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Bioengineering

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Summary

O gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e seu análogo freebase apresentam baixa citotoxicidade celular micromolar. Este manuscrito descreve uma reacção de transcrição de ARN, ARN de imagem com um gel corado com brometo de etídio, e quantificar RNA com espectroscopia de UV-Vis, a fim de avaliar a inibição da transcrição por corroles e demonstra um método simples de avaliar as propriedades anti-cancro candidatas.

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Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

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Abstract

A quimioterapia envolve frequentemente largo espectro de agentes citotóxicos com muitos efeitos secundários e direccionamento limitado. Corroles são uma classe de macrociclos tetrapirrólicos que exibem propriedades citostáticas e citotóxicas diferenciais em linhas de células específicas, dependendo das identidades dos metálico quelado e grupos funcionais. O comportamento única de corroles funcionalizados para linhagens celulares específicas introduz a possibilidade de quimioterapia alvejado.

Muitos medicamentos anti-cancerígenos são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo para transcrição de ARN na presença de inibidores conhecidos e potenciais. A avaliação dos produtos de ARN da reacção de transcrição por electroforese em gel e espectroscopia de UV-Vis fornece informações sobre as propriedades inibidoras de potenciais candidatos a fármacos anti-cancro e, com modificações para o ensaio, mais sobre o seu mecanismo de acção.

Poucoé conhecido sobre o mecanismo molecular de acção de citotoxicidade corrole. Neste experimento, consideramos dois compostos corrole: gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analógica freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Um ensaio de transcrição do RNA foi usado para examinar as propriedades inibidoras dos corroles. Cinco reacções de transcrição foram preparados: ADN tratado com actinomicina D, triptolido, Ga (tpfc), a uma tpfc [complexo]: [ADN molde de base] razão de 0,01, respectivamente, e um controlo não tratado.

As reacções de transcrição foram analisadas após 4 h utilizando electroforese em gel de agarose e a espectroscopia UV-Vis. Existe um claro inibição por Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide.

Este ensaio de transcrição de ARN pode ser modificado para proporcionar mais detalhe mecanicista, variando as concentrações do complexo anti-cancro, o ADN, ou uma enzima polimerase, ou por incubação da polimerase do ADN ou com o complexes antes da transcrição de ARN; estas modificações se diferenciar entre um mecanismo envolvendo a inibição do ADN ou a enzima. A adição do complexo após a transcrição do RNA pode ser utilizado para testar se os complexos de degradar ou hidrolisar o RNA. Este ensaio também pode ser usado para estudar candidatos anticancerígenos adicionais.

Introduction

A quimioterapia muitas vezes envolve amplo espectro agentes citotóxicos com efeitos colaterais indesejáveis ​​e segmentação limitado, mas com uma maior compreensão da biologia do câncer, há uma demanda cada vez maior por agentes anticancerígenos com maior eficácia a segmentação câncer e menos efeitos colaterais. 1 células cancerosas humanas tornam-se frequentemente dependente de um único oncogene activado ou super-expresso para a sobrevivência. 2 Assim, muitas drogas anti-cancro são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Os tratamentos que bloqueiam a expressão destes genes transformantes são eficazes na eliminação de células cancerosas e conduzir à morte celular. 3 As células transformadas são mais sensíveis às perturbações na transcrição de ARN que são células normais correspondentes. 4 fármacos anti-cancro que inibem a transcrição são esperados para inibem selectivamente a expressão de oncogenes que são necessários para a célula cancerosa para sobreviver. 5 Por conseguinte, a transcrição do RNA inhibition é uma maneira útil para identificar potenciais candidatos a medicamentos anticâncer e aprender mais sobre seu mecanismo de ação. Este protocolo demonstra que Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN na mesma ordem que as drogas quimioterápicas actinomicina D e triptólido; Comparações semelhantes podem ser feitas usando este protocolo com outros candidatos a fármacos anticâncer. Actinomicina D é um inibidor da transcrição RNA comumente usado para tratar câncer trofoblástica gestacional, câncer testicular, tumor de Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing do sarcoma 6. Actinomicina D tem sido utilizado em terapia de cancro para cerca de cinquenta anos desde que foi aprovado pela FDA em primeiro lugar em 1964.Triptolide é um inibidor selectivo de transcrição que tem sido investigado in vitro e em diversos modelos animais portadores de tumores de 30 anos. 7

