Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

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Cabra, V., Samsó, M. Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (95), e52311, doi:10.3791/52311 (2015).

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Abstract

Introduction

Das Ziel der Kryo-EM ist es, elektronenmikroskopische Bilder von Makromolekülen in ihrem nativen hydrierten Zustand zu erhalten. Durch die Einbettung des Makromoleküls in Steinwasser kann eine tiefgefrorenen Probe direkt eingeführt und in der TEM-Instrument visualisiert werden. Vitrifikation, durch Flash-Gefrieren (10.000 ° C / s) erreicht, friert die Probe ohne Wasser Kristallisation und stellt sicher, dass molekulare Umlagerungen während Einfrieren sind unbedeutend. Der Überschuß an Elektronenstreuung der Probe mit Bezug auf die umgebende Puffer liefert einen kleinen, aber ausreichenden Kontrast, um das Makromolekül in der Abwesenheit eines Flecken 1 zu sehen. Computergestützte Bildverarbeitung kann dann verwendet werden, um das Makromolekül 3D Struktur rekonstruiert werden. Große Makromoleküle in der ~ 500 kDa- Mehr MDa Bereich sind ideal Proben für Kryo-EM (die über 80% der Elektronenmikroskopie Data Bank (EMDB) Einträge); dazu gehören Proteine, Proteinkomplexe, Protein-Nukleinsäure-complexes, und Membranproteine ​​in einer Doppelschicht eingebettet ist. Diese Makromoleküle werden mit geringerer Wahrscheinlichkeit (in der PDB-Datenbank mit weniger als 2% insgesamt) kristallisiert werden doch ist es oft der Fall, daß kleinere Teile durch Röntgenkristallographie oder NMR gelöst in das 3D Umschlag erstellt von Kryo-EM angedockt werden. Auf der anderen Seite, einige der größten Strukturen durch Kryo-EM gelöst identifizierbar sind im vollen Zelle durch Dünnring TEM 2. So Kryo-EM effektiv überbrückt die Größe und Auflösung Lücke zwischen subzellulären und atomaren Strukturen.

Kryo-EM spiegelt besser native Struktur des Makromoleküls ist als die eher klassische Methode der Negativfärbung (NS), wobei das Makromolekül dehydriert und durch eine Schicht von Schwermetall Fleck umgeben, wobei der Bereich der Fleck Ausgrenzung schafft eine stark kontras "negative" Bild 3. In beiden Fällen wird der Elektronenstrahl erzeugt 2D-Projektionsbilder der Makromoleküle, die so genannte Teilchen, wo die shape hängt von der Orientierung der Makromoleküle in bezug auf den Elektronenstrahl. Viele Teilchen mindestens ~ 1000 und ohne obere Grenze, kann auf dem Rechner mit "Einzelpartikelanalyse" (SPA) Software analysiert, um das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), obwohl Lung zu erhöhen und die räumliche Orientierungsparameter des Teilchens zu finden benötigt, um das Makromolekül der 3D-Struktur durch Rückprojektion 4-7 nachzubilden. NS, mit höheren SNR wird für vorläufige Probencharakterisierung verwendet und um eine De-novo-3D-Rekonstruktion zu erzeugen; seiner Entschließung selten mehr als 20 Å, der durch die Austrocknung und Größe der Schwermetallkorn auferlegt wird. In der Regel für Kryo-EM 3D Strukturbestimmung, eine niedrig auflösende 3D-Rekonstruktion wird zuerst von NS erhalten und dann Kryo-EM wird verwendet, um diese mit niedriger Auflösung erste Karte zu verfeinern, um das Makromolekül weiter untersuchen in ihrem nativen hydrierten Zustand, um die innere Struktur zu sehen, und auf seine Entschließung zu erhöhen. Keinete, dass, wenn die NS-Modell wurde verzerrt (die häufigste Beispiel ist Abflachung vor Austrocknung 8 ergeb) und der Kryo-EM-Teilchen hatten niedrigen SNR, dann könnte die Verzerrung in den Kryo-EM-Modell (Modell-Bias-Artefakt, das in niedrigen SNR gemeinsam ist, tragen Datensätze 9). Strukturelle Verzerrung würde Fehlanpassung zwischen dem NS und Kryo-EM rohen Teilchen und zwischen den rohen Kryo-EM-Teilchen und entsprechende Vorsprünge des 3D-Modells orthogonal zur Abflachung Richtung führen. Modell Vorspannung kann von selbst lösen, wie das 3D-Modell durchläuft sukzessive Verfeinerung Zyklen. Sollte dies nicht der Fall, die als fehlende Übereinstimmung zwischen Roh- Kryo-EM-Partikel und entsprechende Vorsprünge aus dem 3D-Modell erkannt werden würde, dann sollte eine De-novo-Modell aus den Kryo-EM-Daten erstellt werden. Ein guter Ansatz könnte darin bestehen, die Winkel Rekonstitution Algorithmus 10, der mehrere mögliche 3D-Volumen zu erhalten können Sie, und verwenden Sie dann die NS 3D-Modell, um die bestmögliche Kryo-EM-Modell wählendas wird weiter verfeinert 11 sein. Eine noch bessere Strategie ist es, das SNR des Kryo-EM-Datensatz zu erhöhen (siehe entsprechende Kapitel in der Diskussion).

Die biochemische Qualität des gereinigten Makromolekül hat eine äußerst Einfluss im Endergebnis. Das Makromolekül, die aus Gewebe in heterologen Systemen gereinigt oder exprimiert wird, muss eine hohe Reinheit haben und strukturell intakt. Es sollte weder zu bilden Aggregate noch sollte sie zu zerlegen. Um eine bestimmte Konformation zu definieren, sollten die Herstellungsbedingungen eine einheitliche Konformation fördern. Um Komplexe zu untersuchen, ist es optimal, dass die k D ist im nM-Bereich, sonst Fixiermittel wurden erfolgreich zur Stabilisierung geringere Affinität Wechselwirkungen 12,13.

