Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
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Immunology and Infection

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Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

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Abstract

Protocol

Este estudo foi realizado com autorização do Estado da Saxônia e Saxônia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acordo com a Seção 8 da lei alemã de protecção dos animais (24D-9168,11-1 / 2008-24).

1 Isolamento celular

1.1 Preparação do fémur e da tíbia

  1. Anestesiar o mouse usando uma concentração de isoflurano 5% vaporizando isoflurano em uma lixeira fechada. Após o mouse parou de se mover por 3 s, realizar o deslocamento cervical.
  2. Desinfectar os membros posteriores com etanol (96%). Retire a pele e os músculos e os ossos separar com um bisturi estéril.
    1. Comece com uma incisão na pele inguinal, e estender a incisão em direção ao maléolo medial e realizar uma dissecação circular da pele ao redor do bezerro inferior. Remover a pele das pernas completamente por descascar proximalmente.
    2. Retire o músculo quadríceps do fêmur com um bisturi afiado, remova ambos os peroneus anteriore os grupos e músculo gastrocnêmio desarticular a perna na articulação do quadril, localizando e dissecando os ligamentos.
    3. Comece anterior e proceder ao redor da articulação, girando cuidadosamente a perna e cortando transversalmente os ligamentos, desarticulando, assim, a articulação.
  3. Lavar fémur e da tíbia com etanol a 96% durante um período mínimo de 90 segundos para garantir a preparação de células asséptica. Continuar o processo de lavagem com PBS estéril para enxaguar restante etanol.
    Nota: Todos os passos subsequentes devem ser estéreis para evitar contaminação.

1.2 Colheita de Medula Óssea

  1. Cortar a extremidade proximal e distal de cada osso com um par de tesouras finas para obter acesso aos veios femorais e tibiais. Tenha cuidado com este passo, uma vez que estes ossos se quebram com muita facilidade.
  2. Lave os ossos com meio quente (M199 + 10% de soro fetal de vitelo (FCS), + 1% de Penicilina / Estreptomicina). Use uma agulha estéril de 28-G, uma seringa de 1 ml, e entre 10-15 ml por meio deosso para enxaguar.
  3. Segure o osso com uma pinça fina e lavar um por um até que fique semi-translúcido. Cuidadosamente aplicar pressão para a extremidade do êmbolo da seringa, a fim de minimizar o stress celular.
  4. Filtrar a medula óssea através de um 70 um nylon web e recolher o filtrado. Para extrair a quantidade máxima de medula óssea, lavar repetidamente a partir das extremidades distais e proximais.
  5. Enxaguar a peneira com PBS e recolher o filtrado. Desalojar cuidadosamente detritos e conglomerados celulares por agitação suave e pipetagem.

1.3 Cultivo

  1. Centrifuga-se a suspensão de células a 250 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células com aproximadamente 25 ml de meio. Repetir uma vez.
  2. Ressuspender as células em 6 ml de meio depois do segundo passo de lavagem. Misturar 50 ul da solução de células com 50 uL de azul de tripano. Contar as células numa câmara de contagem sob um microscópio de luz. Calcula-se o número de cvaras na solução usando esta fórmula:
    Equação 1
  3. Semear as células em placas de superfície de ultra-low-fixação de 6 poços para evitar a aderência permanente para o fundo da placa. Usar uma concentração de 10 6 células por ml, com até 6 ml por poço.
  4. Complementar a suspensão com 20 ng / ml de M-CSF para promover a diferenciação de células.
  5. Cultura das células durante 5 dias a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono e observar diariamente.

1.4 colheita de células

Nota: Estes passos devem ser realizados em gelo. Prossiga com ou 1.4.1 ou 1.4.2 em conformidade.

  1. Neste ponto, efectuar a totalidade da cultura, incluindo os macrófagos diferenciados que aderem às placas de cultura, mesmo que sejam placas de superfície de ultra-baixo de fixação.
    1. Efectuar a totalidade da cultura por pipetagem suave e desprender com uma solução de 4 ° C PBS, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA. Repita até que as placas são claras dos restantes células aderentes - confirmar sob um microscópio se não tiver certeza.
  2. Alternativamente, descartar macrófagos aderentes por meio da colheita com o sobrenadante as células em suspensão, que contêm predominantemente monócitos.
    1. Colheita das células não aderentes com uma solução de PBS livre de EDTA e 0,5% de BSA. Não aplique muita força, a fim de evitar a retirada macrófagos levemente aderentes.

1,5 FACS-análise (Opcional)

Nota: É possível a esgotar a suspensão de células de CD117 + e células progenitoras de haste pelo uso de MACS. Use protocolos fabricante para este procedimento.

  1. Colher as células de acordo com os passos ou 1.4.1 ou 1.4.2.
  2. Centrifuga-se as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C e repetir este passo novamente.
  3. Ressuspender pelo menos 250.000 células em 300 ul de FACS buffer por sonda.
  4. Transferir a solução para uma célula de 96 poços de placa (30 uL por poço).
  5. Centrifuga-se a suspensão de células a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
  6. Remover o sobrenadante e adicionar 25 uL de anticorpo a cada poço (diluição utilizar fabricante).
  7. Corar as células com anticorpos (seguintes protocolos do fabricante para fenotipagem de células após os passos 1.5.1-1.5.6. Marcadores vulgarmente utilizados para a identificação de monócitos / macrófagos incluem CD11b, F4 / 80 (Figura 3), CD115 (Figura 2), e GR- 1.
    Nota: Para uma descrição mais detalhada de soluções de celulares, é recomendado o uso de marcadores como CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G e CD192. Características celulares foram previamente descritos 12.
  8. Incubar as sondas de 20 min a 4 ° C.
  9. Centrifugar as sondas a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender com 200 ul de tampão de FACS. Repita thé entrar duas vezes.
  10. Transfira as sondas em tubos de FACS e realizar a análise FACS 12.
  11. Realizar a análise de FACS 12 no dia 0, 3 e 5 para analisar a diferenciação celular.

2. Cauda Vein Injection

2.1 Preparação

  1. Aquecer os animais sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante cerca de 10 min. Observar os animais durante o aquecimento para reconhecer sinais de superaquecimento.
  2. Ressuspender as monócitos isolados em etapas 1.1- 1.4, em 150 ul de NaCl, e carregar as células para uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 30G. Vortex levemente a solução antes de carregar a seringa para garantir que todos os monócitos são injectados. Sempre lidar com as células em gelo para evitar penhora mediada pelo calor e ativação de monócitos.

2.2 Prender

  1. Evitar perturbar outros ratos na gaiola na escolha de um rato por injecção intravenosa.
  2. Posicione o mouse para o limitador. Evite muito prEssure e ter cuidado com os membros posteriores. (Figura 4)
    Nota: Como alternativa, usar anestesia geral para garantir estresse livre movimentação dos animais.
  3. Certifique-se de que o rato tem espaço para respirar antes de fechar o limitador.

2.3 Injeção

  1. Desinfetar o local da injecção com agente de desinfecção. Pulverizar na cauda do rato e deixar em repouso durante pelo menos 1 min.
  2. Interrompa o fluxo de sangue venoso da cauda, ​​aplicando uma leve pressão para o lado lateral da cauda acima do local da injeção, para uma melhor visibilidade das veias.
  3. Vire a cauda 90 graus, antes da injeção. (Figura 5)
  4. Injetar em um ângulo de 45 graus. Injetar lentamente e não mais de 5 mL por grama para evitar animais prejudicando.
  5. Se houver uma bolha, que é um sinal de uma injecção falhou, interromper imediatamente e repetir a injecção mais proximalmente.
  6. Parar o sangramento no lado da injeção através da aplicação suave pressure por cerca de 1 min.
  7. No final do procedimento, o afastador de abrir e colocar o rato na sua gaiola.
  8. Observar o rato durante 20 minutos para assegurar que o animal não foi prejudicada por injecção e decúbito esternal é mantida. Aumentar o tempo de observação até que o mouse recupera a consciência suficiente. Retorne o mouse para a companhia de outros animais somente depois que ele se recuperou totalmente.

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Representative Results

A solução de células extraídas da medula óssea de murídeo consiste em vários tipos de células. Os principais tipos de células são linfócitos, granulócitos e monócitos. Os tipos de célula pode ser estimado pelo tamanho e granularidade, que é mostrado na Figura 1, tanto para as suspensões nativas e as células colhidas depois de 5 dias de diferenciação. Observe a composição celular mudando durante o cultivo. No entanto, a classificação exata das populações deve contar com expressão distintiva de marcadores celulares.

O marcador mais importante utilizado para identificar as células do sistema-MPS é CD115, que funciona como o receptor de M-CSF e é expresso especificamente em células progenitoras de monócitos, monócitos e macrófagos. Portanto, não pode ser usado para identificar subconjuntos distintos MPS-, mas pode estimar com fiabilidade a quantidade absoluta de células empurrados para a diferenciação de monócitos / macrófagos. Veja a Figura 2 para um cronograma de expressão CD115 durante diferemciação.

O marcador de maturidade F4 / 80 é útil para diferenciar monócitos juvenis, monócitos e macrófagos maduros. Os macrófagos mostram forte expressão de F4 / 80 em comparação com juvenil progenitores monócitos, que são negativos para o marcador. Monócitos maduros mostram intermediária expressão de F4 / 80. Uma combinação de CD115 e F4 / 80 marcadores, por conseguinte, representa um método viável para a quantificação e diferenciação das células monitorização (ver Figura 3).

A combinação de CD115 e F4 / 80 é suficiente para a observação de rotina de cultura e o controlo de qualidade antes da aplicação de células. Um exame mais detalhado dos monócitos derivadas da medula óssea no dia 5 de cultivo confirma as propriedades estruturais e funcionais em concordância aos de monócitos do sangue periférico 12.

É importante fixar o rato cuidadosamente no limitador, evitando tensão na cauda. Restringir freedom de movimento, tanto quanto possível, sem inibir a respiração para facilitar a injecção.

Figura 1
Figura 1. Painel esquerdo:. Composição de tipos de células no dia 1 em cultura de tipos de células incluem linfócitos, monócitos e granulócitos. Painel da direita: Observe a composição celular mudando durante o cultivo. População celular inclui monócitos e macrófagos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. O espaço temporal de expressão de CD115 durante a diferenciação. Note-se que> 95% de todas as células são CD115 positivo após 5 dias de diferenciação, o que indica que a grande maioria das células são ou monócitos ou macrófagos. A classificação pode ser com base no tamanho da célula e granularidade, mas marcadores celulares específicos são mais confiáveis. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. O aumento da expressão de monócitos / macrófagos marcador maturidade F4 / 80 Dia 5:. Note-se a presença de uma população com o intermediário F4 / 80 expressão, o que é consistente com o fenótipo de monócitos. Dia 7:. Observe a-shift direito de F4 / 80 expressão, de acordo com a maturação de macrófagos por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Rato fixo em restrainer para injeção na veia da cauda. Restringindo Depois cuidadosamente o mouse, girar a cauda 90 graus até que as veias são visíveis no lado dorsal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. secção transversal esquemática da cauda do ratinho. A figura ilustra a localização dos vasos dentro da cauda do rato. As artérias (vermelho) estão localizados no lado ventral e dorsal, e as veias são na face lateral da cauda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós descrevemos um método simples e de baixo custo para isolar grandes quantidades de monócitos murino de medula óssea. Em comparação com outros protocolos utilizando sangue periférico, que obtêm rendimentos de monócitos 5 de 1,4 x10 6, somos capazes de obter rendimentos mais elevados, de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monócitos a partir de um único rato doador.

Ao considerar os desafios com este método, é importante mencionar o potencial de contaminação quando se trabalha em condições não estéreis. Se a lavagem e os seguintes passos de lavagem não são adequadamente seguidos, a contaminação por bactérias e fungos é provável. Além disso, a medula óssea é constituída por suspensões de células heterogéneas, incluindo granulócitos, linfócitos e células eritróides. Normalmente estas células desaparecem entre o dia 2 e 3 de cultura, devido à ausência de factores de crescimento. Depois do factor de crescimento impulsionado diferenciação, os macrófagos são a principal fonte de contaminação. Para manter tele número de macrófagos e de baixo para minimizar a diferenciação de monócitos para macrófagos, o uso de placas ultra-baixas de fixação e os passos de lavagem são críticas acima mencionadas.

É difícil identificar um marcador que é exclusivamente específico de monócitos. A interferência entre os marcadores que requer a utilização de mais de um marcador, e existe variabilidade na granularidade e tamanho das células na análise de suspensões de células. Os marcadores e descrições apresentados nas Figuras 1-3 são boas alternativas para tipos representativos de células em cultura. Pode ser difícil distinguir os vários tipos de células, especialmente após o dia 5. Assim, é crítica a utilização de outros marcadores, como CD115 e F4 / 80.

Considerando a expansão de células de medula óssea em condições livres de aderência, diferenciação de macrófagos pode ser prolongada e monócitos indiferenciadas podem acumular. Diferenciação de macrófagos indica contaminação; no entanto, due a sua natureza adesiva, mesmo em superfícies de cultivo ultra-baixo de fixação, que pode ser facilmente descartada, enquanto apenas colhendo as células não adesivas de cultura. Em experiências anteriores 1,3, a contaminação por macrófagos não levou a sérios efeitos colaterais clínicos. Processamento histológico de órgãos e músculos de ratos após o transplante de células mostraram que os macrófagos injetados assimilado em órgãos como baço, fígado e pulmão. A assimilação de macrófagos nesses órgãos não demonstrou efeitos clínicos observáveis ​​em camundongos. O mecanismo molecular desencadeada por esses macrófagos podem ser questões interessantes para futuras investigações.

Os monócitos, assim como macrófagos afectar arteriogénese em doença arterial periférica, em especial quando aplicados sistemicamente. Efeitos secundários clínicos, tais como a embolia ou inflamação sistémica maciça não podia ser observada mesmo após a injecção de mais de 2,5 milhões de monócitos, mas estas células podem provocar inflamação e pocialmente causar efeitos colaterais sistêmicos severos. Em testes em humanos, estes efeitos são susceptíveis de ter significado clínico. O desencadeamento da arteriogênese pode afetar o crescimento do tumor ou retinopatia diabética, e tais efeitos sistémicos possíveis de soluções de células injetadas devem ser exploradas em estudos futuros.

Publicações anteriores 9 descrever diferenças entre as características dos monócitos periféricos análises ao sangue e de osso derivadas de medula, que explicam porque as propriedades de monócitos a partir de medula óssea podem diferir daqueles isolado a partir de células do sangue periférico.

O método de isolamento é de interesse clínico bem. Desenho do sangue em vez de extrair medula óssea humana é mais prático no contexto da medicina clínica. É importante cuidar do bem-estar dos animais e aplicar analgesia, se necessário. Para injecções intravenosas, é crítico para a prática de manuseamento tanto do animal e da seringa ao mesmo tempo. Se um único animal está passando por múltiplas injecções, a qualidade das veias e da pele da cauda sofrer.

Apesar destas desvantagens, este método é muito útil para estudar o comportamento e as características dos monócitos. As experiências no domínio da aterosclerose, inflamação ou imunologia podem beneficiar deste método. Apenas 30 min são necessárias a partir da extração de medula óssea para a semeadura de células em placas de superfície ultra-low-fixação de 6 poços. Preocupações de ordem ética são minimizados, porque o elevado rendimento deste protocolo minimiza o número de animais necessários, como dadores de células. Este novo método será útil para muitos estudos envolvendo monócitos.

Temos sido focada no aumento terapêutico de crescimento de vasos colaterais via transplante de monócitos. A natureza multifatorial desse processo pode explicar por que um único fator abordagens para resultados mistos aumento de arteriogênese geraram 13,14. Isto levou ao emvestigação de terapias à base de células. Estaminais e células progenitoras derivadas de medula óssea autólogo têm sido identificados como potenciais células para transplante, mas apenas benefícios clínicos moderados foram relatados 15. Além da pesquisa sobre dosagem, métodos de isolamento, e as vias de administração, mais pesquisas ainda são necessárias para determinar o tipo de célula ideal. Uma desvantagem de transplante autólogo de células poderia ser a sua incapacidade de activar a resposta imune inata e / ou de adaptação, e ambos são críticos para a arteriogénese. O aumento da inflamação local pode representar o melhor estímulo para arteriogênese 16.

A injecção intravenosa de monócitos é um método comum para transplante de células dentro de modelos do rato se a entrega da droga sistémica é desejada. Devido aos efeitos sistémicos, podem ocorrer efeitos secundários, bem. Certifique-se de que a veia é alvo de injeção. É comum confundir-se artérias e veias, especialmente quando injetáveis ​​mic fortemente pigmentadose. Injeção arterial pode causar embolia, que levam a problemas sistêmicos em circulação.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

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References

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