A natureza macrocyclic amphiphilic de corroles confere vantagens significativas sobre outras classes de drogas, tais como moléculas pequenas ou biológicos. 8-14 O carácter macrocíclico permite a permeabilidade celular, que é maior do que o esperado para tais moléculas grandes, e que são suficientemente grandes para interagir com superfícies macromoleculares, tais como os de proteínas. Corroles 8 são conhecidas por formar complexos não covalentes apertadas com biomoléculas e drogas. 10 Além da citotoxicidade inerente do quadro corrole, nós demonstramos que a corrole sulfonados actua como uma molécula veículo para agentes quimioterapêuticos, especialmente a antraciclinas doxorubicina droga intercalante de ADN. Quando o corrole sulfonado foi co-administrado com a doxorrubicina, um aumento de 3 vezes na IC50 de doxorrubicina foi observado para células DU-145. 9 O quadro corrole é estável e tem de absorvância e fluorescência propriedades intrínsecas que, quando funcionalizado, se submetem a mudanças únicas de absorvância que podem ser utilizados para a caracterização. 10 Funcionalização de andaime não inerentemente affect as propriedades fotofísicas da corrole, 9-15, mas, como pode ser visto com um corrole sulfonado, modificando selectivamente a estrutura do corrole pode alterar substancialmente as suas propriedades biológicas. 16 já foi previamente avaliada seis metallocorroles contra sete linhas de células de cancro humano. Os resultados indicam que a toxicidade em relação às células cancerosas humanas é dependente do ião de metal específico, bem como a substituição do grupo funcional. Por exemplo, de gálio corroles sulfonados experimentado alta absorção celular e penetrou selectivamente para dentro do núcleo de células cerebrais de cancro da próstata metastizado (DU-145); células da mesma corrole, embora não penetre no núcleo de outras linhas de células, apresenta uma maior citotoxicidade da mama (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28), e do ovário (OVCAR-3) do cancro do que para cancro da próstata. 9

Os ensaios baseados em células iniciais indicam que estes compostos são promissores como agentes terapêuticos anti-cancro, que merece Further investigação sobre o mecanismo de acção. Inibição da transcrição é observado com certos complexos organometálicos 17-27 e procurou-se examinar este processo como um mecanismo possível para o comportamento citotóxico da família corrole. Este ensaio de transcrição proporciona um método simples, de baixo custo, e fácil para avaliar a inibição de transcrição, o que irá conduzir a uma informação mais detalhada acerca dos efeitos destas moléculas em células vivas.

Aqui, a inibição da transcrição de gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e o seu análogo de base livre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) são testados. Ao contrário de alguns complexos de metais de transição, gálio (III) é inactiva redox e, por conseguinte, não está directamente envolvido no processo redox de vias metabólicas à base de redox. 28 Independentemente, gálio (III) que apresentam propriedades citotóxicas e tem sido investigada para fins terapêuticos. Gálio é o segundo metal mais promissora para terapias anticâncer após platina e foi submetido a muitos estudos e investigações; sais de nitrato e cloreto de gálio foram avaliadas em ensaios clínicos contra hepatoma, linfomas, cânceres de bexiga, e outras doenças. 29-34 gálio (III) é, portanto, ideal para anticancerígenos estudos corrole. Os dados iniciais mostram Ga (tpfc) e tpfc têm baixa GI 50, a concentração de droga necessária para inibir 50% da proliferação celular máxima, com várias linhas celulares de cancro (ver Figura 2); este afirma a validade de novas experiências com estes dois compostos para determinar suas propriedades inibidoras. Nós comparar estes compostos com as drogas anticâncer comum Actinomicina D e triptólido. Actinomicina D intercala ADN, ARN inibe o alongamento, e induz a apoptose em certa linha de células em concentrações picomolares 6,35-37 Triptólido tem mostrado inibir o crescimento do tumor.; liga-se a XPB humano / ERCC3, uma subunidade ofactor de transcrição f TFIIH, levando à inibição da actividade de ARN-polimerase II. 6-7,38-40