Unverarbeitete Kryo-EM Bilder liefern wertvolle Informationen über die Abmessungen, Grundzüge, Aggregatzustand / Multimerisierung, Homogenität und interne Struktur der macromolecule. Dennoch wird das Potential der Technik wird wesentlich mit Bildverarbeitung verbessert. Ein 3D-Struktur zeigt die allgemeine Architektur des Makromoleküls ist, 3D-Position des Liganden und Untereinheiten, Konformationsänderungen und das Andocken von atomaren Strukturen durch Röntgenkristallographie oder NMR bestimmt. Die Informationsmenge einer 3D-Rekonstruktion schrittweise zunimmt, wie die Auflösung erhöht wird: im allgemeinen 15-20 Å Auflösung erlaubt eindeutige Andocken Atomstrukturen, bei 9-10 Å alpha-Helices als Stäbe sichtbar sind, bei 5 Å ist es möglich, zu erkennen, Beta-Faltblätter, und bei einer Auflösung von 3,5 Å und besser ist es möglich, daß ein Atommodell 14 zu bauen.

Die Möglichkeit, aussagekräftige Bilder und eine 3D-Rekonstruktion mit SPA von relativ kleinen Probenmengen zu machen Kryo-EM eine attraktive Technik zu erhalten, wie 3-5 & mgr; l von mindestens 0,05 mg / ml ausreichend, um eine TEM-Gitter vorzubereiten. Die Mindestanforderungen Instrumentalfür Kryo-EM sind ein hausgemachten oder kommerziellen Kryo-Kolben, ein Elektronenmikroskop mit Ultrahochvakuum, Bildaufzeichnungsmedien und niedrig dosiertem Kit, einer Kryo-Halter mit seinen Pumpstation, eine Glimmentladung Vorrichtung und einen Verdampfer. Nicht wesentliche, aber weitere wünschenswerte Eigenschaften auf der TEM sind CCD-Kamera (in allen modernen TEMs vorhanden) oder eine direkte Elektronendetektor, Feldemissionsquelle (FEG), Energiefilterung und Hochdurchsatz-Datenerfassungssoftware. Diese Software im Prinzip ermöglicht das Sammeln Zehntausenden von Partikeln in einer einzigen Sitzung Kryo-EM-15, aber die erhöhte Datenspeicherbedürfnisse und anschließende wachten Nachbearbeitungszeit müssen in Betracht gezogen werden. FEG kombiniert mit Kontrastübertragungsfunktion (CTF) Korrektur zugrunde meisten 3D-Rekonstruktionen, die Auflösung aus, um alpha-Helices Visualisierung erreicht. An diesem Punkt ist die Höhe der Auflösung auch probenabhängigen: Erreichen 10 Å Auflösung ist weniger häufig für Membranproteine, während, wennHochsymmetrieordnung vorhanden ist, dann atomarer Auflösung ist erreichbar. Die jüngste Entwicklung der direkten Elektronendetektoren hat atomarer Auflösung auch für Makromoleküle mit niedrigen (4x) oder gar keine Symmetrie, in dem die Qualität der Kryo-EM Elektronendichtekarten Spiele von Röntgenbeugungsdaten 16,17 daraus abgeleiteten aktiviert.

Praktische Beispiele, die die Fähigkeiten der Technik werden hier für vier wichtige Arten von Makromolekülen in dem Kryo-EM einen fortwährenden Hauptrolle in ihrer Strukturbestimmung vorgesehen. (I) Mit ihrer Ikosaedersymmetrie, die die Datenmenge um 60-fach und ihre Größe, die treu und reproduzierbare Ausrichtung ermöglicht erhöht haben sich die Strukturen von mehreren ikosaedrischen Viren nahezu atomarer Auflösung durch Kryo-EM, gefolgt von SPA 18 gelöst. Wir zeigen ein Beispiel für eine Klasse von ikosaedrischen Viren, Adeno-assoziierte Viren (AAV), bei denen nahezu atomaren Strukturen durch Kryo-EM und Kryo-EM / Röntgen hybrid Methoden existieren 19,20. (Ii) Makromoleküle mit Helixstruktur sind Mikrotubuli-Filamente und Viren. Deren Wiederholungseinheiten entlang der Spiralachse kann durch eine komplexere Version der SPA zur Helixgeometrie 21 angepaßt analysiert werden. Im Beispiel zeigen wir, Tabakmosaikvirus (TMV), ein RNA-Virus, das zu atomarer Auflösung durch Kryo-EM 22 gelöst worden ist. (Iii) Große löslichen Proteine ​​wurden ausführlich untersucht. Unter diesen Makromoleküle bilden symmetrische multimeren Zylinder bilden eine wiederkehrende Architektur oft Sub-Nanometerauflösung 23,24 gelöst. Hier zeigen wir Bilder von KLH, ein wirbellosen Sauerstoffträger, wobei ein Hybrid molekulares Modell wurde von Kryo-EM / Röntgenkristallographie Hybridverfahren 25 erstellt. (Iv) Membranproteine ​​sind eine wichtige Klasse von Proteinen; sie machen etwa 1/3 der Proteine ​​durch das menschliche Genom kodiert ist, doch sind sie schwierig zu strukturell charakterisiert durch Schwierigkeiten, die mit zugeordneten transmembrane Domäne Stabilisierung 26, die weniger als 1,5% der von jedem Strukturtechnik kombiniert gelösten Strukturen. Die Rolle der Kryo-EM und 3D-Rekonstruktion in der Strukturbestimmung ist mit dem Ryanodinrezeptor (RyR), einem großen eukaryotischen intrazellulären Ca 2+ Kanal bei der Muskelkontraktion und Gehirn Signalisierung wichtiger veranschaulicht. Die höchste Auflösung Kryo-EM-Strukturen auf dem neuesten Stand, mit 10 Å Auflösung, offenbaren Sekundärstruktur 27.

