における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

出芽酵母は、生物活性化学物質の作用機序を学術、製薬、幅広い、および産業科学者に興味がある。決定または出芽酵母、〜6000の遺伝子の欠失変異体と低形質必須遺伝子のための完全なコレクションのモデル真核生物である変異体は、市販されている。変異体のこれらのコレクションは、系統的に化学物質を許容するために必要な化学-遺伝子の相互作用、 すなわち遺伝子を検出するために用いることができる。この情報は、順番に、化合物の作用の可能性が高いモードに報告します。ここでは、出芽酵母における化学遺伝的相互作用の迅速な同定のためのプロトコルについて説明します。我々は、アクションの明確に定義された機構を有する化学療法剤5-フルオロウラシル(5-FU)を用いた方法を実証する。我々の結果は、核TRAMPのRNAエキソソームおよびDNA修復酵素は、以前メートルと一致する5-FUの存在下で増殖のために必要とされることを示すベースのバーコード化学遺伝学的アプローチおよび5-FUに悪影響RNA及びDNA代謝に影響を与えることを知ってicroarray。これらのハイスループットスクリーニングの必要な検証プロトコルも記載されている。

Introduction

遺伝的ツールとモデル生物出芽酵母で利用可能なリソースを一括遺伝子がネットワークは、生物学的システムの要件を満たすためにとして機能する方法に新たな洞察を提供し、大規模なゲノム機能研究を可能にした。これらのツールの礎石は、酵母1,2内のすべてのオープンリーディングフレームの非必須遺伝子欠失の完全なセットの共同制作だった。顕著な観察は、標準的な実験室条件下​​で半数体として増殖させた場合の酵母遺伝子のわずか〜20%が生存に必要とされることであった。これは別の生物学的経路を利用して、ゲノムの摂動に対する緩衝する細胞の能力を強調しています。組み合わせて個別に実行可能な、しかし、致死的に接続または収束並列生物学的経路のシグナル及び生物学的機能を説明する遺伝的相互作用のネットワークを形成する遺伝的変異体。条件付きテの発展に伴い必須遺伝子のmperatureに敏感と低次形態対立遺伝子技術は、非必須遺伝子3,4の研究に限定されていません。この概念は、類似の細胞プロセスに関与する遺伝子が5が一緒にクラスタ化方法を説明するための公平な遺伝的相互作用マップを生成するゲノム規模で適用されている。

遺伝子ネットワークの化学摂動模倣遺伝子欠失( 1)6。過敏症の削除株の高密度アレイに対して増殖抑制化合物を問い合せると、化学的ストレスに耐えるために必要とされる遺伝子のリスト、つまり 、化学遺伝的相互作用プロファイルを識別します。遺伝的相互作用と同様に、化学ライブラリーの大規模スクリーニングは、一緒に行動クラスタの類似した様式を有する化合物7が示されている。したがって、化合物の化学遺伝的相互作用のプロファイルを確立することによって、作用機序は、LARと比較することによって推測することができるGE-規模合成遺伝的および化学的な遺伝的相互作用のデータセット8,9。

化合物のスコアは、尋問されている大規模な化学遺伝学的スクリーニングでは、バーコードの競合アッセイにより行われてきた。この手法では、欠損株のプールされたコレクションは、化学物質を含有する培地の少量の数世代にわたって一斉に成長させる。各欠失変異体は、固有の遺伝的バーコードを保有するので、欠失株のプール内の個々の突然変異体の生存/増殖は、マイクロアレイまたは高スループット配列10によって追跡される。

生物活性化合物を含む固体寒天上で増殖させた物理的に配列された変異体のコロニーの大きさを監視することにより、適合度を推定することは、化学遺伝的相互作用11,12を識別するための有効な方法である。このアプローチは、競合ベースのスクリーニングの費用対効果の高い代替物を提供し、化学物質の小さなライブラリーをアッセイするために適している。ここで概説S.における化学遺伝的相互作用のリストを生成するための簡単な方法論である分子生物学操作またはインフラストラクチャに依存しない。セレビシエ。のみ酵母削除コレクション、ロボットまたは手動のピン止め装置、及び自由に利用できる画像解析ソフトウェアを必要とする。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