Enquanto é vulgarmente conhecido que corroles apresentam propriedades citotóxicas, existe pouca informação sobre os diferentes mecanismos decorrentes de funcionalização. Inibição Corrole de RNA transcrição iria oferecer um maior conhecimento sobre suas interações com biomacromoléculas. Outros complexos conhecidos por se ligarem ao ADN, tais como dirhodium (II, II), complexos de crómio (III), complexos, de ruténio (II) polypyridyl, ródio (III), complexos, e vários outros, foram submetidas a ensaios de transcrição de ARN, 18- 27 resultando em uma maior compreensão de suas interações com biomacromoléculas. Esta experiência fácil e amplamente disponível é também um bom teste inicial para avaliar as propriedades de citotoxicidade de uma dada molécula e determinar se deveria ser mais testes biológicos. O ensaio também permite a transcrição do RNA para várias modificações, tais como varying, a quantidade de composto ou enzimas utilizada; variando o período de incubação, tempo de reacção e pontos de tempo de amostragem; e variando-se o comprimento e a sequência de DNA molde, entre outras variáveis ​​de interesse, assim, potencialmente oferecendo uma grande quantidade de dados. Este ensaio de transcrição também está prontamente disponível como kits preços acessíveis, com todos os componentes necessários, desde reação, embora os componentes podem ser comprados e preparados individualmente. Nestas experiências, podemos usar um kit disponível comercialmente conhecido por ter um rendimento elevado 41.

Para avaliar a inibição da transcrição, usamos dois métodos: eletroforese em gel de agarose e espectroscopia UV-Vis. Electroforese em gel de agarose é um método simples e eficaz para a separação, identificação e purificação de 0,5 a fragmentos de ADN e ARN de 25 kb. 42 espectroscopia UV-Vis pode ser utilizado para determinar a concentração e pureza do ARN. 43

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Protocol

NOTA: Quando se trabalha com RNA manter um ambiente de trabalho limpo para evitar a contaminação por DNase e RNase enzimas que degradam o DNA e RNA. Assegurar que as pontas de pipetas e tubos são DNase e RNase livre. Também é útil para limpar as superfícies de laboratório e equipamentos, tais como pipetas, suportes para tubos, etc., com uma solução de descontaminação.

Transcrição com ARN 1. Tratamento Corrole

  1. Prepare o corrole e os compostos inibidores de 0,01: 1 proporção molar de [complexo]: [ADN].
    NOTA: No nosso caso, a proporção foi de 4,3 complexo fmol: 0,43 pmol DNA, onde o modelo de DNA utilizado foi vector APET-28c com gene Liga de E. coli sob o controlo do promotor de T7. Outros ADN com o promotor T7 também são candidatos válidos para a execução do ensaio de transcrição.
    1. Dissolve-se Actinomicina D, triptolido, tpfc, e Ga (tpfc) em dimetil sulfóxido (DMSO) em recipientes limpos, separadas. Obter a concentração final de 0,01: 1 proporção molar de [complex]: [DNA] utilizando diluições em série com água livre de nuclease.
      1. Dissolve-se 1 mg de actinomicina D em 1,8 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição de 1/100. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000.
        NOTA: A concentração da solução final de actinomicina D é 4,3 fmol.
      2. Dissolve-se 1 mg de triptólido, em 0,64 ml de DMSO. Alíquota 1 ul a um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma segunda diluição 1 / 1.000.
        NOTA: A concentração da solução final é de 4,3 fmol de triptólido.
      3. Dissolve-se 1 mg tpfc em 2,9 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluídas para 1 ml com água isenta de nuclease para criar um 1/100 dilution. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000.
        NOTA: A concentração da solução final é de 4,3 fmol tpfc.
      4. Dissolve-se 1 mg de Ga (tpfc) em 2,6 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição de 1/100. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000.
        NOTA: A concentração da solução final de Ga (tpfc) é de 4,3 fmol.
        NOTA: Estes corroles e inibidores não são solúveis em água e devem ser pré-dissolvido em DMSO. Pequenas quantidades de DMSO (abaixo de 1%) não induzem citotoxicidade nas células (dados não publicados).
  2. Antes do início da reacção de transcrição, preparar os reagentes necessários individualmente ou adquiri-los a partir de um fornecedor comercial.
    1. Thaw no gelo congelou todosn reagentes (consulte a Tabela 1 para obter uma lista de reagentes congelados).
    2. Permitir que a 10x tampão de reacção e a 4 ribonucleótido (ATP, CTP, GTP, UTP) e soluções tempo a misturar até que eles estão completamente dissolvidos na solução.
    3. Resumidamente Centrifugar todos os reagentes para evitar a perda de material sobre o aro do tubo. Uma vez descongelado, ribonucleótidos armazenar em gelo, mantendo a 10x tampão de reacção à temperatura ambiente.
    4. Combine reagentes para a reação de transcrição na RT (consulte a Tabela 2 para obter uma lista de reagentes).
      NOTA: A espermidina na 10x tampão de reacção pode coprecipitado de DNA molde, se a reacção é montada sobre gelo, em vez de à temperatura ambiente.
    5. Misture bem sacudindo o tubo ou pipetar a mistura para cima e para baixo com cuidado. Depois de se misturar, brevemente centrífuga para recolher mistura de reacção no fundo do tubo.
    6. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante um total de 2-4 horas.
      NOTA: Os tempos de reação necessárias variarácom o tamanho do modelo de ADN e a sequência. Este passo pode requerer optimização para sequências específicas. Modelos mais curtos podem requerem tempos de reacção mais longos para um elevado rendimento de ARN total.
    7. Remover 4 mL alíquotas de cada reacção após cada hora e armazenar a -20 ° C. Modificar como necessário para timepoints desejados.

2. RNA spin Coluna

  1. A seguir à reacção de transcrição, purificar o ARN utilizando colunas de cromatografia de microcentrífuga-compatível.
    NOTA:. A utilização de colunas de RNA de rotação para purificar RNA com maior do que 20 bases originou uma recuperação superior a 80% 44
    NOTA: A cromatografia em coluna é um método comum e conveniente para purificar o ARN. Outros métodos de purificação também existir como precipitação Cloreto de lítio, extracção com fenol: clorofórmio, precipitação com isopropanol, bem como outros kits disponíveis comercialmente.
    1. Ressuspender uniformemente na matriz de Sephadex em tampão de coluna por vigorosamente invertendo ocoluna de três ou mais vezes. Faça isso por um movimento súbito da coluna acentuadamente.
    2. Remover o tampão de topo da coluna. Haverá alguma matriz de Sephadex residual na tampa; se a tampa é preenchido com a matriz, substituir a tampa na coluna e repetir o passo anterior até que a maioria da matriz é na coluna.
    3. E cortar a extremidade inferior da coluna.
      Nota: Alguns líquido pode escapar da coluna.
    4. Encher a coluna.
      1. Coloque coluna em uma estéril (RNase e DNase livre) tubo de 1,5 ml de microcentrífuga.
      2. Centrifuga-se o tubo numa centrifugadora de bancada a 1000 x g durante 1 min.
    5. Descartar o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampão de eluído a partir da coluna.
    6. Colocar imediatamente a coluna em um novo tubo de 1,5 mL de microcentrífuga estéril e pipetar a amostra para o centro do leito da coluna. Use 20-50 mL de amostra para evitar sobrecarregar a coluna.
    7. Centrifuga-se o tubo numa centrífuga de mesa a 1000 xgdurante 1 min.
      NOTA: O eluente é a amostra de RNA purificado.

3. Agarose Gel de Eletroforese (1% do gel de agarose) 42

NOTA: O brometo de etídio fluorescência após a ligação ao ADN e ARN, por conseguinte, estas biomoléculas pode ser visualizada com luz UV, incubando-as com 0,5 ug ml de brometo de etídio / solução.

  1. Prepara-se uma solução estoque de 1.000x brometo de etidio (0,5 mg / ml) por dissolução de 5 mg de brometo de etídio em 10 ml de água.
  2. Prepare Tris Acetato EDTA (TAE) tampão de corrida para eletroforese em gel. Para fazer um tampão TAE combinar 50x 2,0 M de Tris-acetato com 0,05 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ajustar o pH para 8,5.
  3. Prepara-se uma 1% (peso / volume) em gel de agarose por dissolução de 10 g de agarose UltraPure em 1 L de tampão 1x TAE e derretendo a agarose com um forno de microondas convencional. Uma vez arrefecida a 50 ° C, adiciona-se 1 ml de brometo de etídio a 1.000x a solu gel de agarose a 1%ção, misture agitando suavemente por inversão ou num recipiente fechado, em seguida, verter a solução de agarose num gel de plataforma de fundição e para permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente.
    NOTA: O brometo de etídio é um agente mutagênico e potencial cancerígeno. Usar luvas e lidar com soluções cuidadosamente. Para o manejo adequado de brometo de etídio, por favor consulte: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Depois que o gel tem solidificado, coloque o gel set no tanque de eletroforese. Adicionar tampão TAE suficiente para cobrir o gel até que os poços estão submersos. Verificar se o nível do tampão TAE cerca de 1 mm acima do nível do gel. Remover o pente de gel.
    Observação: remover o pente depois de poços estão submersos impede bolsas de ar fique preso nos poços.
  5. Preparar as amostras de ARN. Combine 1 ml de cada alíquota de amostra purificada com 1 ml Carregando Gel Buffer (ou com 1 ml de 10x tampão de carregamento e diluted para 10 mL com água livre de nuclease) e misture bem por pipetagem cima e para baixo com uma micropipeta.
    NOTA: tampão de carga 10x contém 20% de Ficoll 400, 0,1 M de Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% de azul de bromofenol. 0,25% de xileno cianol pode também ser adicionado ao tampão de carga, enquanto é executado ~ 50% mais rápido que o azul de bromofenol e pode ser útil para a monitorização muito longas. 42
  6. Carregar o gel com cada amostra, pipetando cuidadosamente a solução para o fundo de cada poço. Tome cuidado para não deixar as bolhas de ar ou misturar as amostras entre poços.
    NOTA: Uma escada de ARN também pode ser utilizado para determinar o tamanho do transcrito.
  7. Ligue os fios de modo a que o ADN vai migrar para o gel em direcção ao polo positivo. Ajustar a tensão até ao nível desejado, tipicamente de 1 a 10 V / cm do gel. Submeter o gel independentemente do tempo é suficiente para a separação significativa entre os fragmentos de ARN, utilizando a migração de corantes para monitorar o progresso da separação.
    NOTA: A 23 cm x 25 cm gel em 250 V levará aproximadamente 1 hora, enquanto um 8 cm x 8 cm gel em 150 V levará cerca de 20 min. Fragmentos de RNA mais pequenas têm uma melhor resolução quando executado em voltagens mais altas.
  8. Desligue a fonte de alimentação quando o corante do tampão de carregamento migrou uma distância considerados suficientes para a separação entre os fragmentos de RNA.
  9. Imagem do ARN sob luz UV como o brometo de etídio ficam fluorescentes.
  10. Tire uma foto da imagem e comparar intensidades de fluorescência do RNA purificado de cada condição.

4. RNA Quantificação via Espectroscopia UV-Vis

  1. Coloque 2 l H 2 O em uma NanoDrop 2000 ou máquina similar, e medir o Branco.
  2. Em seguida, colocar 2 ul de cada amostra de ARN, após purificação, no espectrofotómetro e medir UV-Vis a partir de uma gama de comprimentos de onda de 200 nm a 800 nm.
    NOTA: O 260 Uma leitura de 1,0 é equivalente a cerca de 40 ug / ml de ARN,e ARN puro tem um A 260 / A proporção de 2,1 280 45.
  3. No caso em que é absorvância superior a 1, OD, diluir as amostras em água isenta de nuclease para obter uma DO menor do que 1.
  4. Use software de gráficos para traçar as várias amostras e comparar OD a 260 nm.

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Representative Results

RNA Transcrição avaliados qualitativamente por Agarose Gel de Eletroforese

Electroforese em gel de agarose é utilizada para a imagem do ARN transcrito. O brometo de etídio fluorescência após ligação (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46, permitindo imagens de ARN. Faixas mais escuras no gel correspondem a maiores concentrações de ARN. Se a Actinomicina D, triptolido, ou qualquer complexo corrole inibe a transcrição de ARN, a produção de RNA é reduzida e a banda aparece mais leve. Utilizando este conceito, a inibição relativa pode ser avaliada.

A Figura 3 mostra o gel corado com brometo de etídio de agarose (1%) de reacções de transcrição do RNA pré-tratadas com nenhum complexo, actinomicina D, triptolido, tpfc, ou Ga (tpfc) com um [complexo]: [ADN molde de base] razão de 0,01 : 1. Actinomicina D e triptólido evidenciam uma nítida diminuição do ARN em comparação com a do controlo, como esperado deestes inibidores longo estudados. O (tpfc) Ga banda também tem um nível muito baixo de ARN, enquanto a banda tpfc mostra pouca ou nenhuma inibição e exibe a mesma intensidade relativa, tal como o controlo.

RNA Transcrição quantificada por espectroscopia UV-Vis

Medições UV-Vis foram tomadas de cada amostra depois de submetidos a transcrição de ARN, durante 4 horas e purificou-se por cromatografia em coluna de spin de ARN. Os espectros de comprimentos de onda de 220 ​​nm a 350 nm são apresentados na Figura 4, com o λ max ocorrendo a 260 nm, o que corresponde a absorção de ARN, e um coeficiente de extinção de 0,025 (ig / mL) -1 cm -1. A absorvância a 260 nm e 280 nm são apresentados na Tabela 3. Uma leitura de A260 de 1,0 é equivalente a cerca de 40 ug / ml de ARN, ARN puro e tem um A 260 / A proporção de 2,1 280, permitindo que para os cálculos quantitativos de ARN produzido durante a transreacção crição e uma avaliação da pureza do ARN após a utilização da coluna de spin de ARN. 44 Três das quatro reacções de transcrição tratados com inibidor de ARN produziu menos do que o controlo, com Ga (tpfc) transcrever ADN tenha sido tratada com apenas 0,07 vezes mais ARN como o ADN não tratado. ADN tratado com tpfc não mostraram inibição aparente. Todas as amostras têm uma razão de aproximadamente 2,2 A 260 / A 280, indicando amostras relativamente puras. A purificação por colunas de giro RNA remove RNA curto vertentes 20 ou menos nucleótidos. ADN residual ou cadeias mais longas do que 20 nucleótidos podem estar presentes no que é considerado as amostras purificadas. Estas pequenas impurezas resultaria em um / A proporção A 260 280 ligeiramente maior do que 2,1.

Figura 1
Figura 1. As estruturas moleculares de gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e o análogo freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. As curvas de citotoxicidade e GI 50 valores de corroles na próstata (DU-145) (cinza), mama (MDA-MB-231) (azul), pele (SK-MEL-28) (laranja), e do ovário (OVCAR -3) (verde) linhas celulares de cancro. As células foram incubadas com (A) GA (tpfc) e (B) tpfc, seguido pela determinação da viabilidade usando o MTS com base em ensaio de viabilidade celular colorimétrico de acordo com o protocolo do fabricante. favor aqui para ver uma versão maior destafigura.

Figura 3
Figura 3. O brometo de etídio gel corado de agarose (1%) de reacções de transcrição após 4 h de incubação. A pista 1 é uma escada de DNA de 1000 pb como um padrão. As pistas 2-6 mostram o ARN transcrito a partir de 0,43 pmol de ADN e tratado com 4,3 fmol de cada inibidor (a [complexo]: [ADN molde de base] razão de 0,01): o controlo (faixa 2), Actinomicina D (pista 3), triptólido (pista 4), tpfc (pista 5), ​​e Ga (tpfc) (pista 6).

Figura 4
Figura 4. Espectro de UV-Vis de 1:. 200 diluição de ARN transcrito a partir de 4 horas de incubação A matriz de ADN para a reacção de transcrição foi tratado com nenhum complexo, ou com Actinomicina D, triptolido, tpfc, ou Ga (tpfc) em a [complexo]: [base DNA do modelo] relação de 0,01: 1. A concentração de RNA é medido por densidade óptica a 260 nm.

Descongele reagentes congelados no gelo:
75 soluções mM de trifosfato de adenosina, trifosfato de guanosina, citidina trifosfato, e uridina trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP)
Água livre de nuclease
Reacção 10x (1x tampão de reacção: 40 mM Tris-HCl, MgCl2 6 mM, espermidina 2 mM, ditiotreitol 10 mM, pH 7,9) Tampão
DNA molde linearizado (0,5 ug / ml, 1,85 kb)
ARN polimerase da enzima (20 U / ul)

Tabela 1. Lista de reagentes congelados.

Para começar as reações de transcrição, adicione o seguinte valor de cada reagente em 0,2 ml tubos de PCR de parede fina:
2 ulSolução de ATP (75 mM)
Solução CTP 2 ul (75 mM)
Solução de GTP 2 ul (75 mM)
Solução de 2 ul de UTP (75 mM)
1 ml de água livre de nuclease
2 ul 10x Tampão de Reacção
2 uL de ADN modelo linear de 0,5 ug / uL
5 jul complexo (água livre de núcleo como o branco, actinomicina D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc))
2 ul de RNA Polimerase (20 U / ul)

Tabela 2. Lista de reagentes para a reação de transcrição.

Tempo Ponto (hr) Complexo A 260 A 280 </ Strong> A 260 / A 280 Factor de Diluição [ARN]: A 260
(Ug / ml)
[ARN] (mg / ml)
4 Controle 7.583 3.516 2.16 200 40 60,67
4 Actinomicina D 0,955 0,438 2.18 200 40 7,638
4 triptolide 1.794 0,816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7,858 3,631 2.16 200 40 62,87
4 Ga (tpfc) 0,554 0,232 2.39 200 40 4,434

Tabela 3. Concentração e pureza do ARN transcrito após 4 h medido por espectroscopia UV-Vis. O coeficiente de extinção de ARN de cadeia simples é de 0,025 (ig / mL) -1 cm -1, 260 um A leitura de 1,0 é equivalente a cerca de 40 ug / ml de ARN e ARN puro tem um A 260 / A proporção de 2,1 280 45.

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Discussion

Este ensaio demonstra que a adição de Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN comparavelmente aos complexos anticancro de ligação de ADN conhecidos actinomicina D e triptólido. O comportamento citotóxico de Ga (tpfc) (GI = 50 58,1-154,7 M) pode, devido às suas propriedades inibidoras. Uma vez que não foi observada inibição da transcrição em tpfc, a citotoxicidade de tpfc não é devido a inibição da transcrição de ARN, mas é causada por outros meios, ainda não estudadas.

Nos quatro reacções de transcrição executados, o DNA foi tratado com actinomicina D, triptolido, tpfc, ou Ga (tpfc), a uma [complexo]: [ADN molde de base] razão de 0,01, respectivamente, ou com um controlo não tratado. Os reagentes de reacção de transcrição foram combinadas e a reacção de transcrição foi deixada prosseguir durante 4 h a 37 ° C. O ARN transcrito foi purificado através de uma coluna de spin de ARN e o rendimento analisadas por espectroscopia UV-Vis e electroforese em gel. A natureza da inibição da transcrição pode ser FURTela investigados utilizando esta mesma técnica, com várias alterações, ou os compostos podem ser submetidos a alternativa in vitro e in vivo. As experiências adicionais que podem ajudar a determinar a natureza molecular da inibição incluem a cristalografia de raios-X de possíveis aductos ADN-corrole ou modelagem computacional da reacção de transcrição. O objetivo deste experimento foi determinar se os compostos inibem a transcrição, a fim de coletar informações sobre as suas potenciais propriedades anticancerígenas. Esse objetivo foi alcançado: tpfc exibiu nenhuma inibição, enquanto Ga (tpfc) apresentaram inibição clara e merece um estudo mais aprofundado.

O ensaio de transcrição de ARN pode ser modificado para proporcionar mais detalhe mecanicista. A adição dos agentes anticancro (por exemplo, os complexos corrole) após a reacção de transcrição é completa pode mostrar se os complexos de degradar ou hidrolisar o RNA. Outra experiência é recomendado para conduzira reacção de transcrição com todos os componentes com excepção da enzima polimerase de ARN 10 vezes mais baixa para permitir a diferenciação entre um mecanismo de inibição que envolve o ADN ou a enzima. Finalmente, a incubação do ADN ou a polimerase com os complexos anteriores de transcrição de ARN que permitem o aumento da ligação entre o complexo e o respectivo alvo, determinar se as qualidades inibidoras complexas estão envolvidas na ligação da polimerase de ADN ou, respectivamente.

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Acknowledgments

Agradecemos sinceramente Dr. Cindy N. Chiu para obter ajuda com eletroforese em gel, e Andy Zhou e Michael Grodick por sua generosa doação de DNA e enzimas de restrição. Agradecemos Professor J. Heath e Professor D. Prober para acesso generoso para equipamentos e materiais. Agradecemos ao Dr. Karn Sorasaenee para sugestões úteis. Agradecemos Mary H. Tang para a criação da ilustração usada no panorama de conjunto no vídeo. O financiamento foi fornecido pela Johnson & Johnson e USC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

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