Protocol

1. Cryo-Halter Vorbereitung und Wartung

HINWEIS: Die trockenen Pumpstation, bestehend aus einem Turbopumpstation und einem oder mehreren Kältestufe Controller, ist vor allem für drei Zwecke verwendet: a) Es ist ein sicherer Ort, um die Kryo Inhaber zu speichern, wenn sie nicht verwendet werden. Der richtige Weg, um den Inhabern zu speichern, um sie in der Station unter Vakuum hinterlassen. b) Verdampfen des Frost und Feuchtigkeitsaufbau wird, wenn der flüssige Stickstoff aus der Dewar und der Spitze des Kryo Halter ausgesetzt entfernt auftritt; dies wird mit der Aufwärmzyklus erreicht. c) Um die Trockenmittel Zeolith zu regenerieren, und um ein hohes Vakuum in den cryoholder Dewars erzielen. Dies ist zum Halten einer konstanten Temperatur, wenn dabei Kryo-Elektronenmikroskopie erforderlich.

  1. Aufwärmphase.
    1. Legen Sie die Kryo Halter in einer der Pumpen-Anschlüsse der Pumpstation. Schließen Sie eine der Evakuierungsrohre an der Metallaustritt unter dem Vakuumventil des Inhabers. Machensicherstellen, dass alle Ventile in der Station (V1, V2 und V3) und auf dem Kryo Halter geschlossen sind.
    2. Schalten Sie den Kältestufe Controller und schließen Sie es an den Halter über die Steuerkabel. Schalten Sie den Netzschalter des Turbopumpstation.
    3. Starten Sie den Aufwärmzyklus Option in der Kältestufe Controller. Wenn der Unterdruck in den Turbopumpstation liest 10 -3 Torr oder besser, öffnen Sie die Drosselklappe V2, warten Sie, bis das Vakuum stabilisiert, und öffnen Sie die Drosselklappe V1.
    4. Führen Sie den Aufwärmzyklus für etwa 30 Minuten, bis die Temperatur in der Halterung ist über 20 ° C stabil. Schließen V1, und beenden Sie den Zyklus.
  2. Zeolith-Zyklus. Führen Sie das Zeolith-Zyklus zwischen 4 h und O / N Vor einer Kryo-EM-Sitzung, und einmal in der Woche, wenn nicht verwendet.
    1. Starten Sie die Option Zeolith-Zyklus und wählen Sie die nötige Zeit, um ein gutes Vakuum zu erreichen, im Bereich von 1 bis 2 × 10 -4 Torr und so lange Haltezeit. Wenn das Vakuum erreicht 10 -3Torr, öffnen Sie das Dewar Evakuierungsventil, V3. Die Pumpstation wird dann evakuieren Schnur an den Halter; warten Sie, bis das Vakuum stabilisiert.
    2. Öffnen Sie das Ventil auf dem Kryo Halter. Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, schließen die Ventile in der umgekehrten Reihenfolge, in der sie geöffnet wurden: das Ventil an der Halterung, dann V3, V2, und schließlich V1. Schalten Sie den Turbo-Pumpstation und die Kältestufe Regler, und ziehen Sie das Kryo Halter aus dem Kältestufe Controller und dem Turbo-Pumpstation.

2. Grid Vorbereitung

  1. Reinigung.
    HINWEIS: Bei Verwendung von kommerziellen löchrige Gitter, wird empfohlen, sie vor der Verwendung zu reinigen, um jegliche Restpolymer, das im Herstellungsverfahren verwendet wurde, zu entfernen. Tun Sie dies in einer Glaspetrischale mit 5 Schichten von Filterpapier am Boden gelegt.
    1. Legen Sie die Gitter auf dem Filterpapier mit der Kohle-Loch-Seite nach oben ein.
    2. Mit einer Pasteurpipette aus Glas benetzt das Papier mit einigen Tropfen of Chloroform um die Gitter, bis sie gerade anfangen zu schweben.
    3. Decken Sie die Petrischale mit dem Deckel in einem Abzug O / N leicht geöffnet.
  2. Hinweis: die dünne Kohlenstoffträger (Schritte 2,2-2,3) weggelassen werden, da die Eisschicht direkt über die kleinen Löcher in der löchrigen Kohlen Gitter gebildet werden.
    1. Unter Verwendung einer Pinzette, spalten ein Stück Glimmer, zwei neue Oberflächen freizulegen. Legen Sie die neue freiliegenden Oberflächen der Glimmerseite nach oben auf ein weißes Blatt Papier in einer Petrischale.
    2. Legen Sie die Petrischale in der Glocke aus einem Kohlenstoffverdampfer. Starten Sie die Pumpe nach unten fort, bis Vakuum unter 2 x 10 -6 Torr. Um Verunreinigungen auf der Oberfläche der Kohlenstoffstange zu verdampfen, führen eine Vorverdampfung der Petrischale abgedeckt. Dann an der Luft die Vakuumglocke und nehmen Sie den Deckel der Petrischale.
    3. Führen Sie die Pumpe ab Reihenfolge, bis das Vakuum unterhalb 10 -6 Torr und Mantel der Glimmer mit einer dünnen Schicht (ca. 5 nm) aus Kohlenstoff. Verwenden Sie eine Schutzbrille während der C-Verdunstung. Überwachen der Dicke der Kohlenstoffschicht durch die resultierende Dunkelheit auf dem Papier, das unter den Glimmerplättchen gelegt worden war.
  3. Übertragen Sie die dünne Kohlenstoff der TEM-Grid.
    1. Schneiden Sie ein 0,5 x 1 cm großes Stück beschichteter Glimmer und Schwimmer der Kohlenstoff aus auf die flache Oberfläche gefiltert, entionisiertem Wasser. Verwenden Sie optische Linsenpapier, um einen flachen Wasseroberfläche zu erhalten. Mit der Pinzette, legen Sie die Kohle-Loch-Seite des Gitters in Kontakt mit der oberen Fläche des schwimmenden Kohlenstoffschicht, und holen Sie es.
    2. Die Schritte 2.3.1 und 2.3.2 bis eine ausreichende Anzahl von Gittern hergestellt werden.
  4. Glow Discharge.
    HINWEIS: Die Glimmentladung wandelt das natürlich hydrophobe Kohlenstoff-Überzugsschicht der Gitter in hydrophile. Dieser Schritt ist optional.
    1. Legen Sie die Gitter mit dem Kohlenstoffseite nach oben auf einem 7,5 x 2,5 cm Glasobjektträger mit Parafilm bedeckt. Legen Sie sie in die Kammer des Gasentladungs ​​Geräte und schließen Sie die Kammer.
    2. Pumpedie Glasglocke und Gasentladungs ​​20 Sekunden bei 25 mA und 7 x 10 -2 mbar.
      HINWEIS: Während dieser Zeit ein Licht lila Schein sichtbar wird. Entfernen Sie den Glasobjektträger mit den Netzen und verwenden Sie sie innerhalb von 1 Stunde, sonst werden sie sein müssen leuchten wieder entladen.

3. Probe Tauchgefrieren

HINWEIS: Verwenden Sie eine Schutzbrille und festes Schuhwerk, wenn Sie dieses Gerät, um gegen flüssigen Stickstoff und Ethan Spritzer.

  1. Schalten Sie den Tauchgefriergerät. Füllen Befeuchterreservoir mit destilliertem Wasser. Stellen Sie die gewünschte Temperatur, relative Feuchte und stürzen Bedingungen für Blot Zeit auslöschen Kraft und Adsorption Zeit (22 ° C, 95%, 2 s, 2 und 40 Sekunden in dem hier vorgestellten Beispiel). Zeigen neuen Blotting Filterpapier.
  2. Kühlen Sie die Ethan Behälter nach unten, indem der äußere Behälter mit flüssigem Stickstoff, bis Stabilität erreicht ist (ca. 10 min). Nachdem der flüssige Stickstoff stoppt boiling, legen Sie die Spitze des Rohres aus dem Ethan Behälter im Innenraum und öffnen Sie das Ventil sehr langsam. Verflüssigen Ethan in der inneren Kammer und füllen Sie ihn bis 1 mm von der Spitze. Vermeiden Sie das Einfrieren des Ethan. ACHTUNG: Ethan ist sehr leicht entflammbar und explosiv.
  3. Stellen Sie sicher, Pinzette innerhalb des Tauchgefriervorrichtung ausgerichtet ist.
  4. Schalten Sie Feuchtigkeit. Laden Sie ein Gitter auf der Pinzette, und laden Sie 3-5 ul Probe auf der Kohlenstoffoberfläche (matte Seite) der löchrigen Gitter. Warten Sie, bis die Probe in das Netz zu adsorbieren, und führen Sie die Blotting, um eine dünne Flüssigkeitsschicht zu erzielen.
  5. Flash-einfrieren das Raster durch Eintauchen in das flüssige Ethan. Nehmen Sie die Pinzette-Gitteranordnung aus dem flüssigem Ethan Halten Sie die Pinzette stetig, und überträgt es in die äußere Kammer mit flüssigem Stickstoff. Bringen Sie das Gitter zu einem kleinen Raster-Box in der flüssigen Stickstoff getaucht. Achten Sie auf die verglaste Probe in flüssigem Stickstoff die ganze Zeit während der Übertragung entweder der Speicher haltenoder Kryo Halter.
    HINWEIS: Grid-Boxen können in einer großen Kapazität (35-50 L) flüssiger Stickstoff-Dewar für mindestens 1 Jahr gelagert werden. Für bequeme Lagerung können sie in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit zwei Bohrungen an der Oberseite und eine Angelschnur um seine Kappe, die aus dem Mund des Dewars gezogen werden kann angebracht platziert werden.

4. Übertragen Sie die Cryo-Gitter an den TEM

  1. Setzen Sie den Halter in die Kryo Kryo-Transfer-Workstation. Darauf achten, dass die Spitze des Halter beim Einsetzen beschädigt werden. Prüfen Sie auf das Vorhandensein von kleinen Fasern und Staub auf der Stange und der O-Ring des Kryo Halter mit einer Lupe, wenn es irgendeine entfernen Sie sie mit optischem Objektivreinigungspapier.
  2. Füllen Sie den Dewar des Cryo Halter und die Arbeitsstation Gefäß mit flüssigem Stickstoff. Vermeiden Sie das Verschütten des flüssigen Stickstoffs mit der gefangen Trichter, der mit der Arbeitsstation kommt.
  3. Schließen Sie das Kryo Halter an der Kältestufe Controller, um die Temperatur zu überwachen, und erweitern flüssigem Stickstoff & #160, bis sich die Temperatur stabilisiert bei etwa -194 ° C. Stellen Sie sicher, dass das Niveau des flüssigen Stickstoffs unter der Ebene der Vakuumdichtung sowohl in der Arbeitsstation Gefäß und dem Kryo Halter Dewar. Pre-Kühlung der Gitter Pinzette, den Klemmring und das stumpfe Ende des Clips Ringwerkzeug auf der Arbeitsstation. Auch vor der kühlen einer Reihe von großen Pinzette und einem Schraubendreher in einem anderen Dewar mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
  4. Schnelle Übertragung der Kryo Gitterfeld mit den gefrorenen hydratisierten Gitter um den flüssigen Stickstoff in der Workstation mit den großen Pinzette. Öffnen Sie die Kryo Gitterbox mit dem Schraubenzieher, nehmen Sie die gefrorenen hydratisierten Gitter und legen Sie sie in den Probenhalter Steckplatz.
  5. Setzen Sie den Klemmring auf der Oberseite des Gitters, und drücken Sie sie vorsichtig mit dem stumpfen Ende des Clips Ringwerkzeug, bis es fest an seinem Platz sitzt. Schließen Sie die Kryo-Verschluss. Entfernen Sie die Werkzeuge und Kryo-Gitterbox von der Arbeitsstation.
  6. Bewegen Sie den gesamten Arbeitsplatz mit Halterung und Netz zum Mikroskop-Konsole, um Mini-mieren die Übertragungszeit des Rasters in der Raumluft.
  7. Runden das TEM Anti contaminator mit flüssigem Stickstoff, der zuvor gefüllt wurde und abgekühlt ist für mindestens 20 min. Pre-neigen Sie den Mikroskoptisch bis -60 °.
    ANMERKUNG: Dies wird Verlust von flüssigem Stickstoff zu minimieren, wenn der Halter in der Schleuse eingeführt.
  8. Beginnen Sie den Pre-Pumpe Schleusenzyklus auf dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass das Ventil in der Elektronenkanone ist beendet (insbesondere wenn es ein FEG TEM). Warten Sie, bis das vorgePumpe Luftschleuse Sequenz (ca. 2 min), bevor Sie die Kryo Halter beenden.
    HINWEIS: Dies wird durch die rote Licht auf der Bühne ausgelöscht angezeigt.
  9. Setzen Sie den Halter in die Luftschleuse und drehen Sie ihn um 90 ° im Uhrzeigersinn drehen; verbinden Sie den Stufenregler Kabel Kälte auf die Kryo Halter, um die Temperatur zu überwachen. Wieder warten, bis das rote Licht erlischt, und drehen Sie sowohl die Bühne und den Halter wieder in die 0 ° Position, um den Halter in der TEM ist hallo einfügengh Vakuumkolonne.
  10. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur geht nie über 160 ° C zur Bildung von kristallinem Eis zu vermeiden.
  11. Füllen Sie den Dewar des Cryo Halter. Warten Sie 15 bis 45 Minuten, bis der Inhaber im thermischen Gleichgewicht und die TEM-Vakuum vor der Aufnahme Bilder erholt.
  12. Wenn Blasenbildung des flüssigen Stickstoffs erkannt wird, ändern Sie den flüssigen Stickstoff Füllhöhe oder sanft berühren die sprudelnden Herkunft mit einem Wattestäbchen.

5. Low-dose Datenerfassung

HINWEIS: Der niedrig dosierte Datenerfassungstechnik verwendet wird, um die Elektronenstrahlung eine Beschädigung der Probe durch Begrenzung der Einwirkung von 20 Elektronen / Å 2 minimieren. Dies wird durch den Wechsel zwischen drei Konfigurationen erreicht: "Suche", mit geringer Vergrößerung (~ 5.000-facher) und breites Sichtfeld, "Focus", mit hoher Vergrößerung (~ 150,000X) und kleine Sichtfeld, und "Exposition", mit der gewünschten endgültigen magnifizierung und den interessierenden Bereich enthält, um aufzuzeichnen. Blank der Strahl zwischen den Modi.

  1. Einrichten der TEM und der Low-dose-Programm
    1. Ziehen Sie die Kryo-Verschluss und öffnen Sie die Spalte Ventile.
    2. Zentrieren Sie das Stadium und den euzentrischen Höhe (Z) mit dem Alpha-Wobbler, die Bühne ± 15 ° zu rocken. Stellen Sie die Z-Position, bis es keine nennenswerte Bewegung, während die Bühne rocken. Aktivieren Sie die Niedrigdosis-Programm und wählen Sie den Detektor für jeden Modus.
    3. Im Belichtungsmodus finden eine Fläche des Netzes, die keinen Kohlenstoff hat, stellen Sie die Beleuchtung durch die Auswahl des optimalen Kondensorapertur und Spotgröße, so dass der Bereich aufgezeichnet werden voll ausgeleuchtet wird. Achten Sie darauf, um den Strahl in der overcondensation Richtung ausbreiten.
    4. Im Suchmodus finden Sie eine kleine Funktion, die bei höherer Vergrößerung eindeutig erkennbar sein wird. Im Belichtungsmodus zu zentrieren Sie diese Funktion mit dem Joystick (der xy-Controller). Bei geringer Vergrößerung, wenn das Kunststück startenure noch nicht in dem Sichtfeld.
    5. Im Suchmodus bringen diese Funktion, um die Mitte des Feldes mit den niedrigen Dosis xy Bildverschiebung steuert. Zum Belichtungsmodus und bewegen Sie die Funktion entlang der Schwenkachse mit dem Joystick, bis sie aus dem Bereich aufgezeichnet werden soll (0,5 bis 3 Mikrometer). Zum Fokus-Modus und in der Mitte die Funktion mit den xy-Bildverschiebung steuert. Bei geringer Vergrößerung zu starten, wenn die Funktion nicht in das Blickfeld.
    6. Halten Sie den Strahl zu allen Zeiten zentriert.
  2. Datenerfassung
    1. Ziehen Sie die Kryo-Verschluss und öffnen Sie die Spalte Ventile. Aktivieren Sie die niedrige Dosis-Programm.
    2. Im Suchmodus zu identifizieren ein Planquadrat, das dünne, homogene Eis.
    3. Wählen Sie ein passendes Loch und legen Sie sie in der Mitte des Feldes. Wechseln Sie in den Fokus-Modus und stellen Sie das Bild. Dann Unterfokus Bildes zwischen 0,5 bis 4,5 Mikrometer.
    4. Wechseln Sie in den Belichtungsmodus und nehmen Sie das Bild auf.
    5. Wechseln Sie in den Suchmodus und wiederholen Sie die Schritte 5.2.3-5.2.4.Bewegen Sie über das Planquadrat Vermeidung Vorbelichtung gute Löcher aufgenommen werden soll.
    6. Beenden Sie die Planquadrat und zu einer anderen gut.
    7. Nachstellen Höhe (Z) und weiterhin die Datenerfassung.

Representative Results

Die sorgfältige Ausführung aller Protokollschritte in Abbildung 1 skizziert ermöglicht die Visualisierung von froren hydratisiert, nicht angefärbt Makromolekülen. Ergebnisse für vier repräsentative Proben mit unterschiedlichen Struktureigenschaften werden angezeigt. Ihre mikroskopischen Bildern durch die Verfahren der NS und Kryo-EM erhalten (Abbildung 2) verglichen. (I) NS Bilder AAV5 offenbaren virusähnlichen Partikeln von etwa 130 Å Durchmesser. Das Nebeneinander von vollen und leeren Strukturen entspricht brochen und strukturell intakte Kapside (die Fleckeintrag ermöglichen) sind. Kryo-EM zeigt gleichmäßig leere Strukturen; in der Tat diese Viruspartikel nicht genetisches Material 28 enthalten. NS zeigt vorherrschende runde Partikel während Kryo-EM zeigt meist sechseckigen Partikeln, was ihre ikosaedrischen Form. (Ii) Bilder der Schrauben TMV zeigen Stangen 180 Å Durchmesser und variabler Länge, die oft mehr als 0,1 um, mit einer schraubenförmigen Wiederholung von 23 Å sichtbar sowohlin NS und Kryo-EM. Die 40 einen zentralen Kanal mit Fleck in der NS Bildern und leer in den Kryo-EM Bildern gefüllt. (Iii) Mutter KLH, ein didecamer von 8 MDa, montiert in charakteristischen Barrel 350 Å Durchmesser und 400 Å Länge. NS und Kryo-EM zeigen KLH der rechteckigen Seitenansichten und Kreis end-on Blick. Beide Techniken offenbaren sechs Rillen senkrecht zu der Symmetrieachse und die gleich beabstandeten morphologischen Einheiten innerhalb jeder Stufe. Kryo-EM zeigt eine leere innere Struktur. (Iv) Ryanodinrezeptor, eine große tetrameren intrazellulären Kanal von 2,26 MDa, wird als ein Quadrat von 275 x 275 Å 2 zu sehen. Filigrane Oberflächenmerkmale wie etwa eine zentrale Kreuz und einem zentralen Depression manifestieren sich als Fleck Ansammlung von NS und als geringere Dichte Regionen durch Kryo-EM. Während NS zeigt ähnliche Kontrast in allen vier getesteten Proben, Vergleich der Kryo-EM-Platten macht die niedrigere SNR (Kontrast) des RyR1 aufgrund der Gegenwart eines Detergens, um dieses Membranprotein zu solubilisieren.

Kristalline Eis, Verschmutzung, Astigmatismus und netzartigen Strukturen (Abbildung 3): Typische Beispiele für Kryo-EM Artefakte für RyR1 gezeigt. Deren Ursachen und Prävention sind weiter in der Diskussion Abschnitt beschrieben.

SPA und 3D-Rekonstruktion der tiefgefrorenen RyR1 enthüllt seine vierfache symmetrische Struktur, die homotetrameres Organisation des Proteins (4A) widerspiegelt. Die zytoplasmatische Domäne bildet ein quadratisches Prisma von 275 x 275 x 120 Å 3 und enthält mehrere reproduzierbare globulären Domänen Bilden einer gerüstähnlichen Struktur. Die Transmembran-Domäne bildet einen kleineren Kegel quadratischen Prismas mit maximalen Abmessungen 115 x 115 x 60 Å 3. Bei 10 Å ist es möglich, alpha-Helices (4B) sichtbar. 3D Unterschied Mapping können die Position des wichtigen Liganden zeigen, in diesem Fall die Differenz 3D Karte von FKBP12, ein 12 kD-Protein considerot a-Untereinheit von RyR1 wird auf RyR1 (4C) 29 überlagert. Schließlich Konformationsänderungen eine dynamische Ansicht des Makromoleküls. In diesem Fall RyR1 zuvor entweder in geschlossenen oder offenen Bedingungen stabilisiert zeigt ein Massen Translokation aus dem geschlossenen in den offenen Zustand (Figur 4D) 27.

Figur 1
Figur 1 Ablaufdiagramm des Kryo-Elektronenmikroskopie Technik. Das Diagramm zeigt die wesentlichen Schritte des Protokolls.

Abbildung 2
Figur 2. Vergleich der NS und Kryo-EM für eine Vielzahl von Proben. (A) AAV5 ein Ikosaeder-Virus. (B) TMV, eine Schrauben Virus. Einschübe zeigen die Schrauben wiederholen, von 23 Å. (C) Mutter KLH. (D) RyR1; Vertreter Ansichten hervorgehoben (f, das Vierfache Blick und s, Seitenansicht). Alle Proben werden unter Bedingungen niedriger Dosis und gleichzeitig Vergrßerung 50.000-ein unter einer Beschleunigungsspannung von 200 kV belichtet. Maßstabsbalken 10 nm. Alle NS-Proben sind auf Kohlenstoffträger, Kryo-EM-Proben A, C, D sind auf dünnen Kohlenstoff über QUANTIFOIL und Kryo-EM Probe B direkt über QUANTIFOIL Löcher. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Bild-Galerie, die gemeinsame Kryo-EM-Artefakte auf einem RyR1 Kryo-EM Probe. (A) Kristallines Eis. (B) Ice Kontamination (Pfeile). (C) Astigmatismus. RyR1s im astigmatische Bild kaum sichtbar. Der Einschub auf der rechten Seite zeigt den Leistungs spectRum des Bildes mit asymmetrischen Thon Ringe. Der Einschub auf der linken Seite zeigt das Leistungsspektrum eines nicht astigmatischen Bild als Referenz. (D) Web-ähnliche Strukturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Kryo-EM und 3D-Rekonstruktion des Ryanodinrezeptor. . (A) Isofläche Darstellung (B) Docking einer Kristallstruktur von RyR1 der N-Terminus 30 zeigt eine gute Übereinstimmung zwischen den Atomkoordinaten und der Kryo-EM-Hülle; Pfeile zeigen auf zwei alpha-Helices, die aus der Struktur herausragen. Pfeilspitze zeigt eine der vier Helices, die die Pore des Ionenkanals umgibt. Die gestrichelten Linien zeigen die Grenzen der Membran. (C) RyR1 und 3D loKation der FKBP12-Liganden (orange Farbe). (D) Konformationsänderungen des RyR1 beim Übergang von der geschlossenen (orange) in den offenen (schwarzen Mesh) Konformation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

TEM gefolgt von SPA hat viele makromolekulare 3D-Strukturen beigetragen, kurz vor 2000 Einträge in der EMDB bis Mitte 2014 in der Regel für einen bestimmten Makromolekül wird eine niedrig auflösende 3D-Struktur zunächst aus NS-Daten, die durch eine über folgen kann bestimmt Auflösung Kryo-EM 3D-Struktur. Der hohe Kontrast der Molekulargrenzen durch NS, die die erste 3D-Rekonstruktion erleichtert bereitgestellt wird später durch Kryo-EM mit seiner Fähigkeit, die interne Struktur des Makromoleküls in seiner vollständig hydratisierten Zustand zuzuordnen, und die Möglichkeit, eine viel höhere Auflösung zu erreichen verfeinert. Ein weiterer Vorteil der Kryo-EM ist die Beseitigung der Dehydrierungsstress, der zu einem Zusammenbruch des Makromoleküls führen könnte. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, den Kohlenstoffträger, der mögliche Oberflächenabsorptionseffekte eliminiert und zeigt die Konformation, die das Makromolekül in Lösung annimmt wegzulassen. Cryo-Negativfärbung, einer Kombination von Kryo-EM und NS, liefert einen hohen Kontrast in einem vollständig hydbewertet Probe und können auch zu 3D-Rekonstruktion führen mit SPA, aber es wurde weniger häufig verwendet wurde, mit weniger als 10 EMDB Einträge, zum Teil, weil der Fleck selbst kann mit der Integrität des Makromoleküls 31 stören. Zwei weitere TEM-Techniken förderlich für 3D-Rekonstruktion sind 2D-Elektronenbeugung und Elektronentomographie. 2D Elektronenkristallographie erfordert eine ebene oder röhrenförmige Kristall; des Kristalls Elektronenbeugung ist für 3D-Rekonstruktion möglicherweise zu atomarer Auflösung 32 führenden eingesetzt. In Elektronentomographie verglaster oder traditionell fixierten Proben, ein Makromolekül oder subzellulären Komponente innerhalb der TEM für nachfolgende tomographische Rekonstruktion 33 gedreht wird, mit dem Vorteil, dass singuläre Objekte rekonstruiert werden kann; aber derzeit diese Technik hat eine Auflösungsgrenze von 40 bis 20 Å 34,35. Unter all diesen molekularen TEM-Techniken hat SPA von NS und Kryo-EM-Daten die am weitesten verbreitete gewesenverwendet. Die hier dargestellte Protokoll zur Erlangung Kryo-EM Bilder für SPA-Analyse gewidmet; Dennoch können die meisten Protokoll ist auch anwendbar auf Kryo-EM von 2D-Kristallen und tomographischen Proben.

Eine erfolgreiche Kryo-EM-Sitzung hängt von der kombinierten Erfolg von vielen kritischen Schritte; wichtige Aspekte im Auge zu behalten, Erklärung der gemeinsamen Kryo-EM Artefakte und wie man sie vermeidet werden in den folgenden Abschnitten beschrieben. In diesem Abschnitt werden auch die Datenerfassung Richtlinien, qualitativ hochwertige 3D-Rekonstruktionen mit dem SPA-Methode zu erhalten.

Übergang zu kristallinem Eis zu vermeiden. Ein zentraler Aspekt ist, dass die Probe in glasartigen Zustand von dem Zeitpunkt der Kryo-TEM-Beobachtung stürzte ganz bleiben muss. Also nach Eintauchen der Probe in flüssigem Ethan alle nachfolgenden Schritte werden mit flüssigem Stickstoff (-196 ° C) oder flüssigem Helium (-269 ° C) Temperaturen ausgeführt. Erwärmung auf über 135 ° C verwandelt glasigen Wasserkristalline Wasser; dann makromolekulare Umlagerungen stattfinden kann und Wasserkristalle prägen das Bild (3A); sollte die Probe verworfen werden. Unbeabsichtigter Probe Aufwärm könnte passieren, wenn Cryo-Eintauchen, Übertragung der eingefrorenen Gitter zwischen Containern (auch wenn von einem GridBox geschützt), und / oder Kryo Halter Einsetzen in das TEM zu langsam sind, oder wenn die Handhabung Pinzette waren unzureichend vorge abgekühlt. Wesentliche Vakuum Verschlechterung der TEM bei Kryo-Transfer (die kalten Probenfallen wärmer Zuluft) auch erwärmen die Probe. Schließlich über Bestrahlung der Probe könnte auch im Übergang resultieren kristallinem Eis.

Minimieren Eis Kontamination. Angesichts der geringen Probenvolumen (3-5 ul) auf die TEM-Gitter angewendet, könnte Verdunstung Pufferkomponenten (Salz, Reinigungsmittel) zu konzentrieren und damit Einfluss auf makromolekulare Integrität einschließlich entgangenen multimeren Zustand. Eine hohe relative Luftfeuchtigkeit (RH) oder Mikrokammer umgehens dieses Problem. Alternativ Kryo-Eintauchen in einem ausreichend belüfteten Umwelt kalten Raum durchgeführt werden. Nach Kryo-Eint RH sollte so niedrig wie möglich sein, um Eis Verunreinigung oder Kondensation von Umgebungsfeuchtigkeit auf die Kryo-Gitter zu verhindern, wie der Kryo-Gitter selbst als Kühlfalle wirkt. Eis Kontamination aus Teilchen mit hohem Kontrast und ohne Unterkonstruktion mit Größen im Bereich zwischen ca. 5 nm und einigen Mikrometern, die stören oder sogar das Bild vollständig zu blockieren. Vermeiden Sie Zugluft, Sprechen / Atmen auf die Kryo-Raster bei der Luftübertragung und reduzieren relativen Luftfeuchtigkeit. Öffnen Flüssigstickstoffbehältern mit Kondenswasser (so weiß Schwebeteilchen sichtbar) sollte auch verworfen werden.

Maximieren makromolekularen Orientierungen / views. Für Probenträger, ist eine Wahl getroffen werden zwischen echten löchrigen Netze und dünne Kohlenstoff über löchrige Gitter. Dies ist abhängig von (i), wie die Probe erstreckt sich über Kohlenstoff-Film im Vergleich zu den Kohlenstoffbohrungen, (ii) verfügbar Muster concentration als blanke Löcher können eine Konzentration 100x höher als Kohlenstoffträger für eine ähnliche Partikeldichte auf der Bild erfordern (von ~ 0,02 bis 2 & mgr; M) und (iii), wie Zufalls ist die Verteilung der Makromolekülorientierungen. Man beachte, dass eine Glimmentladung, die die hydrophilen Kohlenstoff macht, wird eine wichtige Wirkung bei allen drei Aspekten haben und dass dies Probe abhängig. In Bezug auf die Orientierung der Makromoleküle, während ein wiederkehrender Aussicht ist für die erste Strukturbestimmung durch zufällige konische Rekonstruktion erwünscht ist Zufälligkeit der makromolekularen Blick wünschenswert, wenn die Verfeinerung der 3D-Rekonstruktion auf eine höhere Auflösung. In unserem Beispiel interagiert RyR1 mit dem Kohlenstoff, mit einem Lieblings "vierfach" Ansicht (2D) und erfordert löchrigen Netze für Zufälligkeit der Orientierungen und höhere Auflösung 36.

Maximieren SNR. Die beste Strategie, um SNR zu erhöhen ist es, die Hintergrundgeräuschquellen zu reduzieren. Übermäßige EisDicke und (falls vorhanden) C-Schichtdicke hinaus, was erforderlich ist, um zu unterstützen und betten das Protein zusätzlichen Lärm hinzuzufügen. So sollte Eisdicke auf das erforderliche Minimum durch die Kontrolle Blotting Zeit, Druck, relative Feuchtigkeit, und Filterpapierqualität reduziert werden. Für Kohlenstoffträger wird eine dünne (~ 5 nm) Kohlenstoff-Film über den dickeren löchrigen Kohlenstoff-Film geschichtet: die dicke Kohle-Loch bietet mechanische Festigkeit, während die Probe auf die dünne Kohlenstoffbedeckten Loch abgebildet. Auf der anderen Seite, beachten Sie, dass extrem dünne Eis und / oder Kohlenstoff kann in einer leicht gebrochen Unterstützung, die in eine Webseite (3D) drehen können die Folge sein. Um SNR zu maximieren, sollten Sie nicht benötigte Pufferkomponenten vermieden werden. Für Membranproteine, nimmt das Reinigungsmittel eine bedeutende Tribut von Kontrast (siehe Bild 2D, rechts). Zusätzlich durch Verringerung der Oberflächenspannung ändert sich das Waschmittel, in welcher Weise die Probe breitet sich auf dem Träger. Einige Membranproteine ​​erfordern das Vorhandensein von Lipid neben detergent, der den Kontrast weiter verringert. Um diese zu überwinden, die Probe in einem Puffer mit niedriger Waschmittelkonzentration und ohne Lipid kurz vor Kryo-Eint 37 verdünnt werden. Neue alternative Detergentien 16 und die Verwendung von Nanoscheiben 38, um die Transmembrandomäne Komponente stabilisiert anscheinend erfolgreiche Ansätze zur Abbildung Membranproteine ​​durch Kryo-EM ist.

Bemühen Sie sich um qualitativ hochwertige Bilder und die Vorbereitungen für die CTF-Korrektur. Verglaste Proben erfordern hohe Defokuswerte um eine ausreichende Bild (Phase) erzeugen dagegen, wo die CTF, die Funktion, die Intensität bezieht sich auf die Frequenz, hat mehrere Nulldurchgänge, wobei an diesem Punkt gibt es keine Informationen. Während CTF-Korrektur ist nicht notwendig, mit niedriger Auflösung 3D-Rekonstruktion, als Ziel für höhere Auflösung, um eine genaue Darstellung des 3D-Objekts zu erholen, Bilder mit unterschiedlichen defoci müssen gesammelt, so dass Rechen CTF-Korrektur durchgeführt werden kann.CTF Bestimmung und Korrektur in den großen SPA Software-Pakete 4-7 enthalten sind; Details kann an anderer Stelle 39 zu finden. Für eine optimale Korrektur CTF, nutzen eine Reihe von defoci. Eine gute Strategie ist, um unter 3-4 Defokuswerte abwechseln. Die Werte sind abhängig von der Größe des Makromoleküls (größere Größen erfordern weniger Defokussierung), das Eis / Kohlenstoff Dicke (dünner Probe benötigt weniger Defokussierung), und die Spannung (untere Spannung benötigt weniger Defokussierung). Für 200 kV, ist ein guter Ausgangswertebereich 2,5, 3, 3,5 und 4 um-Unschärfe. Die CTF manifestiert als alternierende Ringe hoher und geringer Intensität (Thon Ringe 40) im reziproken Raum Darstellung des Leistungsspektrums. Anzeige des Leistungsspektrums wird das Potenzial für Auflösung offenbaren; die Frequenz der breitesten sichtbar Thon Ring ist die nächste A-priori Abschätzung der erreichbaren Auflösung. Das Leistungsspektrum sollte regelmäßig überprüft werden, und Astigmatismus (nicht kreisförmig) Thon Ringe (Abbildung 3C) soll mit dem Ziel Stigmator korrigiert werden. Thon Ringe sollte mindestens bis zu der gewünschten Auflösung sichtbar.

Ein Kryo-EM-Datenmenge unter Verwendung dieses Protokolls erhaltenen kann direkt durch SPA, um eine 3D-Rekonstruktion zu erzeugen verarbeitet werden. Selbst bei einer idealen Probe, wird die Qualität des 3D-Rekonstruktion auf die Leistungsmerkmale und Eigenschaften des TEM Ausrüstung abhängen, und von der Bildverarbeitung. Mit den weiteren Verbesserungen in diesen beiden Fronten, und mit besonderer Erwähnung auf die neu entwickelte Direktelektronendetektoren, die Möglichkeit, 3D-Rekonstruktionen mit atomarer Auflösung konsequenter zu erhalten ist näher als je zuvor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethane Airgas 371745 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable
Liquid nitrogen Airgas 27135 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers Ted Pella 5326
Mica sheets, 1 x 4 cm Ted Pella 54
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type Electron Microscopy Sciences 70220-45
350 ml cryo-dewars Pope 8600
Cu 400 mesh holey grids  Quantifoil Quantifoil Q10525
Cu 400 mesh holey grids C-Flat Protochips CF-1.2/1.3-4C
Glow discharge device Electron Microscopy Sciences Model E7620
Turbo pumping station Gatan Model 655
Carbon evaporator Denton Vaccum Model 502B
Freeze plunger FEI Vitrobot Mark IV
Transmission electron microscope 200 kV FEI Model Tecnai F20
CCD Camera 4k x 4k Gatan UltraScan 4000 UHS
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Image Processing software EMAN http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Image Processing software Spider http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Image Processing software Freealign  http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualization software Chimera http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin Biosyn

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References

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