注:この手順の一般的なワークフローを図2に概説されている。

成長阻害用量の1の決定

  1. 酵母一晩培養の調製
    注:このプロトコルで使用される酵母エキス-ペプトン-デキストロース増殖培地(YEPD)は、標準的なレシピ13である。
    1. BY4741( のMATa HIS3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)YEPD寒天プレート上の細胞外ストリークし、30℃で、可視コロニーが形成されるまで、48時間インキュベートする。
    2. 単一コロニーを滅菌した培養容器にYEPD液体培地の5ミリリットルを接種することによって、一晩培養を準備します。連続回転または振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。文化は一般的に(〜2×10 8細胞/ ml)朝までに飽和状態に達するだろう。
  2. 様々な化学物質の投与量を含有する固体寒天培地調製
    1. のいくつかの株式を準備化学物質は、適当な溶媒中で100×所望の最終濃度で試験する。
      注:効果的な濃度は、化学に依存し、経験的に決定されなければならない。当初は幅広い最終濃度範囲をテストすることをお勧めします。 すなわち 、低μMからハイmMまで。
    2. 化学物質の各濃度について、いくつかの滅菌培養チューブにアリコート溶融YEPD寒天を3mlを、試験される。 55℃の水浴中で場所が固化維持する。
    3. 試験対象の化学物質の各濃度について12ウェルプレート内の重複ウェルのそれぞれペアに溶融メディア、渦に混合する2-3秒、およびピペット1ミリリットルを100倍化合物の30μlを添加する。唯一の制御車両を含めるようにしてください。プレートを室温で一晩に設定できるようにします。余分なメディアを捨てる。
  3. スプレッドプレーティング細胞
    1. ステップ1のように一晩増殖させ飽和酵母培養の2μL、とYEPD液体培地の10ミリリットルを接種する。1.2。
    2. プレートウェルあたり希釈された酵母培養液25μl、滅菌ガラスビーズやロッドを使用して均一に広げ、そしてプレートが炎の下で乾燥させる。 48時間、30℃でプレートをインキュベート。
    3. プレート上での酵母の増殖(コロニーの両方の合計数と大きさ)を評価する。画面を実行するために10%以上の-15%の成長を阻害しない化合物の亜致死濃度を選択する。

2.体系的化学遺伝画面

  1. ソースプレートの欠失変異体アレイのメンテナンス(DMA)と準備
    1. グリセロールストックから欠失変異体アレイを構築する上で詳細な説明についてはBaryshnikova 14を参照してください。欠失変異体は、プレートあたり384コロニーの密度で配列された後、DMAは4​​℃で数ヶ月間保存することができる。それぞれに成長するコロニーを防止するためにG418、必要に応じて200μgの/ mlを含むYEPD寒天上に複製するその他。
      注:複数のシリアル複製が遅い成長株の損失を防止し、サプレッサー変異株の出現を最小限にするために避けるべきである。半数体としてのコレクションを維持する場合、これは特に関連する。
    2. ロボットシステムを配列の微生物を使用して、すべてのレプリカプレーティングの手順を実行します。また、手動のピン止めツールを使用して配列されたコロニーを操作します。
      注:酵母の削除コレクションは、いくつかの商業的供給源から半数体と二倍体として利用可能で、通常は96ウェルプレートにグリセロールストックとして出荷されています。
  2. 欠失変異体の配列を凝縮
    1. G418200μgの/ mlを含むYEPD寒天培地の250ミリリットルを準備します。 G418の有効濃度は変化してもよく、各ロットは、実験的にテストする必要があります。
    2. プレートあたりのG418を200μg/ mlを含むYEPD寒天の50ミリリットルを注ぐことにより、5 YEPD寒天プレートを準備します。配列を凝縮する前にこの一日を行い、プレートを室温で冷却することができるようにerature一夜平らな平らな面に。
      注:4つのプレートが1536 - ひずみ密度で収集に必要となる、第五のプレートが余分として注入する。
    3. プレート当たり384コロニーの密度で突然変異体の削除コレクションを含む16ペトリ皿を取り出し、室温(〜1時間)に来ることができます。
    4. 繊細なタスクが拭く使用して各プレートの蓋の上に形成されたすべての結露を拭いてください。これを怠ると、配列された変異体の配列と交差汚染の上に堆積されて水滴になることがあります。
    5. 微生物の配列ピン止めロボットを用いて、プレート当たり1536個のコロニー(4ペトリ皿)に、プレート当たり384コロニー(16ペトリ皿)の密度からDMAを凝縮。プレート1ピンから1 番目のコロニーが凝縮された配列の1列1行するように、これを実行し、プレート2の1 番目のコロニーは、1列2、2列1を行にプレート3の1 番目のコロニー行、とする行2のプレート4の1 番目のコロニーコラム2。
    6. 30℃で一晩連結配列をインキュベートする。
    7. ソースプレートからコロニーの均一な移動を確保するための配列を調べます。 DMAが正しく( 図4A)凝縮されたために、ガイドとして役立つわざわざ配列に組み込まれ、いくつかの空白の位置が、あるでしょう。
      注:これらは、試験化合物を含有する培地上にレプリカプレーティングのソースプレートになる。単一ソースプレートは、複数のpinningsのために使用することができる。また、多くのロボットは、酵母の同じような数字が毎回転送されていることを確認します相殺機能を持ちます。
  3. レプリカプレート欠失変異体配列
    1. コントロールの700ミリリットル(車両のみ)、および実験的なメディア(化学系)の700ミリリットルを準備します。これは(条件あたり12のプレートに加え、2エクストラ)三連でアッセイを行うために十分である。
    2. プレート当たりの試験化学物質またはコントロールを含むYEPD寒天の50ミリリットルを注ぐ。プレートtを許可Oフラットさえ表面に室温で一晩冷やす。
    3. レプリカプレートにロボットを用いて、実験的に決定された濃度の化学物質を含有するプレートを3組、ならびにビヒクル対照を含有するプレートを3組にDMAを接種する。 24〜48時間室温でプレートをインキュベートする。

3.イメージングプレートとデータ解析

  1. インキュベーターからプレートを取り出し、それらを画像化の前に、室温(〜1時間)に来ることができます。これは、プレートを画像化しながら、結露を防ぐことができます。
  2. 蓋を取り外し、フラットベッドスキャナ上に表を下にして置くことにより24及び48時間での画像プレート。少なくとも300dpiの解像度で画像をキャプチャします。代替的に、画像をキャプチャするデジタルカメラを使用。そうする場合は、場所のプレートは、暗い背景に表向きにして画像に蓋を取り外します。
    注意:プレートのファイルフォーマットおよび位置決めを使用定量化プログラムに依存するであろう。 Balony 15、SGAtools 16、及びScreenMill 17を含むいくつかのオープンソースプログラムのいずれかを使用してアレイコロニーの大きさの定量化と比較を行う。

画面の4。バリデーション

注:この段階では、いくつかの酵母の欠失変異体は、対象の化学物質への過敏として獲得します。これらの化学遺伝的相互作用は、次の二つの方法で検証する必要があります。最初の感受性株の同一性は、PCRによって確認されるべきである。第二に、化学物質過敏症は、独立して採点されなければならない。以下に概説ひずみ過敏症、酵母生物学における一般的な技術を検証するために、スポッティングアッセイを行うための簡単​​なプロトコルである。

  1. ストリークアウトのG418を200μg/ mlを含むYEPD寒天上に酵母削除コレクションから(過敏)変異体を希望する。コロニーが形成されるまで30℃でインキュベートする。に応じてプライマーを用いた診断PCRによって株の遺伝子型を確認してください製造業者のプロトコル。
  2. 各菌株のためのYEPD液体の5ミリリットルを接種し、回転または振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。
  3. OD 600を測定し、無菌のdH 2 O中にOD 600 = 1に各菌株を希釈これらは現在、正規化された酵母培養物である。
  4. 96ウェルプレートのウェルA1に正規化された野生型酵母(BY4741)培養物100μlを分注する。井戸B1-H1に最大7つの追加の株を100μl分注する。
  5. A6-H6を通じて井戸A2-H2に無菌のdH 2 O90μlのを分配するためにマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用してください。最後に、正規化された酵母培養物の1:10希釈系列を用意。シリアルにマルチチャンネルピ ​​ペッターで列2に列1の10μlのピペッティングして起動し、6の希釈が行われるまで、96ウェルプレート全体で継続する( すなわち 、10 0〜10 -5)。
  6. マルチチャンネルを使用してグリッドに希釈した酵母培養の2-5μlの転送化学的および車両コントロールを含むYEPD固体培地上にピペッター。 24〜48時間のための適切な温度でプレートをインキュベートする。
  7. (BY4741対照と比較して)プレートを点検し、化学物質に選択した変異体の感度を比較する。ステップ3.2と24と48時間での画像プレート。
    注:関連遺伝子オントロジーまたは機能を有するいくつかの過敏株の同定は、スクリーンの有効性に自信を向いているが、遺伝子の野生型コピーを含有するプラスミドと過敏欠失菌株の形質転換は、正式にその遺伝子を確立するために必要とされる興味の削除は(第二部位変異を隠されていない)薬剤感受性の原因となる。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

このアプローチの妥当性確認として、我々は、上記で概説したプロトコル次の化学療法剤5-フルオロウラシル(5-FU)の代表的な化学遺伝的相互作用の画面を行った。 5-FUは、チミジル酸シンターゼ、ならびにDNAおよびRNA代謝18を破壊することが知られている。 5-FUの化学遺伝的相互作用は十分に研究されており、ヘテロ接合およびホモ接合性欠失コレクション8,19の両方を使用して、酵母バーコードマイクロアレイ技術によって研究されている。ここでは、同様の結果が突然変異コロニーの大きさの比較定量することにより得ることができることを示している。

それを行う画面が非必須半数体遺伝子欠失コレクションを利用していることに留意すべきである。このタイプのスクリーンはまた、必須遺伝子変異体を含むことを可能にする、二倍体株は、温度感受性突然変異体、および低次形態対立遺伝子を用いて行うことができる。半数体欠失コレクションを利用する一つの利点は、増加した薬物である小文字の区別もターゲット経路のityが、遺伝子産物の完全な不在を与え。しかし、二つの重要な欠点が必須遺伝子過敏症を照会することができないことであり、半数体コレクションは複数の伝播の上のために選択する自発的なサプレッサー変異を起こしやすい。これは、コレクションの劣化につながる可能性がある。このように、薬物の効果に配列し、感度の完全性と幅広さとのトレードオフの固有の貿易があります。これは、考慮しなければならず、選択された最も適切な変異体のコレクションは、所望の用途に基づく。

まず、5-FUの適切な亜致死濃度がスクリーニングに使用される(5-FUの濃度を増加させることにBY4741( のMATa his3でΔ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)細胞を増殖し、視覚的に、酵母コロニーの成長を評価することによって、10μMであると決定された図3A)。あるいは、同様の結果が成長がたにより得ることができる以前のグループ10,20によって概説されるように液体培養マイクロプレートリーダー( 図3B)を用いて培養物の光学密度の頻繁なモニタリングでマイクロタイタープレートではast。

シンガーローターを使用して、酵母DMAは10μM5-FUまたはジメチルスルホキシド(DMSO)対照( 図4A)を含む培地上でプレート密度当たり1536個のコロニーで複製した。これらのプレートを室温で24時間インキュベートし、フラットベッドスキャナで画像化した。両方の実験群および対照プレート上の各変異体のためのコロニーの大きさの測定はBalony画像解析エンジン15を用いて行った。 Balonyソフトウェアを制御するための実験アレイ相対上のコロニーの大きさの比を算出する。ユーザが比のしきい値を設定することができ、画面で実行された場合に、少なくともp値は、各変異体のために割り当てられる三重。検討した≤0.8の割合を示した私達の代表画面変異体においてEDはヒットする必要。コロニーの定量の結果は、y軸上の各コロニーを、x軸上の配列位置( 図4B)または比率( 図4C)によって順序付けられた遺伝子欠失のためのサイズ比をプロットすることによりグラフィカルに提示することができる。

合成病気/スクリーニングにおいて同定致死変異体は、遺伝子オントロジー(GO)解析を行うことにより、機能的な説明に基づいて分類することができる。 SのリストのGO解析のためのいくつかの公的に利用可能なツールがあります。 cerevisiaeの遺伝子; Funspec 21、DAVIDバイオインフォマティクスデータベース22,23、およびサッカロマイセスゲノムデータベース(SGD)ゴー·タームファインダー24を含む。 5-FU画面で0.8以下の比は、遺伝子欠失はFunspecの入力リストとして使用した。 Funspec系統的または共通の酵母遺伝子名のリストを受け取り、オトならびに遺伝子オントロジー、機能的分類、局在化、タンパク質複合体の要約を出力するそのリストに富んでいる彼女の便利な分類。行わ代表画面ウリジン修飾及びRNA監視機構、およびDNA損傷( 表1)に応答して、tRNAはウォブルを含む、RNA代謝のためのオントロジーの濃縮を示した。これらの結果は、核Trfと/ Rrp6 /エア/ Mtr4ポリアデニル(TRAMP)エキソソーム25によって処理されるポリアデニル非コードRNAの蓄積で5-FUの治療結果を示した以前の研究に同意する。したがって、これらの知見は、以前の化学遺伝子スクリーニングと5-FUの生物活性8,19の公知の機構と一致している。

すべてのハイスループット機能ゲノムアプローチと同様に、それは、結果を検証することが必要である。酵母の変異体が第一の標的遺伝子のプロモーターとKANMX破壊カセット内にアニールするプライマーを用いたPCR-検証する必要がある化学物質の遺伝的相互作用を検証する。有効なため株の選択ationが強い表現型を示し、グループが、機能的に良い出発点を提供し、ある程度任意しかし、優先順位付けの変異体である。次に、化学物質に対する過敏スポッティングアッセイは、酵母変異体の適応度を測定するための一般的なアプローチを用いて確認される。この目的のために、酵母株の連続希釈物を、適切な化学用量ならびに対照を含む培地上で格子状にスポットする。例として、( 図5)複雑なTRAMPのair1trf5変異体と5-FUの化学遺伝的相互作用を確認。これらの遺伝子は、TRAMP核エキソソームの成分をコードする。我々は、コアTRAMPの3'-5 'エキソヌクレアーゼ活性を欠くrrp6株を、我々の研究室の高密度DMAコレクションに失われたことに注意。新鮮rrp6変異体を得ることに私たちはrrp6と 5-FUにもTRAMP活性が5-FUを許容するために必要であることを確立し、化学的な遺伝的相互作用を表示していることを確認。これが示して大きな欠失コレクションの整合性が重要な適切なDMAのメンテナンスや歪みの検証を作り、時間をかけて妥協なる可能性があること。

私たちの画面には、敏感な5-FUなど(RAD50、RAD52MRE11を含む)いくつかのDNA修復酵素に変異体を同定した。コロニーの大きさのスコアは、野生型に比べて0.7、0.65、および0.42として10μMの5-FUにこれらの変異体の相対的な適合性を示した。我々の確証スポッティングアッセイ( 図5)に基づいて、これらの値に起因コロニーサイズスコアによるフィットネス測定の限られたダイナミックレンジに過小評価である可能性が高い。これは独立して、シリアルスポッティングによって相互作用を確認するための第二の理由に焦点を当てています。いくつかの化学遺伝的相互作用の大きさは、主要なデータ分析に過小評価することができます。我々の結果は十分なレゾールを提供し、三連で、〜4800 - ひずみ半数体欠失コレクションで行っ成長ベースの化学遺伝学的スクリーニングすることを示す自信を持って、特定の化学遺伝的相互作用を分離するution。

図1
図1:化学摂動に対する過敏症を引き起こす化学遺伝の相互作用の概略図で遺伝子欠失は、化学の対象となる生物学的プロセスの同定を可能にする。 (A)収束経路は、遺伝子欠失(geneA)または化学的(geneB)のいずれかによって破壊することができる。個別には、これらの細胞の傷害に起因する生物学的経路における固有の冗長性を許容することができる。しかし、組合せ細胞生存率のいずれかで合成病気または致死表現型をもたらす損なわれる。化学的に誘導されたストレスを軽減するための重要な(B)遺伝子の欠失(geneC)は、過敏症を引き起こし、化学処理によって破壊した生物学的経路を示す。 jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:化学遺伝学的スクリーニングのためのワークフローのサブ阻害用量の(A)の測定:。親の酵母株が固定相に成長するには、1希釈された:5000、およびスプレッドは増加した化学線量を含む固体YEPD培地上にプレー。大きくない10〜15%未満の増殖阻害はDMAに対するスクリーニングのために選択された最高濃度。 (B)系統的化学遺伝スクリーン:S.ロボットを固定するハイスループット配列を使用cerevisiaeの DMAは、試験化学物質の適切な濃度を含む培地上にプレーティングレプリカです。プレートは、24~48時間室温でインキュベートし、画像形成され、かつ相対的コロニーサイズが決定される。REF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3 :.サブ阻害濃度の決定5-フルオウラシルを含有する固体培地上でBY4741細胞の(A)の成長。 5000および5-フルオロウラシルの濃度増加にメッキ:飽和BY4741培養物1に希釈した。 (B)5-フルオロウラシルを含む液体培地中でBY4741細胞の増殖曲線。約4×10 4細胞を22時間10分ごとに測定した5-FUとのODの濃度を増加で三重に堆積させた。

図4
図4:5-化学遺伝学的スクリーニングフルオロウラシル。(A)S. 10μMの5-FU(右)とDMSOコントロール(左)を含むYEPD寒天上に複製cerevisiaeの欠失変異体の配列。 (B)化学遺伝学的スクリーニングの結果:配列位置によって順序付けDMSO対照と比較し、10μMの5-FU上の変異体の相対成長。 (C)コロニーのサイズ比によって順序付けDMSO対照と比較して、10μM5-FUに対する変異体の相対的増殖。 ≤0.8の比率閾値は、両方のグラフに示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:化学遺伝相互作用の検証 。 DMSOコントロール(A)上に成長させたいくつかの単離された変異株の連続希釈液を、10μMの5-FU( C)。

GOカテゴリ P値 同定された遺伝子(ヒット) #ヒット GOカテゴリにおける遺伝子の総数#
tRNAのウォブルウリジン修正は、[GO:0002098]を 2.24×10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 7 24
転写、DNA依存性[GO:0006351] 1.69×10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
翻訳[GO:0006412] 4.28×10 -5 RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A 22 318
tRNAのゆらぎ位置ウリジンチオール化は、[GO:0002143]を 1.88×10 -4 NCS6 URM1 TUM1 3 5
転写調節、DNA依存性[GO:0006355] 4.98×10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
タンパク質urmylation [GO:0032447] 6.33×10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
熱ストレスに応答して核からのmRNAの輸出[GO:0031990] 2.04×10 -3 RPB4 NUP120 NUP133 3 10
核ポリアデニル依存CUT異化プロセス[GO:0071039] 2.04×10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 10
トリプトファン代謝過程[GO:0006568] 2.15×10 -3 TRP5 TRP3 2 3
初期ゴルジ輸送[:0034498 GO]にエンドソーム 2.75×10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 11
リボソーム小サブユニットの生合成[GO:0042274] 3.63×10 -3 SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A 4 24
クロマチン修飾[GO:0016568] 3.64×10 -3 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 9 114
ATP代謝過程[GO:0046034] 4.23×10 -3 VMA2 VMA1 2 4
液胞プロトン輸送V型ATPアーゼ複雑なアセンブリ[GO:0070072] 4.23×10 -3 VMA21 VPH2 2 4
染色体のローカライズ[GO:005万] 4.23×10 -3 NUP120 NUP133 2 4
mRNA輸送[GO:0051028] 4.59×10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 6 58
液胞の酸性化[GO:0007035] 4.89×10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
核からのrRNAのエクスポート[GO:0006407] 5.63×10 <SUP> -3 NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A 4 27
エンドサイトーシス[GO:0006897] 6.57×10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 7 82
mRNAの3 '末端処理の核のmRNAサーベイランス[GO:0071031] 6.92×10 -3 AIR1 MPP6 2 5
ncRNAのポリアデニル[GO:0043629] 6.92×10 -3 AIR1 TRF5 2 5
核ポリアデニル依存のsnoRNA異化プロセス[GO:0071036] 6.92×10 -3 AIR1 TRF5 2 5
核ポリアデニル依存snRNAの異化プロセス[GO:0071037] 6.92×10 -3 AIR1 TRF5 2 5
トリプトファン生合成過程[GO:0000162] 6.92×10 -3 TRP5 TRP3 2 5
ER膜へのタンパク質の挿入[GO:0045048] 6.92×10 -3 GET1 GET4 2 5
mRNA安定化[GO:0048255] 6.92×10 -3 ATP25 IGO1 2 5
DNA損傷刺激[GO:0006974]への応答 7.05×10 -3 MUS81 R​​AD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 12 197
">#ヒット
GOカテゴリ P値 同定された遺伝子(ヒット) GOカテゴリにおける遺伝子の総数#
核ポリアデニル依存rRNAの異化プロセス[GO:0071035] 8.46×10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 16

表1:遺伝子オントロジー(GO)5-フルオロウラシル感受性変異体のキャラクタリゼーション。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ここで説明は、化学遺伝的相互作用のプロファイルを生成するためのアプローチである。この方法は単純で、化学物質の存在下および非存在下での総合的な遺伝子欠失コレクション内の各株のコロニーのサイズを比較することにより、化学的傷害を許容するために必要なすべての遺伝子が同定されている。感受性株の結果リストの注釈濃縮分析は、アクションの薬品モードへの洞察を提供するために使用することができる。このプロトコルは、出芽酵母用に最適化されているが、それはまた、例えば大腸菌のような他の配列された微生物の欠失コレクションで使用するために適合させることができる携帯摂動26,27の数百を調べるために成功裏に使用されてきた慶應義塾コレクションを、 大腸菌

酵母および他の生物における化学遺伝プロファイリングは、十分に確立されている。これらの研究の大部分は、マイクロアレイ分析またはハイスループットsequ介し欠失変異体をプールし、定量化する競合アッセイに依存してきたユニークな遺伝的バーコードのencing。このアプローチは、大規模な化学ライブラリーの堅牢な化学遺伝的プロファイルを生成するのに成功している。ここで説明する方法論は、試験化合物の少数の化学遺伝学的分析に有用な代替手段を提供します。アッセイは、ハイスループットシークエンシングまたはマイクロアレイ解析より少ないコストは法外であり、配列の偏りを受けない単純な読み出しを提供する。概説したようにプロトコルがコロニーを操作するためのロボット機器を必要とするが、そのようなシステムは、より手頃になってきていると、交互プロトコルは手動ピニングツールで使用するために調整することができ、一例は、材料のリストに含まれている。

これは、一般的には、このアプローチや化学遺伝プロファイリングの限界を認識することが重要である。まず、化合物は、出芽酵母で生存率に影響を持っている必要があり、または特定の生物が利用されている。多くの基本的な生物学的処理している間と機能は細胞内への化学物質の取り込みがするように、生物の特定の化学物質の遺伝的相互作用は、広範囲に変化し得る、よく真核生物の間で保存されている。また、いくつかの欠失株が複数の薬物処置8に敏感であることが判明していることに留意すべきである。これらには、薬物流出、液胞機能、膜の完全性に関与する遺伝子が含まれる。これは、作用の直接的および間接的なモードに関して結論を​​行うときに考慮多剤耐性を考慮することが重要である。

ここで説明する画面は半数体欠失コレクション、酵母における化学遺伝学的分析のための一般的な手法を用いて行った。アクションの化合物のモードの決定におけるさらなる援助が利用可能な酵母変異体の複数のコレクションが存在することになります。これは完全なホモ接合性およびヘテロ二倍体欠失コレクションではなく、条件付きの温度感受性必須遺伝子変異体、Decreだけでなく、利用可能なツールの信じられないほどの深さ、使いやすさのを考えるとエピジェネティック基づく分子療法3,4,28を調査するために使用することができるmRNAの摂動(DAMP)酵母変異体ライブラリー、合成ヒストンH3およびH4変異体コレクション、によってASEDの豊富方法論、および必要な限られたインフラストラクチャは、このアプローチは、化学化合物の機序に関して豊富な機能情報にアクセスするためのアクセス可能なフォーマットを提供する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

CJNラボの研究はNSERC、カナダの癌協会研究所(CCSRI)、およびカナダの乳がん財団(BC-ユーコン支店)から操作する補助金によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  2. Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  3. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
  4. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  6. Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  7. Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
  8. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  9. Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
  10. Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
  11. Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
  12. Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10, (6), (2010).
  13. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  14. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
  15. Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
  16. Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
  17. Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
  18. Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
  19. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
  20. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
  21. Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
  22. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
  24. Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
  25. Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
  27. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  28. Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics