تسخير الطلب Bioorthogonal معكوس الكترون ديلز-ألدر الإضافة الحلقية لPretargeted PET التصوير

1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

على مدى السنوات الثلاثين الماضية، أصبح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أداة لا غنى عنها السريرية في تشخيص وإدارة من السرطان. لطالما اعتبرت الأجسام المضادة ناقلات واعدة لتسليم النظائر المشعة الباعثة للبوزيترون لأورام بسبب تقارب رائعة وخصوصية لالمؤشرات الحيوية للسرطان. 1،2 ومع ذلك، فإن بطيئة نسبيا الدوائية في الجسم الحي من الأجسام المضادة ولايات استخدام النظائر المشعة مع عدة أيام المادية نصف حياة. وهذا يمكن الجمع تسفر الجرعات الإشعاعية العالية إلى الأجهزة غير المستهدفة من المرضى، وهي المضاعفات المهمة التي هي ذات الأهمية السريرية منذ يتم حقن radioimmunoconjugates عن طريق الوريد، وبالتالي - على عكس جزئية بمسح الجسم CT - نتيجة في جرعات استيعابها في كل جزء من أجزاء الجسم، بغض النظر عن الأنسجة للاستجواب.

من أجل تجاوز هذه المسألة، فقد تم تخصيص جهد كبير لdevelopment استراتيجيات التصوير PET أن فصل النظائر المشعة وشاردة الاستهداف، وبالتالي الاستفادة من خصائص مفيدة من الأجسام المضادة في حين التفاف على القيود في وقت واحد الدوائية الذاتية الخاصة بهم. هذه الاستراتيجيات - يطلق في معظم الأحيان pretargeting أو استهداف متعددة الخطوات - وعادة ما تستخدم أربع خطوات: (1) ادارة جسم مضاد قادر على حد سواء المستضد وجين مشع ملزمة؛ (2) تراكم الأجسام المضادة في الأنسجة المستهدفة وإزالة لها من الدم. (3) إدارة لجين مشع جزيء صغير. و (4) ربط في الجسم الحي من جين مشع إلى الأجسام المضادة التي تتبعها التخليص السريع للجين مشع الزائد. 3-8 وفي بعض الحالات، يتم حقن عامل المقاصة إضافية بين الخطوتين 2 و 3 من أجل الإسراع في إفراز الأجسام المضادة أي التي لم لربط الورم ويبقى في الدم. 5

وبشكل عام، TWأنواع س استراتيجيات pretargeting هي الأكثر انتشارا في الأدب. في حين أثبتت كلا ناجحة في النماذج قبل السريرية، كما أنها تمتلك القيود الرئيسية التي أعاقت تطبيق السريرية الخاصة بهم. وتعتمد الاستراتيجية الأولى على تقارب عالية بين الأجسام المضادة streptavidin مترافق وradiolabels المعدلة البيوتين. ومع ذلك، فقد أثبتت المناعية للأجسام المعدلة streptavidin وجود مشكلة مقلقة فيما يتعلق الترجمة. 5،6،9،10 الاستراتيجية الثانية، في المقابل، توظف الأجسام المضادة bispecific التي تم هندستها وراثيا لربط كل من السرطان مستضد العلامات البيولوجية وناشبة رديولبلد جزيء صغير. 3،11-14 في حين أن هذا الطريق الأخير هو بالتأكيد الإبداعي وانطباقها اسع محدودة بسبب التعقيد، وحساب، وعدم وجود نمطية للنظام.

مؤخرا، قمنا بتطوير ونشر منهجية التصوير PET pretargeted بناء على الطلب معكوس الإلكترون ديلز-ألدر (IEDDA) رد فعل الإضافة الحلقية بين -cyclooctene العابرة (TCO) وtetrazine (TZ؛ الشكل 1) 11 في حين أن رد الفعل نفسه كان معروفا منذ عقود، شهدت IEDDA الكيمياء نهضة في السنوات الأخيرة كأسلوب bioconjugation بنقرة والكيمياء، وكما يتضح من عمل رائع من مجموعات من رالف Weissleder، جوزيف فوكس، وبيتر كونتي وغيرها. وقد تم تطبيق 12-15 وIEDDA الإضافة الحلقية في مجموعة واسعة من الإعدادات، بما في ذلك التصوير مضان مع الببتيدات، والأجسام المضادة، والجسيمات النانوية وكذلك التصوير النووي . مع كل radiohalogens وradiometals 16-26 وربط عالية الغلة ونظيفة وسريعة (ك 1> 30،000 M -1 ثانية -1)، انتقائي، و- خطيرة -. bioorthogonal 27 وعلى الرغم من عدد من أنواع نقرة الكيمياء - بما في ذلك أزيد آلكاين cycloadditions المحفز النحاس،-أزيد آلكاين cycloadditions-روجت سلالة، وشتاودينغر LIGations - هم bioorthogonal كذلك، هو مزيج فريد من حركية التفاعل بسرعة وbioorthogonality أن يجعل IEDDA الكيمياء ذلك مناسبة تماما لpretargeting التطبيقات في الكائنات كلها 28،29 على طول هذه الخطوط، فمن المهم أن نلاحظ أن التقرير الأخير من وجهة نظرنا وكانت مختبرات يست الأولى لتطبيق IEDDA الكيمياء لpretargeting: نشأ التقرير الأول للتصوير pretargeted مع IEDDA من عمل روسين، وآخرون وظهرت منهجية SPECT بتوظيف 111 tetrazine في المسمى 30.

كما ناقشنا أعلاه، فإن منهجية pretargeting أربعة خطوات بسيطة إلى حد ما (الشكل 2). في البروتوكول في متناول اليد، ويمكن وصفها استراتيجية pretargeted للتصوير PET من سرطان القولون والمستقيم التي توظف 64 النحاس وNOTA المسمى جين مشع tetrazine والمكورات تعديل TCO للأجسام المضادة huA33. ومع ذلك، في نهاية المطاف نمطية من هذه المنهجية هو واحد من غرام لهاتأكل الأصول، كما شاردة -cyclooctene المتحولة يمكن إلحاق أي الأجسام المضادة غير استيعاب، ويمكن أن تعلق tetrazine لمجموعة واسعة من المراسلين الإشعاعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الأخلاق بيان: تم تنفيذ كافة من التجارب على الحيوانات في الجسم الحي وصفها وفقا لبروتوكول المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للميموريال سلون كيترينج للسرطان مركز المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. توليف TZ-BN-NOTA

  1. في وعاء التفاعل صغيرة، ويحل 7 ملغ NH 2 -Bn-NOTA (1.25 × 10 -2 ملمول) في 600 ميكرولتر NaHCO 3 عازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 8.1). تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول. إذا لزم الأمر، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 8.1 باستخدام مأخوذة صغيرة من 0.1 M نا 2 CO 3.
  2. إضافة NH 2 حل -Bn-NOTA إلى 0.5 ملغ TZ-NHS (1.25 × 10 -3 ملمول) في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج.
    ملاحظة: TZ-NHS يمكن إما أن يكون وزنه من الجافة أو إضافتها من محلول المخزون من DMF الجاف أو DMSO (<50 ميكرولتر).
  3. السماح للمحلول التفاعل الناتجة للرد لمدة 30 دقيقة في RTمع الإثارة معتدل.
  4. بعد 30 دقيقة، وتنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة C 18 HPLC اللوني لإزالة غير المتفاعل NH 2 -Bn-NOTA. وNH 2 -Bn-NOTA يمكن رصدها عند طول موجي 254 نانومتر، في حين أن TZ-NHS وTZ-BN-NOTA من الأفضل مراقبة عند طول موجي 525 نانومتر من.
    ملاحظة: مرات الاحتفاظ ومن الواضح أن تعتمد اعتمادا كبيرا على الإعداد المعدات HPLC من كل مختبر (مضخات، والأعمدة، وأنابيب، وغيرها). ومع ذلك، لتقديم سبيل المثال، إذا كان التدرج من 0: 100 MeCN / H 2 O (على حد سواء مع 0.1٪ TFA) إلى 100: 0 MeCN / H 2 O أكثر من 25 دقيقة والتحليلي 4.6 × 250 ملم C 18 عمود يستخدم ومرات الاحتفاظ TZ-BN-NOTA، TZ-NHS، وNH 2 -Bn-NOTA ستكون حوالي 15 دقيقة، 16.5 دقيقة، و 10 دقيقة على التوالي. يمكن تنقية المنتج من مكونات رد فعل الأخرى إما في تشغيل واحد أو أشواط متعددة باستخدام عمود HPLC C 18 شبه إعدادي أو إعدادي 1 H-NMR، والشرجytical HPLC، وESI-MS كلها الأساليب التي يمكن استخدامها للتحقق من نقاء الانتهاء السلائف TZ-BN-NOTA 11
  5. تجميد شاطف HPLC جمعها باستخدام النيتروجين السائل.
  6. التفاف أنبوب جمع المجمدة في مبهمة رقائق الألومنيوم.
  7. وضع أنبوب جمع المجمدة في lyophilizing سفينة O / N لإزالة الطور المتحرك HPLC.
  8. تخزين المنتج النقي (وردي مشرق الصلبة) في الظلام في -80 ° C.
    ملاحظة: هذا هو نقطة توقف مقبولة في الإجراء. وأكملت السلائف TZ-BN-NOTA مستقر لا يقل عن 1 سنة في ظل هذه الظروف.

2. إعداد huA33-TCO Immunoconjugate

  1. في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل، وإعداد 1 ملغ / مل (2.7 ملم) حل TCO-NHS في DMF الجاف.
  2. في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج، وإعداد 2 ملغ / مل (13.3 ميكرومتر) حل huA33 في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 (0.01 M PO 4 3-،
  3. باستخدام مأخوذة صغيرة (<5 ميكرولتر) من 0.1 M نا 2 CO وضبط درجة الحموضة من الحل الضد إلى 8،8-9،0. استخدام أي ورقة درجة الحموضة أو الرقم الهيدروجيني متر مع مسرى مكروي لمراقبة درجة الحموضة، ويجب الحرص على عدم السماح للدرجة الحموضة على الارتفاع فوق درجة الحموضة 9.0.
  4. وبمجرد أن حل الضد هو في درجة الحموضة الصحيحة، إضافة إلى حجم من الحل TCO-NHS الموافق 8 حكمه ضرس استر تفعيلها. على سبيل المثال، إضافة 7.9 ميكرولتر من 1 ملغ / مل TCO-NHS الحل (1.07 × 10 -7 مول TCO-NHS) إلى 1 مل من محلول 2 ملغ / مل huA33 الأجسام المضادة (1.33 × 10 -8 مول huA33). لا تتجاوز 5٪ DMF من حيث الحجم في الحل.
  5. المزيج بلطف الحل عن طريق قلب لأنبوب microcentrifuge عدة مرات.
  6. التفاف أنبوب microcentrifuge مبهمة في رقائق الألومنيوم.
  7. السماح للحل لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT مع الإثارة معتدل.
  8. بعد 1 ساعة على RT، وتنقية immunoconjugate الناتجة باستخدام الاحجام المتاح معبأة مسبقاالبريد استبعاد العمود تحلية. أولا، وشطف العمود حجم الإقصاء كما هو موضح من قبل المورد لإزالة أي مواد حافظة موجودة على العمود أثناء التخزين. ثم، تضاف خليط التفاعل إلى العمود حجم الإقصاء، وشطف العمود مع 1.5 مل 0.9٪ ملحي معقم، وبعد ذلك جمع المنتج باستخدام 2 مل من 0.9٪ ملحي معقم مثل شاطف.
    ملاحظة: هذه الخطوة سوف تسفر عن الانتهاء huA33-TCO كحل 2 مل.
  9. قياس تركيز الناتجة huA33-TCO على الأشعة فوق البنفسجية فيس معمل.
  10. إذا كان المطلوب تركيز أعلى، والتركيز على حل huA33-TCO باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي مع 50،000 الوزن الجزيئي قطع.
    ملاحظة: من المهم أن نلاحظ أنه في حين huA33 ومجموعة متنوعة من الأجسام المضادة المعروفة الأخرى (على سبيل المثال، بيفاسيزوماب، تراستوزوماب، ستوكسيماب، وJ591) ومتسامح جدا من أن تتركز، يمكن أن تحدث التجميع وهطول الأمطار على التركيز في حالات أخرى. الباحثون محاولة هذا procedلدى عودتهم مع الأجسام المضادة الجديد يجب أن تثق في الأدب أو المعرفة الخاصة بهم من الأجسام المضادة في سؤال بشأن ما إذا كان أو لم يكن لتركيز الأجسام المضادة.
  11. تخزين الانتهاء immunoconjugate huA33-TCO في 4 درجات مئوية في الظلام.
    ملاحظة: هذا هو نقطة توقف مقبولة في الإجراء. يجب أن يكون الانتهاء المكورات ماب-TCO مستقر لمدة 3 أشهر على الأقل في ظل هذه الظروف التخزين.

3. 64 النحاس Radiolabeling من TZ-BN-NOTA

ملاحظة: هذه الخطوة من البروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات - أو أداء أي عمل آخر مع النشاط الإشعاعي - الباحثون أن يتشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. اتخاذ جميع الخطوات الممكنة للحد من التعرض للإشعاع المؤين.

  1. في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل، وإعداد 0.5 ملغ / مل (723 ميكرومتر) حل TZ-BN-NOTA.
  2. في microc 1.7 ملأنبوب entrifuge، إضافة 10 ميكرولتر من الحل TZ-BN-NOTA (5 ميكروغرام) إلى 400 ميكرولتر من 0.2 M NH 4 OAC درجة الحموضة 5.5 العازلة.
  3. في مصلحة الكيمياء الإشعاعية المناسبة لحفظ المذكرة، وقياس وتسجيل كمية النشاط الإشعاعي في العينة باستخدام تدريج جرعة قبل وبعد الخطوات التي تلت ذلك في البروتوكول أدناه (3،4-3،8). وهذا سوف يساعد مع تحديد دقيق لعائدات الإشعاعية.
  4. إضافة 2،000 μCi (74 من mbq) من 64 النحاس إلى حل TZ-BN-NOTA.
    ملاحظة: عادة، [64 النحاس] CuCl 2 يتم توفير في حجم صغير (<30 ميكرولتر) من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك، وبالتالي فقط كميات صغيرة (<10 ميكرولتر) هناك حاجة إلى هذا الحل الأسهم للتفاعل radiolabeling. إذا كانت هناك حاجة كميات أكبر من [64 النحاس] CuCl 2 الأوراق المالية، ورد فعل radiolabeling متسامح زيادة حجم رد الفعل الكلي. ومع ذلك، ينبغي رصد الرقم الهيدروجيني للمحلول التفاعل radiolabeling بعناية لضمانأنها لا تقع تحت الرقم الهيدروجيني 4.0.
  5. السماح للحل لاحتضان لمدة 10 دقيقة في RT مع الإثارة معتدل.
  6. بعد 10 دقيقة من الحضانة، تنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة C 18 HPLC اللوني. مرات الاحتفاظ ومن الواضح أن تعتمد اعتمادا كبيرا على الإعداد المعدات HPLC من كل مختبر (مضخات، والأعمدة، وأنابيب، وغيرها). ومع ذلك، لتقديم سبيل المثال، إذا كان التدرج من 5:95 MeCN / H 2 O (على حد سواء مع 0.1٪ TFA) ل95: 5 MeCN / H 2 O أكثر من 15 دقيقة يتم استخدامها، والوقت الاحتفاظ من 64 النحاس وTz- BN-NOTA ينبغي أن يكون حول 9.8 دقيقة في حين سيكون مجانا، uncomplexed 64 النحاس أزل مع الجبهة المذيبات في حوالي 2-4 دقائق.
  7. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة شاطف HPLC.
  8. تنحل المنتج 64 النحاس وTZ-BN-NOTA في 0.9٪ ملحي معقم.
    ملاحظة: نظرا ل12.7 ساعة الجسدية نصف العمر لل64 النحاس، هذه ليست نقطة توقف مقبولة في الإجراء. أداء توليف 64 النحاس وTZ-BN-NOTومباشرة قبل حقن جين مشع، واتبع الخطوة 3.7 على الفور من قبل الخطوة 4.5.

4. في فيفو Pretargeted PET التصوير

ملاحظة: كما هو الحال في القسم بروتوكول 3، هذه الخطوة من البروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات الباحثون أن يتشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. اتخاذ جميع الخطوات الممكنة للحد من التعرض للإشعاع المؤين.

  1. في ماوس عارية athymic الإناث، وزرع تحت الجلد 1 × 10 6 SW1222 خلايا سرطان القولون والمستقيم والسماح لهؤلاء لتنمو لتصبح 100-150 ملم 3 طعم أجنبي (بعد 9-12 أيام التلقيح). 11
  2. تمييع قسامة من الحل huA33-TCO من القسم بروتوكول 2 إلى تركيز 0.5 ملغ / مل في 0.9٪ ملحي معقم.
  3. ضخ 200 ميكرولتر من الحل huA33-TCO (100 ميكروغرام) في الوريد ذيل الفأر طعم أجنبي الحاملة.
  4. اسمحوا 24 ساعة لتراكم huA33-TCO في الورم من الفأرة.
  5. تمييع 64 النحاس وTZ-BN-NOTA جين مشع إلى تركيز 1.5 ميلي كوري / مل في 0.9٪ ملحي معقم.
  6. ضخ 200 ميكرولتر من 64 النحاس وTZ-BN-NOTA حل لجين مشع (300 μCi، 11.1 من mbq؛ 1.6 نانومول من 64 النحاس وTZ-BN-NOTA، على افتراض نشاط معين 6.7 من mbq / نانومول) في الوريد ذيل الفئران الحاملة للطعم أجنبي.
  7. في نقطة زمنية التصوير المطلوب (على سبيل المثال، 2، 6، 12، أو 24 ساعة بعد الحقن)، تخدير الماوس مع الأيزوفلورين 2٪: خليط غاز الأكسجين.
  8. ضع الماوس على السرير من صغير الماسح الضوئي PET الحيوان. الحفاظ على التخدير أثناء الفحص باستخدام الأيزوفلورين 1٪: خليط غاز الأكسجين. قبل وضع الحيوان على السرير الماسح الضوئي، تحقق من التخدير باستخدام طريقة إصبع القدم قرصة وتطبيق مرهم البيطرية للعيون من الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير.
  9. الحصول على البيانات PET الماوس عن طريق ثابتمسح مع حد أدنى من 20 مليون الأحداث المتزامنة باستخدام نافذة الطاقة من 350-700 كيلو وتوقيت نافذة صدفة من 6 NSEC. بعد الانتهاء من الاستحواذ على الصورة، لا تترك الماوس غير المراقب وليس لوضعه في قفص مع فئران أخرى حتى استعاد وعيه عليه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الخطوات الثلاث الأولى من التجربة - تركيب TZ-BN-NOTA، والاقتران من TCO لhuA33، وradiolabeling من TZ-BN-NOTA بناء من (أرقام 3 و 4) - هي موثوق بها للغاية. في حالة الإجراء أعلاه، تم تصنيعه في بناء TZ-BN-NOTA في ارتفاع العائد والنقاء. تم تعديل الأجسام المضادة huA33 مع 4.2 ± 0.6 TCO / ماب، وكان TZ-BN-NOTA رديولبلد مع 64 النحاس لتسفر عن جين مشع النقي في> 99٪ نقاء الكيمياء الإشعاعية،> 85٪ لتصحيح تسوس الغلة، ونشاط محدد من ~ 6.7 من mbq / نانومول (الشكل 5). التفاعل من المكورات huA33-TCO وجين مشع tetrazine يمكن اختبارها باستخدام المشع لحظة اللوني طبقة رقيقة (iTLC). ويتم ذلك عن طريق خلط tetrazine رديولبلد (100 μCi، 0.55 نانومول، على افتراض نشاط معين 6.7 من mbq / نانومول) مع زيادة طفيفة للhuA33-TCO (50 ميكروغرام، 0.66 نانومول) في الرقم الهيدروجينيمخزنة osphate المالحة (7.4 درجة الحموضة) في RT لمدة 5 دقائق. ثم، ورصدت ما يقرب من 1 μCi من الحل على عكس المرحلة C 18 TLC لوحة وسمح لتجف. ويدير TLC في 9: 1 MeCN: H 2 O، وتحليلها لوحة باستخدام المشع TLC لوحة القارئ. إذا كان يعمل رد فعل نقرة كما هو مخطط لها، ينبغي للو ligated 64 النحاس وNOTA-A33 البقاء في خط الأساس. إذا، من ناحية أخرى، يفشل رد الفعل، وسوف تظهر الحرة 64 النحاس وTZ-BN-NOTA في أو بالقرب من جبهة المذيبات.

الانتقال إلى تجارب التصوير في الجسم الحي، في البروتوكول المذكورة أعلاه، تم توظيف الفئران عارية athymic تحمل A33، معربا عن مستضد، SW1222 xenografts سرطان القولون والمستقيم. كلا biodistribution الحاد (ن = 5 في نقطة زمنية) والتصوير PET (ن = 12) تجارب تكشف أن الاستراتيجية pretargeting قادرة على ترسيم نمو الورم القولون والمستقيم مع ممتازة النقيض من الصورة ونسب عالية النشاط الورم إلى الخلفية (الشكل 6). امتصاص 64 النحاس وTZ-BN-NOTA في الورم هو واضح في نقاط زمنية مبكرة: ID 3.5٪ ± 0.6٪ / ز و 4.1٪ ± 0.6٪ ID / ز في 1 ساعة و 4 آخر ساعة حقن، على التوالي. ومع ذلك، في هذه النقاط في وقت مبكر، وتحجب ذلك بسهولة من خلال كمية النشاط الإشعاعي المقاصة من خلال الأمعاء من الفأرة (11.9٪ ± 4.4٪ ID / ز و 8.8٪ ± 3.4٪ ID / ز في البراز في 1 ساعة و 4 بي ساعة، على التوالي). على مدى عدة ساعات، ويمهد لجين مشع الزائد من خلال البراز (1.4٪ ± 0.5٪ ID / ز في 24 ساعة بي)، ويصبح الورم السمة الأبرز في الصورة (4.0٪ ± 0.9٪ ID / ز في 24 ساعة بي). في هذه النقاط وقت لاحق، ويرسم الورم بشكل جيد في الصورة، ونسب النشاط الورم إلى خلفية مرتفعة جدا؛ على سبيل المثال، فإن استراتيجية غلة الورم: نسب العضلات 26.6 ± 6.6 في 12 ساعة بي و 27.0 ± 7.4 في 24 ساعة بي وليس من المستغرب، والتجارب للسيطرة على استخدام فقط 64 النحاس وTZ-BN-NOTA، والأجسام المضادة غير محددة، سص huA33 دون الأنصاف TCO مترافق أسفرت جميعها عن الحد الأدنى من امتصاص في الورم.

كما ستناقش لاحقا، هذه الاستراتيجية pretargeting - مثل جميع الاستراتيجيات pretargeting - لديها عدد من المتغيرات التي تتطلب التحسين عند تطبيقها على أنظمة الأجسام المضادة / المستضدات جديدة. اثنين من أهمها كتلة ماب-TCO بناء حقن وطول الفترة الزمنية الفاصلة بين حقن للبناء ماب-TCO وحقن جين مشع. إذا كان مقدار ماب-TCO المكورات مرتفع جدا أو الوقت الفاصل بين الحقن قصيرة جدا، ومقدار مجانا ماب-TCO في الدم ترتفع واحتمال ردود الفعل انقر تحدث في الدم وليس في الزيادات الورم. على سبيل المثال، في نظام 64 نحاس / huA33 مناقشتها هنا، فإن كلا من إدارة 300 ميكروغرام من huA33 (بدلا من 100 ميكروغرام) أو استخدام لمدة 12 ساعة الوقت الفاصل (بدلا من 24 ساعة) أدى إلى زيادات ملحوظة في رانه كمية النشاط الإشعاعي مرئية في قلب من الفأرة (الشكل 7A والشكل 7B، على التوالي). في كل من هذه الحالات، فإن رد الفعل نقرة لا تزال تحدث بشكل واضح في الورم، كما يتضح من كمية امتصاص ورمي في نقطة زمنية في وقت مبكر؛ ومع ذلك، وتشكيل الأجسام المضادة رديولبلد في الدم هو أيضا واضح. في حين أن هذا هو المغري لاقالة لأن الأجسام المضادة رديولبلد شكلت في الدم سوف لا تزال في نهاية المطاف تجد طريقها إلى الورم، وهذا الهزائم إلى حد ما الغرض من استخدام منهجية pretargeting، حيث أن الأجسام المضادة رديولبلد سوف تعمم ببطء قبل أن تصل إلى الورم، وبالتالي رفع جرعة الأسعار للأجهزة غير المستهدفة. على العكس من ذلك، إذا تم استخدام الأجسام المضادة القليل جدا، وسوف كمية امتصاص في الورم يعانون بشكل طبيعي. أكثر من اللازم قد الأوقات الفاصلة طويلة يقلل أيضا مستويات امتصاص الورم نتيجة لبطء استيعاب الأجسام المضادة، transcyclooctene الأزمرة، أو الأجسام المضادة / المستضدات سفك. تشخيص عشرمشاكل جنوب شرقي هو أكثر تحديا، ولا يمكن أن يتحقق ببساطة من خلال دراسة البيانات PET. ومن الواضح، يجب الحفاظ على توازن دقيق. ولذلك، فمن المستحسن أن أي محاولة المحققين لتطبيق هذه الاستراتيجية إلى الضد / نظام مستضد الجديد استخدام كميات كبيرة من ماب-TCO بناء (≥ 200 ميكروغرام) وأوقات زمنية قصيرة (≤ 24 ساعة) كنقاط انطلاق وتحسين من هناك.

الشكل (1)
الشكل 1. معكوس الإلكترون الطلب ديلز-ألدر [4 + 2] الإضافة الحلقية نقرة ربط بين tetrazine وtranscyclooctene.

الشكل 2
الشكل 2. مثال على الخطوات الأربع للمنهجية pretargeting. ويستند هذا الرقم على البحث الذي نشر أصلا في JNM. Zeglis، BM وآخرون. وPET pretargeted بس استراتيجية التصويرإد على bioorthgonal ديلز-ألدر انقر الكيمياء، مجلة الطب النووي. 54، 1389-1396 (2013). © 2013 جمعية الطب النووي والتصوير الجزيئي، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مخطط لتعديل huA33 مع TCO-NHS.

الشكل (4)
الشكل 4. مخطط لتركيب و64 النحاس radiolabeling من TZ-BN-NOTA. ويستند هذا الرقم على البحث الذي نشر أصلا في JNM. Zeglis، BM آخرون استراتيجية التصوير PET pretargeted على أساس bioorthgonal ديلز-ألدر انقر فوق الكيمياء، مجلة الطب النووي. 54، 1389-1396 (2013). و# 169؛ 2013 جمعية الطب النووي والتصوير الجزيئي، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. تتبع الراديوية HPLC من النقى 64 النحاس وTZ-BN-NOTA.

الشكل (6)
الشكل 6. صور PET من 64 النحاس وTZ-BN-NOTA / A33-TCO pretargeting الاستراتيجية. الفئران الحاملة xenografts SW1222 تحت الجلد (100-150 مم 3) كانت تدار huA33-TCO (100 ميكروغرام) عن طريق حقن الوريد الذيل. بعد 24 ساعة، كانت تدار نفس الفئران 64 النحاس وTZ-BN-NOTA (10،2-12،0 من mbq [275-325 μCi]) عن طريق حقن الوريد الذيل، وبعد ذلك التقط 2 و 6 و 12 و 18 ساعة بعد إدارة المادة المشعة. TRansverse (أعلى) والاكليلية (القاع) صور مستو تتقاطع مركز الأورام. مستويات عالية من امتصاص في الأمعاء في نقاط زمنية مبكرة (أي 2 و 6 ساعة) واضحة إلى حد كبير من قبل 12 ساعة، وترك الورم (السهم الأبيض) محددة بوضوح من جميع الأنسجة غير المستهدفة بنسبة 12 و 18 ساعة بعد الحقن. ويستند هذا الرقم على الأبحاث التي نشرت أصلا في JNM. Zeglis، BM آخرون استراتيجية التصوير PET pretargeted على أساس bioorthgonal ديلز-ألدر انقر فوق الكيمياء، مجلة الطب النووي. 54، 1389-1396 (2013). © 2013 جمعية الطب النووي والتصوير الجزيئي، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. صور PET من التجارب pretargeting دون المستوى الأمثل. (A) الفئران BEAكانت تدار حلقة xenografts تحت الجلد SW1222 (100-150 ملم السهم) huA33-TCO (100 ميكروغرام) عن طريق حقن الوريد الذيل. بعد 12 ساعة، كانت تدار نفس الفئران 64 النحاس وTZ-BN-NOTA (10،2-12،0 من mbq [275-325 μCi]) الذيل حقن الوريد. (ب) كانت تدار الفئران تحمل xenografts تحت الجلد SW1222 (100-150 ملم السهم) A33-TCO (300 ميكروغرام) عن طريق حقن الوريد الذيل. بعد 24 ساعة، كانت تدار نفس الفئران 64 النحاس وTZ-BN-NOTA (10،2-12،0 من mbq [275-325 μCi]) الذيل حقن الوريد. في كلتا الحالتين، تم تصوير الفئران 12 ساعة بعد الحقن من 64 النحاس وTZ-BN-NOTA. في كل من لوحات، وعرضية (أعلى) والاكليلية (القاع) صور مستو تتقاطع مركز الأورام. في حين أن استراتيجية pretargeting يحدد بشكل واضح الورم في كلتا الحالتين، فإن النتائج في كل من هذه الصور هي دون المستوى مقارنة مع تلك المعروضة في الشكل 6. وفي كلتا 7A و7B، هناككمية كبيرة من امتصاص النشاط خلفية في القلب. في ظل ظروف الشكل 7A، وهذا هو الأرجح نتيجة huA33-TCO بناء لا يتم منحهم وقتا كافيا لتوطين في الورم. في ظل ظروف الشكل 7B، وهذا هو الأرجح نتيجة للحقن الكثير من huA33-TCO وجود immunoconjugate الزائد لا يزال في الدم حتى 24 ساعة بعد الحقن. ويستند هذا الرقم على الأبحاث التي نشرت أصلا في JNM. Zeglis، BM آخرون استراتيجية التصوير PET pretargeted على أساس bioorthgonal ديلز-ألدر انقر فوق الكيمياء، مجلة الطب النووي. 54، 1389-1396 (2013). 2013 جمعية الطب النووي والتصوير الجزيئي، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

والميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية التصوير PET pretargeted هو أنه قادر على ترسيم الأورام مع الهدف إلى خلفية تباين الصورة في جزء فقط من الجرعة إشعاع الخلفية التي تنتجها الأجسام المضادة المسمى مباشرة. على سبيل المثال، في نظام التصوير سرطان القولون والمستقيم وصفها هنا، تم توظيف البيانات من التجارب biodistribution حادة لإجراء عمليات حسابية قياس الجرعات للاستراتيجية pretargeting مقرها النحاس-64 جنبا إلى جنب مع وصفت مباشرة-64 النحاس وNOTA-huA33 و 89 عنصر الزركون-DFO-huA33. هذه الحسابات تبين بوضوح فوائد قياس الجرعة للنظام pretargeting، وخصوصا عندما بالمقارنة مع الأجسام المضادة المسمى عنصر الزركون 89 أكثر أهمية سريريا. الجرعة الفعالة للاستراتيجية pretargeting هي 0.0124 ملي سيفرت / من mbq، في حين أن 89 عنصر الزركون-DFO-huA33 هو أكثر من 30 أضعاف: 0.4162 ملي سيفرت / من mbq. صالح قياس الجرعة من pretargeting هي أقل وضوحا عند مقارنة إلى 64 النحاس المسمى واحدntibody (0.0359 ملي سيفرت / من mbq)، على الرغم من أن تأثير مفيد لا يزال موجودا.

واحدة من نقاط القوة أهم من هذا IEDDA pretargeting منهجية غير نمطية لها: يمكن إلحاق -cyclooctene العابرة إلى أي الأجسام المضادة التي لم يتم استيعاب، ويمكن تركيبها على مجموعة واسعة من الشحنات إلى tetrazine. في الواقع، والدافع الرئيسي لدينا لكتابة هذا البروتوكول هو تمكين مجموعات بحثية أخرى لتوظيف هذه الطريقة مع مختلف أنظمة الجسم المضاد / مستضد / النظائر المشعة. على طول تلك الخطوط، نعتقد أنه أمر بالغ الأهمية لمعالجة عدد من القضايا التي يجب أخذها في الاعتبار عند الباحثين تكييف هذه المنهجية لأنظمة أخرى.

أولا، واختيار من الأجسام المضادة هي مهمة جدا. ببساطة، يجب أن تكون الأجسام المضادة غير بتدخيل أو المنضوية بمعدل بطيء جدا. في حين لم يتم بعد تحديد المعلمات الحركية مثالية، والأجسام المضادة و-cyclooctene العابرة رد الفعل كان يحمل يجب أن تبقى علىسيكون خارج الخلية، لاستيعاب وعزله من الأجسام المضادة قبل حقن جين مشع يقلل بشكل كبير من عدد من التفاعلات في الجسم الحي انقر. في النظام الموصوفة هنا، أهداف الأجسام المضادة huA33 وتربط للمستضد A33، وهو بروتين سكري عبر الغشاء المعبر عنها في> 95٪ من جميع سرطانات القولون والمستقيم. الأهم من ذلك، وقد تبين أنه حتى بعد ربط هدفه، يبقى مجمع huA33 الأجسام المضادة / المستضدات الموجودة على سطح الخلية لعدة أيام. 31-33 في حين أن ضرورة وجود الأجسام المضادة غير استيعاب، هي باعتراف الجميع جود قيود مع الاستراتيجية، وهو تشكيلة واسعة من الأجسام المضادة غير استيعاب معروفة، وربما أبرزها CC49 الأجسام المضادة التي تستهدف TAG72 أن روسين، وآخرون. واستكشافها في عملهم الممتاز pretargeting. 30،34،35

ثانيا، هذه الاستراتيجية pretargeting - مثل أي دولة أخرى - يتطلب تحسين كبير. وبالإضافة إلى هوية لntibody وجين مشع tetrazine، يجب النظر في اثنين من المتغيرات الحرجة: كمية من الأجسام المضادة حقن والوقت الفاصل بين الحقن من الأجسام المضادة وجين مشع. لقد تناول كل من هذه المتغيرات في القسم ممثل النتائج أعلاه، ولكن أن أكرر لفترة وجيزة، إذا يعمل إما الكثير من الأجسام المضادة أو قصيرة جدا من الوقت الفاصل، كميات كبيرة من ماب-TCO المكورات سيبقى في الدم في وقت الحقن من جين مشع. وهذا، بدوره، سيؤدي إلى في الجسم الحي نقرة ربط تحدث في الدم وليس على الورم، وتشكيل المتداولة، الأجسام المضادة رديولبلد التي سوف تتراكم ببطء فقط في الورم على مر الزمن. وعلى العكس، إذا تم توظيف إما القليل جدا من الأجسام المضادة أو طويلة جدا وقت الفاصل، فإن المبلغ النهائي من النشاط الإشعاعي في الورم يكون دون المستوى الأمثل. في رأينا، وأداء التصوير الدقيق، أو الأفضل، والتجارب biodistribution الحادة مع مؤسسة التبغ الحكومية العراقية الأجسام المضادة المسمى مباشرةLF قبل أي تجارب pretargeting هي الطريقة الأكثر موثوقية للتعرف على كمية من الأجسام المضادة المطلوبة والوقت الفاصل المثالي بعد الحقن الأولي من الأجسام المضادة بناء. للجماهير حقن مختلفة من رديولبلد MAB، فإن هذه التجارب توفر بيانات ملموسة على كل من تطهير radioimmunoconjugate من الدم وتراكمه في الورم، مما يسمح لاختيار أكثر الظروف واعدة للتجارب pretargeting.

وأخيرا، لا بد من النظر الدوائية من جين مشع القائم على tetrazine عند اختيار النظائر المشعة مناسبة. في النظام الموصوفة هنا، وتفرز رديولبلد TZ-BN-NOTA شاردة من الجسم عن طريق القناة الهضمية مع بعمر نصف ما يقرب من 3-4 ساعة، مما يجعل 64 النحاس النظائر المشعة الباعثة للبوزيترون مع متعجلة المادية الأكثر مكملة الحياة. للأسف، البيولوجية النصف الحياة للشاردة tetrazine طويلة جدا من أجل أن تكون متوافقة مع الالبريد المتحللة بسرعة أكبر radiometal 68 جا (ر 1/2 = 68 دقيقة). في هذه الحالة، فإن أي نشاط إشعاعي في الورم الاضمحلال من خلال العديد من الأرواح نصف قبل الانتهاء من تطهير جين مشع الزائد من الجسم. ونتيجة لذلك، فإن الصور لا بد من الحصول عليها في نقاط زمنية مبكرة، عندما تبقى نسب النشاط الورم إلى خلفية منخفضة 36 ومن الناحية المثالية، أجيال المستقبل من radioligands tetrazine سيتم المهندسة - ربما عن طريق من مضاد، غلكأيشن، أو وسائل أخرى - على إفراز من الجسم بسرعة أكبر. وسيتيح هذا للradiolabeling مع تدهور بسرعة أكبر النظائر المشعة مثل 68 غ و 18 F، مما سيؤدي بدوره إلى زيادة تعزيز فوائد قياس الجرعة لاستراتيجية التصوير pretargeted. في نهاية المطاف، والتكيف مع الباحثين هذه التكنولوجيا للاستخدام مع النظائر المشعة الأخرى للتصوير (على سبيل المثال، 124111 في، 18 F، و 89 عنصر الزركون، 68 غ، الخ) أو العلاج (على سبيل المثال، 177 لو، 225 تيار متردد، 125الخ)، وسوف تحتاج إلى تطوير لدمج chelators مختلفة أو radiolabeling مجموعات التعويضية بروابط القائم على tetrazine جديدة. فإن تحقيق شامل في هذه التركيبات الدوائية للرواية سيكون ضروريا لضمان المباريات مفيدة بين خصائص تطهير بروابط والمادية للنصف العمر للالنويدات المشعة.

في النهاية، ونحن نأمل كثيرا في أن باحثين آخرين يرون وعد هذه التكنولوجيا pretargeting وتوظيف ذلك مع أنظمة الأجسام المضادة / المستضدات جديدة. بينما توضح الفقرات السابقة أن هذه العملية التكيف قد لا تكون دائما بسيط، هو إيماننا بأن هذه المنهجية يمكن أن يكون له تأثير كبير على التصوير النووي، والعلاج النويدات المشعة المستهدفة، وما وراءها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
  3. Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
  4. Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
  5. Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
  6. Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
  7. Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
  8. Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
  9. Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
  10. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
  11. Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
  12. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
  13. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
  14. Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
  15. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
  16. Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
  17. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
  18. Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
  19. Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
  20. Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21, (3), 5011-5014 (2011).
  21. Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
  22. Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
  23. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
  24. Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
  25. Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
  26. Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
  27. Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
  28. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
  29. Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
  30. Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
  31. Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
  32. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
  33. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
  34. Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
  35. Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
  36. Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics