Bioengineering

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Summary

갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole 및 유리 염기 유사체 마이크로 낮은 세포 독성을 나타낸다. 이 원고는 corroles에 의해 전사 억제를 평가하기 위해, UV-마주 분광와 RNA 전사 반응, 에티 디움 브로마이드 묻은 젤 이미징 RNA 및 정량화 RNA를 설명하고 항암 후보 속성을 평가하는 간단한 방법을 보여줍니다.

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Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

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Abstract

화학 요법은 종종 많은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함한다. Corroles은 금속 킬레이트 관능기의 신원에 따라 특정 세포주에서 세포 증식 및 세포 독성 차동 특성을 나타낼 tetrapyrrolic 거대 고리의 클래스이다. 특정 세포 라인으로 작용 corroles의 고유 한 동작은 대상 화학 요법의 가능성을 소개합니다.

많은 항암제 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 여기에서 우리는 알려진 잠재적 인 억제제의 존재에 RNA 전사를위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 겔 전기 영동 및 UV-비스 분광법 전사 RNA 반응 생성물의 평가는 이들의 작용 메카니즘에 대한 자세한 분석에 대한 수정과, 잠재적 항암제 후보 방청 특성에 대한 정보를 제공한다.

작은corrole 세포 독성의 작용 기작에 대한 알려져있다. 갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) :이 실험에서, 우리는 두 corrole 화합물을 고려하십시오. RNA 전사 분석법 corroles 방청의 특성을 조사하는데 사용되었다. 다섯 전사 반응을 제조 하였다 : 각각 0.01,의 [템플릿 DNA베이스] 비, 및 치료를받지 않은 : [복잡한]에서 티노 마이신 D, triptolide, 조지아 (tpfc), tpfc 치료 DNA.

전사 반응은 아가로 오스 겔 전기 영동 및 비스 - UV 분광법을 사용하여 4 시간 후에 분석 하였다. 조지아 (tpfc), 티노 마이신 D, 및 triptolide에 의한 명확한 억제가 있습니다.

이 RNA 전사 분석법 또는 공단과 DNA 폴리머 라제 또는 잠복기에 의해 항암제 복합체, DNA, 또는 중합 효소의 농도를 변화시킴으로써, 더욱 상세 기작을 제공하도록 변형 될 수있다이전에 RNA 전사에 XES; 이러한 수정 또는 DNA를 포함하는 효소 억제기구를 구별한다. RNA 전사가 단지이 저하 여부를 테스트 또는 RNA를 가수 분해하는 데 사용할 수 있습니다 후 복잡한 추가. 이 분석은 또한 추가적인 항암 후보를 연구하는데 이용 될 수있다.

Introduction

화학 요법은 종종 바람직하지 않은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함, 아직 암 생물학의 더 큰 이해와 높은 암을 대상으로 효능과 부작용이 거의 항암제에 대한 수요는 계속 증가하고있다. 인간의 암 세포는 자주가 생존 한 활성화되거나 과발현되는 암 유전자에 의존. 따라서이 많은 항암제는 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 이러한 변형 유전자의 발현을 차단 치료는 암세포를 효과적으로 제거하고 세포 사멸과 리드. 정상 세포에 대응하는 것보다 3 형질 전환 된 세포는 RNA 전사의 중단에 더 민감하다. 선택적으로 억제 할 것으로 예상된다 전사를 억제하는 4 항암제 암 세포가 생존에 필요한 암 유전자의 발현. (5) 따라서, RNA 전사 전nhibition 잠재적 인 항암제 후보를 식별하고 이들의 작용 메커니즘에 대한 자세한 내용을 배울 수있는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 조지아 (tpfc)는 화학 요법 약물 티노 마이신 D 및 triptolide와 같은 순서에 RNA의 전사를 억제하는 것을 보여줍니다; 유사한 비교는 다른 항암제 후보 물질이 프로토콜을 이용하여 제조 될 수있다. 악 티노 마이신 D 일반적 임신성 융모 암, 고환암, Wilm의 종양, rhabdomyosacoma 치료에 사용 RNA 전사 억제제이며, 유잉 육종 6. 이 제 1964.Triptolide에 FDA에 의해 시험 관내에서 30 년 동안 다양 담암 동물 모델에서 연구되어왔다 선택적 전사 억제제 인 승인 된 이후 티노 마이신 D는 50여 년간 암 치료에 이용되고있다. (7)

corroles의 양친 거대 고리 성격은 작은 분자 나 생물학적으로 다른 약 종류에 비해 상당한 장점을 부여S. 8-14 마크로 문자 같은 큰 분자 예상보다 큰 셀룰러 투과성을 허용하고, 이들이 단백질의 것과 같은 거대 분자의 표면과 상호 작용하기에 충분히 크다. 8 Corroles 생체 분자와 엄격한 비공유 복합체를 형성하는 것으로 알려져있다 약물. corrole 워크의 고유 독성 외에도 10, 우리는 보여준 화학 요법 제를위한 담체 분자, 특히 DNA 인터 - 안트라 사이클린 약물 독소루비신 폰화 corrole 작용있다. 폰화 corrole가 독소루비신와 공동 투여되었을 때, 독소루비신의 IC (50)의 3 배 향상은 DU-145 세포에 대해 관찰 하였다.도 9 corrole 구조가 안정하고, 관능 때 고유 흡광도 변화를 겪는다 고유 흡광도 및 형광 특성을 갖는다 그는 특성에 사용할 수 있습니다. 비계의 10 기능화는 본질적으로 affec하지 않습니다선택적으로 실질적으로 생물학적 속성을 변경할 수 있습니다 corrole의 틀을 수정, 술 폰화 corrole으로 볼 때, corrole, 9-15의 광 물리 특성을 t하지만. (16) 우리는 이전에 일곱 사람의 암 세포주에 대한 여섯 metallocorroles을 평가 하였다. 결과는 인간의 암세포 독성을 향해 특정 금속 이온뿐만 아니라 관능기 교체에 의존하는 것을 나타낸다. 예를 들면, 설 폰화 갈륨 corroles 높은 세포 흡수를 경험 뇌 전이성 전립선 암 세포 (DU-145)의 핵으로 선택적으로 침투; 보다 그것이 다른 세포주의 핵 내로 침투하지 않더라도, 동일한 corrole는 유방암에 대한 더 큰 세포 독성을 나타낸다 (MDA-MB-231), 흑색 종 (SK-MEL-28), 난소 (OVCAR-3) 암세포 전립선 암. 9

초기 세포 기반 분석은 이들 화합물은 항암 치료제, 푸르트 장점으로 약속을 보여 나타냅니다작용 기전에 어 조사. 전사 억제는 특정 유기 금속 착물 17 ~ 27 관찰 그리고 우리는 corrole 가족의 세포 독성 행동에 대한 가능한 메커니즘으로이 과정을 검토하고자한다. 이 전사 분석은 살아있는 세포에서 이러한 분자의 효과에 대한 자세한 정보는 이어질 것 전사 억제를 평가하기위한, 간단 저렴하고 손쉬운 방법을 제공한다.

여기에, 갈륨의 전사 억제는 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (그림 1) 테스트됩니다. 일부 전이 금속 착물과 달리, 갈륨 (III) 산화 환원 비활성이므로 직접 산화 환원 계 대사 경로의 산화 환원 과정에 참여하지 않는다. (28)에 관계없이, 갈륨 (III) 세포 독성 특성을 나타내지 않으며, 치료 목적을 위해 연구되어왔다. 갈륨은 백금 후 항암 치료제에 대한 두 번째 가장 유망한 금속 많은 연구와 조사를 겪고있다; 질산과 염화 갈륨 염은 간암, 림프종, 방광암 및 기타 질병에 대한 임상 시험에서 평가되었다. 29 ~ 34 절은 갈륨 (III)이 항암 corrole 연구에 따라서 이상적입니다. 초기 데이터는 (도 2 참조)의 Ga (tpfc) 및 tpfc이 다양한 암 세포주 낮은 GI (50)의 최대 세포 증식을 50 % 억제하는데 필요한 약물 농도를 보여준다; 이것은 그들의 방청 특성을 결정하기 위해 이들 두 화합물에 대한 상기 실험의 유효성을 확증한다. 우리는 일반적인 항암제 티노 마이신 D 및 triptolide 이러한 화합물을 비교합니다. 악 티노 마이신 D하게 인터는 DNA, RNA 신장을 억제하고, 피코 몰 농도에서 특정 세포주에서 세포 자멸사를 유도 6,35-37 Triptolide가 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다.; 그것은 인간의 XPB / ERCC3, 서브 유닛 O를 결합F 전사 인자 TFIIH, RNA 중합 효소 II 활동의 저해로 이어지는. 6-7,38-40

그것은 일반적 corroles 세포 독성 특성을 보일 것으로 알려져 있지만, 작용으로부터 발생하는 다양한 메커니즘에 대한 약간의 정보가 존재한다. RNA 전사의 Corrole 억제는 생체 거대 분자와의 상호 작용에 더 큰 통찰력을 제공합니다. 같은 다이 로듐 등의 DNA에 결합하는 것으로 알려져 다른 단지, (II, II) 단지, 크롬 (III) 단지, 루테늄 (II) 폴리 피리 단지, 로듐 (III) 단지, 기타 다양한 분야, 18-, RNA 전사 분석을 실시 하였다 27 생체 거대 분자와의 상호 작용에 대한 이해의 결과. 이 손쉬운하고 널리 사용되는 실험은 주어진 분자의 세포 독성 특성을 평가하고 있는지 그 장점을 더 생물학적 테스트를 결정하는 좋은 초기 테스트입니다. RNA 전사 분석은 또한 varyin 많은 수정 가능g 사용되는 화합물 또는 효소의 양; 잠복기, 반응 시간 및 샘플 시점을 변화; 따라서 잠재적으로 많은 양의 데이터를 제공하고, 관심있는 다른 변수 중 DNA 템플릿 길이 및 서열을 변화. 구성 요소를 구입하고 개별적으로 제조 될 수 있지만이 전사 분석도 제공 필요한 모든 반응 구성 요소와 저렴한 키트로 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 실험에서는, 높은 수율을 갖는 것으로 알려져 시판 키트를 사용한다. (41)

아가로 오스 겔 전기 영동 및 UV-마주 분광 : 전사 억제를 평가하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 사용합니다. 아가 로스 겔 전기 영동 분리, 식별하고, 정화 0.5 25 kb의 DNA 및 RNA 단편에 대한 간단하고 효과적인 방법이다. UV-42 비스 분광법 RNA의 농도 및 순도를 결정하기 위해 사용될 수있다. (43)

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Protocol

참고 : RNA로 작업 할 때 DNA 및 RNA를 저하의 DNase와의 RNase 효소에 의한 오염을 방지하기 위해 깨끗한 작업 환경을 유지한다. 그 피펫 팁 및 튜브의 DNase와의 RNase 무료로 확인합니다. 여기에는 오염 제거 솔루션 등을 피펫, 튜브 홀더, 같은 실험실 표면과 장비를 닦아하는 것이 도움이된다.

Corrole 치료 1. RNA 전사

  1. corrole을 준비하고 0.01 화합물 억제제 : [DNA] : [복잡한] 1 몰비.
    주 : 0.43 pmol의 DNA를 사용 DNA 템플릿에서 E. LIGA 유전자 APET-28C 벡터이었다 : 우리의 경우, 비율은 4.3 fmol 복합체이었다 T7 프로모터의 제어하에 대장균. T7 프로모터와 다른 DNA는 또한 전사 분석을 실행하기위한 유효한 후보들이다.
    1. 티노 마이신 D, 깨끗하고, 별도의 용기에 triptolide, tpfc, 디메틸 설폭 사이드에서 조지아 (tpfc) (DMSO)에 용해. [C의 몰비가 1 : 0.01의 최종 농도를 얻omplex] : 뉴 클레아없는 물과 희석액을 사용하여 [DNA].
      1. 1.8 ml의 DMSO에 1 mg의 티노 마이신 D 녹인다. 나누어지는 10 별도의 용기에 μL와는 1/100 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석.
        주 : 티노 마이신 D의 용액의 최종 농도는 4.3 fmol이다.
      2. 0.64 ml의 DMSO에 1 mg을 triptolide을 녹여. 나누어지는 1 별도의 용기에 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 제 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석.
        참고 : triptolide의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다.
      3. 2.9 ml의 DMSO에 1 mg을 tpfc을 녹여. 10 μL 별도의 용기와 뉴 클레아없는 물 1까지 희석 나누어은 1/100 D를 생성하는ilution. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석.
        참고 : tpfc의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다.
      4. 2.6 ml의 DMSO에 1 mg의 가인 (tpfc)을 녹여. 나누어지는 10 별도의 용기에 μL와는 1/100 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석.
        참고 : 조지아 (tpfc)의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다.
        참고 :이 co​​rroles 및 억제제는 물에 용해되지 않고 DMSO에 미리 용해해야합니다. (1 % 이하) DMSO 소량의 세포 (게시되지 않은 데이터)에서 세포 독성을 유발하지 말 것.
  2. 이전 전사 반응을 시작으로, 개별적으로 필요한 시약을 준비하거나 상용 공급 업체를 구입할 수 있습니다.
    1. 얼음 모든 동결에 해동n 개의 시약 (냉동 시약의 목록은 표 1 참조).
    2. 그들이 완전히 용액에 용해 될 때까지 혼합 10 배 반응 버퍼 및 4 리보 뉴클레오티드 (ATP, CTP, GTP 및 UTP) 솔루션 시간을 허용합니다.
    3. 간단히 튜브의 테두리에 물질의 손실을 방지하기 위해 모든 시약을 원심 분리기. RT에서 10 배 반응 버퍼를 유지하면서 얼음에 일단 저장 리보 뉴클레오티드를 해동.
    4. RT에서 전사 반응 용 시약 수확기 (시약의 목록은 표 2 참조).
      주 : 상기 반응을 얼음보다는 RT에서 조립되는 경우 10 배 반응 완충액 스퍼는 템플릿 DNA 공 침물을 할 수있다.
    5. 튜브를 튕기거나 위 아래로 부드럽게 혼합물을 피펫 팅에 의해 철저하게 섞는다. 혼합 한 후, 원심 간단히 튜브의 하단에 반응 혼합물을 수집한다.
    6. 2-4 시간의 합계 37 ℃에서 반응 혼합물을 배양한다.
      참고 : 필요한 반응 시간이 달라집니다DNA 템플릿 크기와 순서에. 이 단계는 특정 순서에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 짧은 템플릿은 총 RNA의 높은 수율에 대한 이상 반응 시간을 필요로 할 수있다.
    7. -20 ° C에서 각각의 시간 및 저장 후 각 반응에서 4 μL 씩을 제거합니다. 원하는 시점들에 대해 필요에 따라 수정합니다.

2. RNA 스핀 열

  1. 전사 반응 후, 마이크로 원심 호환 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여 RNA를 정제.
    주 :. RNA 스핀 컬럼의 사용은 80 % 이상 회복에 20 개 이상의 염기 결과와 RNA를 정제 44
    참고 : 컬럼 크로마토 그래피는 RNA를 정화하는 일반적이고 편리한 방법입니다. 클로로포름 추출, 이소프로판올 침전뿐만 아니라 다른 시판 키트 : 다른 정제 방법은 또한, 염화 리튬의 석출, 페놀로서 존재한다.
    1. 균등 격렬 반전시킴으로써 열 버퍼에 세파 덱스 행렬을 재현 탁열 세 번 이상. 급격하게 열을 쓸어 넘겨이 작업을 수행합니다.
    2. 열에서 상단 캡을 제거합니다. 캡의 일부 잔여 세파 덱스 매트릭스가있을 것이다; 캡 매트릭스 충전되면 열의 상 캡을 교체 행렬의 대부분이 열에 때까지 이전 단계를 반복한다.
    3. 컬럼의 하단 끝을 스냅.
      참고 : 일부 액체는 컬럼에서 탈출 할 수 있습니다.
    4. 열을 포장합니다.
      1. 멸균 (의 RNase와 DNase의 자유)를 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 열을 놓습니다.
      2. 1 분 동안 1,000 XG에서 탁상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기.
    5. 컬럼에서 용출 버퍼와 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 폐기하십시오.
    6. 즉시 새로운 살균 된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 열을 배치하고 열 베드의 중심 샘플 피펫. 열 과부하를 방지하기 위해 샘플의 20 ~ 50 μl를 사용합니다.
    7. 1000 XG에서 탁상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기1 분.
      참고 : 리제 정제 된 RNA 샘플입니다.

아가 로스 겔 전기 영동 (3) (1 % 아가로 스겔) 42

주 : 티듐 브로마이드 DNA 및 RNA에 결합하는 형광에 따라서 이러한 생체 분자는 0.5 ㎍ / ㎖의에 티듐 브로마이드 수용액으로 이들을 배양하여 UV 광으로 가시화 될 수있다.

  1. 물 5 ㎎ 티듐 브로마이드 10 ml에 용해시켜 티듐 브로마이드 (0.5 ㎎ / ㎖)의 1000 배 스톡 용액을 준비한다.
  2. 겔 전기 영동에 대한 트리스 아세테이트 EDTA (TAE) 실행 버퍼를 준비합니다. 50 배 TAE 버퍼가 2.0 M 트리스 - 아세테이트 0.05 M 에틸렌 디아민 산 (EDTA)와 결합하고 8.5로 pH를 조절할 수 있도록합니다.
  3. 버퍼 1 L에 1X TAE 아가로 오스 10g을 초순수에 용해하고, 종래의 전자 레인지 아가를 용융하여 1 % (중량 / 부피) 아가로 오스 겔을 준비한다. 이를 50 ° C로 냉각되면, 1 % 아가 로스 겔 솔루로 1000 배에 티듐 브로마이드 용액 1ml를 첨가하여기, 부드럽게 소용돌이에 의해 밀폐 된 용기에 반전 혼합 한 후 겔 캐스팅 플랫폼에 아가로 오스 솔루션을 부어 젤 실온에서 응고 할 수 있습니다.
    참고 : 에티 디움 브로마이드 돌연변이 잠재적 인 발암 물질이다. 장갑을 착용하고 조심스럽게 솔루션을 처리합니다. 에티 디움 브로마이드의 적절한 처리 절차 내용은 다음을 참조하십시오 http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667을 .
  4. 겔 고화 후, 전기 영동 탱크 세트 겔을 배치. 우물이 침수 될 때까지 젤을 충당하기에 충분한 TAE 버퍼를 추가합니다. TAE 버퍼의 레벨이 약 1mm 겔의 수준 이상 있는지 확인합니다. 겔 빗를 제거합니다.
    참고 : 우물 침수 후 빗 제거는 우물에 갇혀되는 공기 주머니를 방지 할 수 있습니다.
  5. RNA 샘플을 준비합니다. 1 μL 젤 로딩 버퍼 각 정제 샘플 나누어지는 1 μl를 결합 (또는 1 ㎕의 10 배 로딩 버퍼와 dilut와에드 뉴 클레아없는 물 10 μL)과에 마이크로 피펫과 피펫 팅에 의해 아래로 완전히 혼합.
    참고 : 10 배 로딩 버퍼는 20 % 피콜 (400), 0.1 M 나 2 EDTA, pH가 8.0, 1.0 % SDS, 푸른 0.25 % 브로 모 페놀이 포함되어 있습니다. 이 브로 모 페놀 블루만큼 빠르게 ~ 50 %를 실행하며 매우 긴 실행을 모니터링하는 데 유용 할 수 0.25 % 크실렌 cyanol 또한, 로딩 완충액에 첨가 할 수있다. (42)
  6. 신중하게 잘 각각의 바닥에 솔루션을 피펫 팅하여 각 샘플 젤을로드합니다. 공기 방울을 떠나거나 우물 사이에 샘플을 혼합하지 않도록주의하십시오.
    주 : RNA 래더도 사체의 크기를 결정하는데 사용될 수있다.
  7. DNA는 양극 도선을 향해 젤로 마이그레이션 할 수 있도록 리드를 연결합니다. 원하는 수준으로 일반적으로 1 V 10 / 젤 cm를 전압을 설정합니다. 그러나 오랫동안 겔 분리의 진행을 모니터하기 위해 염료를 이용하여 이주 RNA 단편 사이에 상당한 간격, 실행을 위해 충분하다.
    NOTE : 150 V에서 약 20 분 소요됩니다 8cm가 X 8cm 젤 동안 250 V에서 23cm X 25cm 젤, 약 1 시간이 소요됩니다. 더 높은 전압에서 실행할 때 작은 RNA 조각이 더 나은 해상도를 가지고있다.
  8. 로딩 버퍼에서 염료가 RNA 조각 사이의 분리를위한 충분한 판단의 거리를 마이그레이션 한 경우에는 전원 공급 장치를 끕니다.
  9. 에티 디움 브로마이드 UV 빛 아래 RNA는 형광 것 이미지.
  10. 이미지의 사진을 촬영하고 각 조건에서 정제 된 RNA의 형광 강도를 비교합니다.

UV-마주 분광학을 통해 4. RNA 정량

  1. NanoDrop 2000, 또는 유사한 시스템에 2 μL의 H 2 O를 놓고 빈을 측정한다.
  2. 다음에, 분광 광도계에, 정제 다음 각 RNA 샘플 2 μL를 넣고 800 내지 200 nm의 파장 범위에서 UV-비스 측정한다.
    참고 : 1.0 (260) 독서는 RNA의 약 40 μg의 / ㎖로 동일합니다,순수 RNA는 260 / 2.1 280 비율을 가지고있다. (45)
  3. 경우에서 흡광도 OD보다 하나 적은 수득 클레아없는 물 샘플을 희석 한 OD 이상이다.
  4. 다양한 샘플을 플롯 260 nm에서 OD를 비교하는 그래프 소프트웨어를 사용합니다.

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Representative Results

아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 평가 RNA 전사 질적

아가 로스 겔 전기 영동 화상에 전사 된 RNA를 사용한다. 에티 디움 브로마이드 RNA의 46 수 있도록 영상 (λ 안에 605 nm의, λ = 210 nm의, 285 nm의 =) 바인딩에 형광. 젤 어두운 밴드는 RNA의 높은 농도에 해당합니다. 티노 마이신 D는, triptolide, 또는 하나 corrole 복잡한 RNA의 전사를 억제하면, RNA의 생산은 감소하고 밴드는 밝게 나타납니다. 이러한 개념을 사용하여, 상대적인 억제는 평가 될 수있다.

0.01 [주형 DNA 염기] 비율도 3은 [복합체] 위치에 RNA 전사 반응없이 복잡 티노 마이신 D, triptolide, tpfc 또는 조지아 (tpfc)로 전처리의 에티 디움 브로마이드 염색 아가 로스 겔 (1 %)을 나타낸다 1. 예상대로 티노 마이신 D와 triptolide은 대조군에 비하여 RNA의 명확한 감소를 보여이러한 장기 연구 억제제. tpfc 밴드가 더 작은 억제를 도시하고, 제어와 동일한 상대 강도를 나타내는 동안의 Ga (tpfc) 대역은 또한, RNA의 매우 낮은 레벨을 갖는다.

RNA 전사는 UV-마주 분광학에 의해 정량화

UV-비스 측정은 4 시간 동안 RNA 전사를받은 후, 각 샘플에 대해 취하고 RNA 스핀 컬럼 크로마토 그래피로 정제 하였다. 파장 350 nm의 스펙트럼을 220nm가 λ 최대는 흡수 RNA에 대응하는 260 nm에서 발생하여,도 4에 도시되고, 0.025 (㎍ / ㎖)의 흡광 계수 -1 cm -1. 260 nm에서 280 nm에서 흡광도가 1.0 (260) 읽기 RNA의 약 40 ㎍ / ml의 동일합니다. 표 3에보고하고, 순수한 RNA를 정량적으로 계산을 허용, 260 / 2.1 280 비율이 있습니다 트랜스 동안 생성 된 RNA를 매개 반응 및 RNA 스핀 컬럼을 사용하여 후 RNA의 순도의 평가. 네 억제제 처리 전사 반응의 44 세 0.07 배의 RNA를 전사의 Ga (tpfc) 처리 된 DNA와, 제어보다 작은 RNA를 수득 처리되지 않은 DNA로. tpfc 처리 된 DNA는 명백한 억제를 보이지 않았다. 모든 샘플은 비교적 순수한 샘플을 나타내는 약 2.2의 260 / 280 비율을 가지고있다. RNA 스핀 컬럼에 의해 정제하여 짧은 RNA가 20 개 이하의 뉴클레오티드 가닥 제거합니다. 잔류 DNA 또는 20 개 뉴클레오티드 이상 가닥 정제 간주되는 시료에 존재할 수있다. 이러한 약간의 불순물은 2.1보다 약간 큰 260 / 280의 비율을 초래할 것입니다.

그림 1
(III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (t 갈륨 그림 1. 분자 구조PFC))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 세포 독성 곡선과 GI 전립선 corroles의 50 값 (DU-145) (회색), 유방암 (MDA-MB-231) (파란색), 피부 (SK-MEL-28) (오렌지), 난소 (OVCAR -3) (녹색) 암 세포주. 세포를 (A)의 Ga (tpfc)과 이용 가능성의 측정 하였다 (B) tpfc 함께 배양 하였다 제조사의 프로토콜에 따라 색채 세포 생존 분석을 MTS를 기반. 여기를 클릭하세요 이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다그림.

그림 3
배양 4 시간 후에 전사 반응의도 3에 티듐 브로마이드 염색 아가 로스 겔 (1 %). 레인 1은 표준으로 1,000 염기쌍의 DNA 사다리입니다. 상기 제어부 (레인 2), 액 티노 마이신 D (레인 3) : 레인 2-6 0.43 pmol의 DNA로부터 전사 된 각 억제제 4.3 fmol 처리 RNA (0.01 여기서 주형 DNA 염기] 비 [복합체]) 보여 triptolide (레인 4), tpfc (레인 5), 및 조지아 (tpfc) (레인 6).

그림 4
1 그림 4. UV-마주 스펙트럼 :. 배양 후 4 시간에서 전사 RNA의 200 희석 전사 반응에 대한 DNA 템플릿은 더 복잡한 처리, 또는 티노 마이신 D, triptolide, tpfc, 또는 조지아 (tpfc)에서 함께했다 [복합체] : [주형 DNA 염기] 비 0.01 : 1. RNA 농도는 260 nm에서 OD에 의해 측정된다.

얼음에 냉동 시약을 해동 :
아데노신 트리 포스페이트, 구아노 신 삼인산, 시티 딘 트리 포스페이트, 및 우리 딘 삼인산의 75 mM의 솔루션 (ATP, CTP, GTP, UTP)
클레아없는 물
10 배의 반응 완충액 (1X 반응 완충액 : 40 mM 트리스 - 염산, 6 mM의의 MgCl 2, 2 밀리미터 페르미 딘, 10 mM의 디티 오 트레이 톨, 7.9의 pH)
선형화 된 주형 DNA (0.5 ㎍ / ㎖, 1.85 KB)
RNA 중합 효소 (20 U / μL)

냉동 시약의 표 1. 목록.

전사 반응을 시작하려면, 0.2 ml의 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에 각 시약의 다음과 같은 금액을 추가 :
2 μLATP 용액 (75 mM)을
2 μL의 CTP 용액 (75 mM의)
2 μL의 GTP 용액 (75 mM의)
2 μL의 UTP 용액 (75 mM의)
1 μL 뉴 클레아없는 물
2 μL 10 배 반응 버퍼
0.5 ㎍ / ㎕의 선형 주형 DNA의 2 μL
5 μL 복잡한 (같은 핵없는 물 빈, D, triptolide, tpfc 티노 마이신, 조지아 (tpfc))
2 μL RNA 중합 효소 (20 U / μL)

전사 반응 시약의 표 2. 목록.

시간 포인트 (시간) 복잡한 (260) 280 <> / 강해 (260) / (280) 희석 요인 [RNA] : (260)
(㎍ / ㎖)
[RNA (㎎ / ㎖)
4 제어 7.583 3.516 2.16 (200) (40) 60.67
4 티노 마이신 D 0.955 0.438 2.18 (200) (40) 7.638
4 triptolide 1.794 0.816 2.2 (200) (40) 14.35
4 tpfc 7.858 3.631 2.16 (200) (40) 62.87
4 조지아 (tpfc) 0.554 0.232 2.39 (200) (40) 4.434

표 3. 농도 및 전사 된 RNA의 순도 4 시간이 UV-마주 분광학에 의해 측정 후에는. 단일 가닥 RNA의 흡광 계수는 (㎍ / ㎖)을 0.025 -1 cm -1, 1.0 (260) 독서는 약에 해당 40 ㎍ / RNA ml의 순수한 RNA는 260 / 2.1 280 비율이있다. (45)

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Discussion

상기 분석의 Ga (tpfc)의 첨가는 공지 된 DNA 결합 항암제 복합체 티노 마이신 D와 대등 triptolide RNA의 전사를 억제하는 것을 보여준다. 조지아 (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 μM)의 세포 독성 동작은 방청 특성으로 인해 수 있습니다. 어떠한 전사 억제가 관찰되지 tpfc 이래 tpfc의 세포 독성은 RNA 전사 억제에 의한 것이 아니라 아직 조사되지 않은 다른 수단에 의해 발생된다.

수행 네 전사 반응에, DNA는에서 티노 마이신 D, triptolide, tpfc 또는 조지아 (tpfc)으로 처리 하였다 [착체] : [주형 DNA 염기]을 각각 0.01, 또는 처리되지 않은 대조군의 비율. 전사 반응 시약을 혼합하고, 전사 반응은 37 ℃에서 4 시간 동안 진행시켰다. 전사 RNA는 RNA 스핀 열 및 UV-VI와 겔 전기 영동에 의해 분석 수율을 통해 정제 하였다. 전사 억제의 성격이 작고에 할 수있다그녀는 다양한 변형이 동일한 기술을 사용하여 조사, 또는 화합물은 시험 관내생체 내 연구에서 대체 실시 할 수있다. 억제의 분자 특성을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다 추​​가 실험이 가능 corrole-DNA 부가 물 또는 전사 반응의 전산 모델링의 X 선 결정학을 포함한다. 이 실험의 목적은 화합물들의 항암 특성에 대한 정보를 수집하기 위해 전사를 억제 여부를 결정하는 것이었다. 그 목적은 달성되었다 : 조지아 (tpfc가) 명확 억제 및 장점 추가 연구를 전시하면서 tpfc는 더 억제를 나타내지 않았다.

RNA 전사 분석은 더욱 상세히 기전을 제공하도록 변형시킬 수있다. 전사 반응 후 항암제 (예를 들어, corrole 단지)의 추가는 단지이 저하 또는 RNA를 가수 분해 여부를 표시 할 수 있습니다 완료됩니다. 권장되는 다른 실험 수행한다RNA 중합 효소를 제외한 모든 구성 요소와 전사 반응 또는 DNA를 포함하는 효소 억제기구 간의 차별화를 허용하도록 낮은 10 배량 이용한다. 마지막으로, DNA 또는 복소 방청 자질 또는 DNA 중합 효소가 각각 결합에 관련되어 있는지 여부를 확인하는 복잡하고 증가 된 각 타겟 사이의 바인딩을 위해 허용하는 RNA 전사에 앞서 폴리머 라제 복합체와의 인큐베이션.

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Acknowledgments

우리는 진심 겔 전기 영동에 대한 도움말 박사 신디 N. 애기를 감사하고, DNA 및 제한 효소의 관대 한 기부 앤디 저우와 마이클 Grodick. 우리는 기꺼이 장비 및 재료에 관대 한 접근을 위해 교수 J. 히스 교수 D. 프로 버를 인정합니다. 우리는 도움이 제안 박사 깐 Sorasaenee 감사합니다. 우리는 비디오의 개략도에 사용 된 그림을 만드는 메리 H. 당나라 감사합니다. 자금은 존슨 앤 존슨 (Johnson & Johnson)과 USC Y86786에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

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References

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