisieren alle chirurgisches Material und Instrumente, die im Rahmen des Verfahrens durch Autoklavieren sie verwendet werden soll. Einige Institutionen kann die anschließende Verwendung von heißen Perle Sterilisation zu ermöglichen. Pro Betrieb verwenden steril verpackt, die Gaze und chirurgische Instrumente umfassen.
  2. Induzieren Anästhesie in schwangere Mütter (fetale Alter E16.5 oder E18.5) unter 2,5% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch in 2 l pro Minute, gefolgt von Wartung Anästhesie mit 1 l pro min.
  3. Um conFirma ordnungsgemäße Betäubung, sicherzustellen, dass die tiefen Pedal Reflexe der Maus unterdrückt werden und die Maus in der Bauchlage.
  4. Tragen Sie einen Tierarzt Augensalbe wie Puralube, das Augenreizungen oder Trockenheit während des Verfahrens zu verhindern.
  5. Bereiten Bauch durch Verabreichung einer Licht Anwendung Enthaarungscreme für nicht mehr als 30 Sekunden (Abbildung 2A).
  6. Bereiten Bauch für aseptische Chirurgie mit PVP-Jod und Alkohol (2B und 2C).
  7. Führen Mittellinie Bauchschnitt unter dem Mikroskop mit mikrochirurgischen Schere (Abbildung 2D und 2E).
  8. Aussetzen vorsichtig Gebärmutter und Fötus für Chirurgie (2F) ausgewählt.
  9. Spülen Operationsfeld mit warmem (38 ° C) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem stumpfen Nadel-Spitze
    HINWEIS: Man kann durch vorsichtiges Biegen der Spitze einer großen Injektionsnadel aus vorgenommen werden. (2G und 2H).
  10. Positionieren Sie den Fötus in einer Weise, die ess vollen Zugriff auf Rücken.
  11. Übergeben Sie eine Tabaksbeutelstich mit 7-0 Nylonnaht durch die Gebärmutter, die über dem Ort der beabsichtigten Rücken Verwundung (2I). Position Schnürfaden über einen Bereich des Rückens nach links oder rechts von Rückenmark und in einem Bereich der Gebärmutterwand frei von großen Blutgefäßen.
  12. Machen Sie eine 3 mm Schnitt durch Gebärmutterwand und Fruchtblase in der Mitte der Tabaksbeutel (2J).
  13. Bewässern Inzisionsstelle mit warmem (38 ° C) PBS.
  14. Mit mikrochirurgischen Schere, schnitt ein einziges Vollhaut Exzisionswunde, ca. 1 mm in der Länge, in dem Rücken des Fötus.
  15. Sanft Blot Inzisionsstelle trocknen mit Baumwolle-Spitze-Applikator.
  16. Injizieren 3 ul Volumen Tusche subkutan in die Wundstelle zu Lage der Wunde (Abbildung 2 K) zu markieren.
  17. Bewässerung mit warmem (38 ° C) PBS sicherzustellen Tinte innerhalb Wundstelle beibehalten.
  18. Haben chirurgischen Assistenten inject warm (38 ° C) PBS durch stumpfen Spitze 10 G-Spritze in die Fruchtblase wie die Tabaksbeutelnaht geschlossen ist (Abbildung 2 l). Einfahren Spritze Tabaksbeutelverschluss nähert sich der Fertigstellung (Abbildung 2 M).
  19. Gebärmutter vorsichtig in die Bauchhöhle (Abbildung 2 N) zurück.
  20. Evert Haut und Bauchfell.
  21. Haben chirurgischen Assistenten bewässern Bauchhöhle mit warmem (38 ° C) PBS.
  22. Schließen Bauch schnell von Heften Haut und Bauchfell geschlossen (Abbildung 2 O). Die Standardverschluss in zwei Schichten durchgeführt wird; Peritoneum und Bauchmuskeln in einer Schicht, Unterhaut und Haut in der zweiten Schicht. Zur sofortigen Opfer und Ernte der Frucht, zeigt unsere Demonstration Schließung in einer Schicht.
  23. Legen Sie das Tier unter Beobachtung in einem warmen Inkubator bei 37 ° C für 30 Minuten oder bis das Tier gewinnt ausreichend Bewusstsein Brustlage zu halten einstellen.
  24. Ret nichtUrne das Tier an die Firma von anderen Tieren bis er vollständig von dem Verfahren zurückgewonnen.
  25. Nach dem Erwachen aus der Narkose und bei der anschließenden 48 Stunden, zu verwalten subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg / kg) alle 12 h für die Analgesie nach Bedarf auf Basis von Schmerzbeurteilung. Verwalten Carprofen (5 mg / kg) subkutan injiziert wird für zusätzliche postoperative Schmerzlinderung nach Bedarf.
  26. Zurück Tiere in den Käfig und sie mit Nahrung und Wasser ad libitum.
  27. Überwachen Sie sorgfältig auf Manifestationen Schmerzen.
  28. 48 Stunden nach der Operation, zu opfern schwangere Mutter mit einer Überdosis Isofluran und Ernte verwundet Fötus. Um dies zu tun, passen Isofluran-Konzentration auf 5% oder höher und aufrechtzuerhalten Exposition für 1 min nach dem Atemstillstand. Bestätigen Sie die Sterbehilfe mit Genickbruch. Ernten Sie einen unverletzten Embryo für altersangepassten Kontroll. Späte Embryonen eine separate Methode der Euthanasie im Einklang mit IACUC Empfehlungen, wie haben deKopfpauschale, Genickbruch oder chemische Injektion.

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische für Murine Fetale Chirurgie. Allgemeine Schritte für die Rücken Verwundung in E16.5 und E18.5 Maus-Embryonen. (A) Enthaarung der Maus Bauch. (B und C) Herstellung der Mausunterleib. (D) Mikroskop für chirurgische Verfahren. (E) Mittellinie Laparotomie. (F) Bei der Gebärmutter. (G) Erstellung von stumpfen Spitze Nadel. (H) Bewässerung der Gebärmutter mit warmer Kochsalzlösung. (I) Schaffung von Tabaksbeutelnaht. (J) Incision durch uterine Wand und 1 mm Dicke Voll Exzisionswunde Generation. (K) Die subkutane Injektion von Tusche. (L und M) Schließung der Tabaksbeutelnaht. (N und O)Schließung des Bauches. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Representative Results

Für die histologische Analyse sollte Hautwunden in die Rückenhaut von E16.5 und E18.5 Maus-Embryonen 48 h nach der Verletzung, in 4% PFA fixiert und in Paraffin eingebetteten geerntet werden. In fluoreszierende transgenen Modellen kann Kryokonservierung mit Oktober geeignet. Es gibt mehrere Flecken, die verwendet werden, um zelluläre und Bindegewebe Architektur Visualisierung verwendet werden kann. Hämatoxylin und Eosin ist ein Zwei-Farben-Fleck, Kerne blau und eosinophile Strukturen (dh., Zytoplasma und extrazellulären Kollagen) verschiedenen Schattierungen von rot, rosa, orange färbt. Mallory Trichrom ist ein Drei-Farben-Fleck bestehend aus Anilin Blau, Säurefuchsin und Orange G, am besten geeignet für die Unterscheidung von Zellen umgebenden Bindegewebes.

Figur 3
Abbildung 3. Histologie der Scarless E16.5 Fetal Wunden. (A) Hämatoxylin und Eosin-Färbung WiederVeals vollständige Reepithelialisierung und ein leichter Anstieg in der Zahl der Entzündungszellen vorhanden (Pfeile). (100x; bar = 100 um) (B) Eosin-Färbung zeigt Tusche (Pfeilspitzen) um regenerierende Haarfollikel (Pfeil) (400x; bar = 25 . um) (C) Mallory-Trichrom-Färbung zeigt eine feine netzartige Hautkollagen-Muster mit der Gegenwart eines Haarfollikels (400x; bar = 25 & mgr; m). Mit freundlicher Genehmigung von Colwell et al. 10 Nachdruck Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Wenn dorsalen Exzisionswunden sind in der entsprechenden Größe (1 mm) und die Tiefe (voller Dicke) wird Hämatoxylin und Eosin-Färbung in der Anzahl von entzündlichen offenbaren, dass E16.5 Haut heilt mit minimaler Narbenbildung, vollständige Reepithelialisierung und nur einem geringen Anstieg Zellen (3A). Darüber hinaus sind diese wounds sollte etwa normale Hautarchitektur heilen und enthalten Regenerieren Haarfollikel innerhalb der Verletzungsstelle (Pfeile; 3B). Die korrekte Anwendung der Tusche auf den frisch erstellten Wunde sollte in Tintenablagerung an der Stelle der Verletzung (; 3B Pfeilspitzen) zur Folge haben. Schließlich sollte Trichromfärbung eine feine netzartige Hautkollagen charakteristischen Muster unscarred Dermis (3C) zu offenbaren.

4
Abbildung 4. Histologie der Narbenbildung E18.5 Fetal Wunden. (A) Hämatoxylin und Eosin-Färbung zeigt eine Zunahme der Eosin-Färbung in der Dermis an der Stelle der Verletzung (Pfeile). (200x; bar = 50 & mgr; m) (B) Mallory-Trichrom-Färbung zeigt dichte Hautkollagen (Pfeile) (400x; bar = 25 um). Mit freundlicher Genehmigung von Colwell et al Nachdruck.10

Im Vergleich zu Wunden bei E16.5, Hämatoxylin und Eosin-Färbung von Rückenverletzungen bei E18.5 gemacht und ernteten 48 Stunden nach der Verwundung sollte eine dichte Narbe mit Verlust der normalen Haut Architektur an der Stelle der Verletzung (4A) verraten hat. In ähnlicher Weise offenbart Trichromfärbung ein dichtes Muster von unorganisiert Kollagenablagerung (Pfeile; 4B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Das chirurgische Protokoll hier vorgestellten beschreibt eine excisional Modell des fötalen murinen narbenheil erste im Jahr 2006 von unserem Labor 10 veröffentlicht. Zusätzlich zu anderen etablierten Modelle der excisional Verwundung 11, Narben Modelle von fetalen Maus narbenheil existieren sowie 12,13. Untersuchungen des fetalen narben Wundheilung bei den Affen, Lamm, Kaninchen, Beutelratte, und Ratten wurden berichtet 14-17. Aber Mäuse sind ein ideales Modell für die Erkundung fetalen narben Wundheilung aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Pro-diem Käfig Kosten und gut charakterisierten Genom. Darüber hinaus können zeitliche und räumliche genetische Verlust / Gewinn-Funktion während der Embryonalentwicklung mit murinen transgenen Systemen und somit die Möglichkeit, genau zu entschlüsseln, die Mechanismen der narbenfreien Reparatur erreicht werden.

Trotz dieser Vorteile präsentieren Mäusen bestimmte technische Herausforderungen während der fetalen Chirurgie aufgrund ihrer geringen Größe. Angesichts derStress der Narkose auf einer schwangeren Mutter, sollte sehr sorgfältig auf das Niveau von Isofluran / Sauerstoff verabreicht Überwachung eingenommen werden. Eine Mischung aus 2,5% Isofluran / Sauerstoff bei 2 l pro Minute, gefolgt von Erhaltung der Narkose bei 1 l pro min sollten sorgfältig beachtet werden. Abweichungen oder Schwankungen in dieser kritischen Faktor kann einen wesentlichen Einfluss auf Morbidität. Die richtige Platzierung der Tabaksbeutelnaht stellt den technisch anspruchsvollsten Aspekt der Operation. Die Nichtbeachtung dieser Masche korrekt zu platzieren wird Austritt von Fruchtwasser und PBS Post-Closing führen. Eine unzureichende Flüssigkeitsvolumen in der Gebärmutter wird in Trauma zu den Embryonen führen und vorzeitige Uteruskontraktion auslösen. Aus diesem Grund ist der Austausch nach dem Öffnen des Uterus verloren Amnionflüssigkeit auch ein entscheidender Schritt in dieser Operationsmodell. Es ist darauf zu warmen PBS kontinuierlich auszuwerfen die Tabaksbeutelnaht geschlossen wird. Diese Faktoren benötigt erhebliche Fehlersuche und wir unterstreichen, dass die Aufmerksamkeit auf diese Detailswird die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Operation zu erhöhen. Aber auch diejenigen, mit erfahrenen chirurgischen Hände sollten für eine Morbiditätsrate von ca. 40% in E16.5 Föten zu planen.

Das Verständnis fetalen narben Wundheilung hält Wert für translationale Medizin bei in vivo-Modulation von fibrogene Verhalten bei Erwachsenen Entwicklungsstufen ab. Im Vergleich zur Erwachsenenhaut hat fötalen Haut eine Entwicklungs Dermis verringert Zugfestigkeit, im Entstehen begriffenen Haarfollikel und verschiedenen ECM-Komponenten 2,4. Fetal Haut hat eine erhöhte Verhältnis von Kollagen Typ III I im Vergleich zur Erwachsenenhaut 4,9 geben im Vergleich zu erwachsenen Haut, weniger und weniger reifen Mastzellen, die Expression von Keratin 8 und 19, und die höheren Ebenen der Hyaluronsäure. Durch die Entschlüsselung der Mechanismen in den Fötus zugrunde liegenden narben Heilung, können wir beginnen, die molekularen und zellulären Wege für Fibrose im erwachsenen hin zu einer regenerativen Phänotyp verantwortlich lenken. Die Entstehung of-Linie Tracing und andere genetische Werkzeuge in der Maus haben vielversprechende neue Wege für die Untersuchung der fetalen narben Wundheilung eröffnet. Angesichts der von Natur aus hoher Morbidität und vorzeitiger Uteruskontraktion mit fetalen Chirurgie verbunden sind, Untersuchungen des fetalen narben Wundheilung der Haut in vivo erfordern eine genaue und reproduzierbare Operationsmodell. Hier werden wir ausführlich ein reproduzierbares Modell der fetalen narben Wundheilung im Rücken E16.5 (narben) und E18.5 (Vernarbung) Maus-Embryonen.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss aus NIH R01 GM087609 (HPL), ein Geschenk von Ingrid Lai und Bill Shu zu Ehren von Anthony Shu (HPL), NIH Zuschusses U01 HL099776 (MTL), das Labor für Hagey unterstützt Pediatric Regenerative Medizin und der Oak Foundation (MTL und HPL). GGW wurde von der Stanford School of Medicine, der Stanford Medical Scientist Training Program unterstützt und NIGMS Ausbildungsförderung GM07365. MSH wurde von CIRM Clinical Fellow Ausbildungsförderung TG2-01159 unterstützt. WXH wurde durch Mittel aus dem Sarnoff Herz-Kreislauf-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-O MONOSOF Suture eSuture SN-1647G
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Autoclip 9 mm Texas Scientific Instruments 205060
Insulin Syringe Thermo Fisher Scientific 22-272-382
Black Pigment AIMS 242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe BD Biosciences 309596
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS) Millipore 367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG) Sigma-Aldrich CG10
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058

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References

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