Den kröslymfknutor Duct kanylerad Rat Model: Ansökan om bedömning av Intestinal Lymfatisk Drug Transport

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tarm lymfatiska systemet spelar nyckelroller i vätsketransport, lipid absorption och immunförsvar. Lymfan rinner direkt från tunntarmen via en serie lymfkärl och noder som konvergerar på den överlägsna kröslymfknutor kanal. Kanyle av kröslymfknutor kanalen möjliggör således insamling av kröslymfknutor strömmar från tarmen. Kröslymfknutor består av en cellulär fraktion av immunceller (99% lymfocyter), vattenfraktionen (vätska, peptider och proteiner såsom cytokiner och tarmhormoner) och lipoproteinfraktion (lipider, lipofila molekyler och apo-proteiner). Den kröslymfknutor kanalen kanylemodell kan därför användas för att mäta koncentrationen och hastigheten för transport av en rad faktorer från tarmen via det lymfatiska systemet. Ändringar av dessa faktorer som svar på olika utmaningar (t.ex. kost, antigener, droger) och sjukdomar (t.ex., inflammatorisk tarmsjukdom, HIV, diabetes) kan också be bestämdes. Ett område med växande intresse är den roll som lymfatiska transporter i absorptionen av oralt administrerade lipofila läkemedel och förläkemedel som associerar med tarm lipid upptagsvägar. Här beskriver vi i detalj en kröslymfknutor kanal kanylerad råttmodell som möjliggör utvärdering av hastigheten och omfattningen av lipid och läkemedelstransport via det lymfatiska systemet i flera timmar efter tarm leverans. Metoden är lätt att anpassa till mätning av andra parametrar i lymfan. Vi ger detaljerade beskrivningar av de svårigheter som kan uppstå vid upprättandet detta komplexa kirurgisk metod, samt representativa uppgifter från misslyckade och lyckade försök att ge instruktioner om hur att bekräfta experimentell framgång och tolka data som erhållits.

Introduction

Lymfan rinner från tunntarmen via en enkelriktad process som härstammar vid enstaka lacteals som ryms inom varje litet tarmluddet 1. Lacteals är relativt genomsläpplig för vätska, makromolekyler och celler och lymfa bildning därmed inleds med införandet av dessa faktorer i lacteals. Den inledande lymfan i lacteals strömmar därefter från tarmen via ett nätverk av lymfatiska mikrokärl, samla (afferenta) lymfkärl, en serie av kröslymfknutor och slutligen efter nodal (efferent) lymfkärl. Inom noderna, passerar lymfan genom en serie av märg bihålor där utbytet sker med nod inhemska immunceller samt material som kommer in i noden från blodet. Alla lymfan strömmar från tunntarmen konvergerar så småningom till den efferenta mesenterica superior lymfa kanal och därefter cisterna chyli. Den cisterna chyli samlar också lymfan tömning av stjärtfenan perifera vävnader, intestnalet, lever- och ländrygg och ansluter bröst lymfa kanalen tillsammans med lymfan från mediastinum och kraniala delar av kroppen. Bröst lymfa kanalen tömmer lymfan direkt i vensystemet vid korsningen av de vänstra interna hals och subclavia venerna. Protokollet som beskrivs här, vilket möjliggör insamling av lymfa direkt från mesenterica superior lymfa kanalen, underlättar således analys av olika faktorer som transiterar direkt från tarmen till den systemiska (allmänt) cirkulationen genom det intestinala lymfatiska systemet.

De huvudsakliga fysiologiska funktioner som tilldelats det intestinala lymfatiska systemet är att upprätthålla vätskebalansen, för att underlätta lipid och lipofil molekyl absorption, och för att möjliggöra lämpliga immunresponser 1. Tumörceller och virus föröka också via tarm lymfkärlen 2-4 och viktiga förändringar sker inom lymfkärlen i flera inflammatoriska och metabola sjukdomar 5-7. Cannulation av kröslymfknutor kanalen för att samla lymfan inom tarmkäxet möjliggör en analys av bulkfluidflödet via tarm lymfkärlen liksom kvantifiering av koncentrationen och transporthastigheten för olika celler och molekyler. Förändringar i koncentrationen eller transitering av dessa faktorer som svar på olika utmaningar (t.ex. dieter, antigener, läkemedel) och i sjukdomsmodeller (t.ex. kolit, hiv, diabetes) kan också bedömas. Även om det är omöjligt att i stor utsträckning beskriva varje lymfan komponent som kan analyseras och jämföras här, kröslymfknutor består förenklat av vatten, lipid och cellulära faser. Komponenter av intresse i den vattenhaltiga fasen innefattar peptider och proteiner såsom antigener eller tolerogener 8, immun budbärare såsom cytokiner och mastcellsmediatorer 9, och metaboliska mediatorer såsom inkretiner 10. Den cellulära fraktionen av efter nodal kröslymfknutor består nästan helt (över 99%) av lymphocytes 11. Olika immunceller (dendritiska celler, mastceller, etc.) in i pre-nodal mesenteriska lymfkärlen men kvar inom noden 12. Om cellerna i afferenta lymfan är av intresse, är det möjligt att samla in dessa celler genom avlägsnande av kröslymfknutor flera dagar innan kanyle av kröslymfknutor kanalen 12. På detta sätt afferenta och efferenta lymfan kanaler ansluts direkt och lymfa celler i afferenta lymfan passerar direkt in i kröslymfknutor kanalen. Transitering och fenotyp av olika immunceller som passerar genom tarm lymfkärlen kan alltså undersökas. Den kanske vanligaste orsaken citeras för att samla kröslymfknutor hittills är dock att studera tarm bearbetning, absorption och transport av kost lipider och lipofila molekyler 10.

Efter förtäring, är dietlipider digere (exempelvis från triglycerid till fettsyror och monoglycerid, phospholipid till fettsyror och lysofosfolipid, och kolesterol ester till fettsyra och kolesterol, etc.) och spridda inom tarmlumen till små miceller och vesikulära strukturer via tillsats av amfifiler från galla (fosfolipider, kolesterol och gallsalter) och verkan av pankreasenzymer 10,13. Härifrån de absorberas i enterocyter. En del av de absorberade komponenter omförestrats att bilda triglycerider, fosfolipider och kolesterolestrar inom absorberande celler (enterocyter). Dessa omförestrats lipider är sammansatta av en kombination av exogent intas lipidkomponenterna och endogena lipidkomponenter från utsöndrade gallan, mucosal lipid pooler eller tarmblodtillförseln 13. Härifrån de förestrade lipider antingen lagras i enterocyter eller monteras in i tarm lipoproteiner (kylomikroner, mycket låg densitet lipoproteiner (VLDL)) tillsammans med olika apoproteiner och andra lipofila molekyler ( 10,13. Efter att ha lämnat enterocyterna är lipoproteiner specifikt transporteras från tarmen till den systemiska cirkulationen via mesenteriska lymfsystemet som tarm lacteals är mer genomsläpplig för deras inträde än tarm blod kapillärerna. En del av absorberade lipidkomponenterna också transporteras från tarmen till den systemiska cirkulationen via blod kapillärerna och portvenen som singel, icke-lipoprotein associerade, molekyler 14. I allmänhet är dock portvenen transportvägen endast en betydande aktör på absorptionen av korta och medel kedjelängd lipider.

Insamlingen av kröslymfknutor möjliggör därmed bedömningen av transport av lipoproteiner och tillhörande komponenter (lipider, lipofila molekyler, APO-proteiner) från tarmen. De lipoproteiner kan kvantifieras och karakteriseras med den fördelen att kröslymfknutor lipoproteiner, i allmänhet, är i en nascent tillstånd eftersom de inte har i stor utsträckning ändras av system enzymer såsom lipoproteinlipas 15. Medan kröslymfknutor kanyl råttmodell har kanske historiskt sett varit mest omfattande beskrivits för analys av lipid / lipoprotein transport från tarmen, är ett område av växande intresse roll lymfkärlen vid transport av lipofila läkemedel, prodrugs och andra xenobiotika 13,16 vilket är i fokus för den modell som beskrivs här. Lipofila läkemedel (i allmänhet de med log P> 5 och löslighet i långkedjiga triglycerider> 50 mg / g även om vissa undantag uppenbara) 17,18, förläkemedel 19 och andra xenobiotika 13,16 kan få tillgång till tarm lymfkärlen antingen passivt eller genom aktivt integreras i tarm lipoprotein transportvägar 19.

Råttan kröslymfknutor kanyle teknik har alltså många tillämpningar. Bollman et al., Beskrivs först en technique att kanylera kröslymfknutor kanalen hos råttor 1948 20. Sedan dess har ett antal varianter på modellen har beskrivits. Till exempel, kan insamlingen ske när råttan bedövades med olika anestetika 21,22, eller i medvetet tillstånd medan fastspända 15 eller fritt rörliga 23,24. Råttor kan administreras olika rehydreringslösningar och andra substanser, såsom lipider och läkemedelsformuleringar med olika hastigheter i magen, tarmar eller parenteralt (typiskt 0-5 ml / h) 25. I några studier bröst lymfan kanalen snarare än kröslymfknutor kanal kanyl att uppskatta transport från tarmen via lymfkärlen även om detta kan överskatta transit från tunntarmen, beroende på faktorn av intresse, eftersom bröst lymfa kanalen får också lymfa från andra regioner 22,26. Lymph kanyle modeller har också beskrivits i ett flertal andra arter innefattande möss 15,27, mini-pigs 12, får 28,29, grisar 30 och hundar 31. Emellertid är råttmodellen den mest allmänt och konsekvent citerade. Detaljerade protokoll för kanylering av den mesenteriala lymfa kanalen följt av uppsamling av lymfa i medveten 25 eller bedövades 22 råttor och möss 15,27 har publicerats tidigare och den intresserade läsaren hänvisas till dessa protokoll. Detta protokoll är det första att demonstrera tekniken i en visualiserad format.

Lymfan kanyl råttmodell har fördelar jämfört större djurmodeller när det gäller kostnader, underlätta för kirurgi och etiska överväganden. Vid en jämförelse med musmodell är kröslymfknutor kanylekirurgi också lättare i råtta trots att musmodell möjliggör mer detaljerade studier i transgena djur 27. Icke desto mindre finns det vissa begränsningar i råttmodellen, i synnerhet de som är associerade med skillnader i fysiologi, denna gräns extrapolation till andra prekliniska och kliniska situationer. Till exempel, i råttgalla flödet är konstant och oberoende av födointag, medan i högre arter livsmedel eller lipider stimulera gallflödet 32. Detta skapar utmaningar för att få representativa före och efter prandiala miljöer i råttan som speglar vad som syns i större arter och människor. För drug delivery studier, får större arter också föredras vid bedömningen lymfatiska transport efter administrering av realistiska människoberedningsformer 25. I en nyligen genomförd studie, var lipid fraktsatser i kröslymfknutor befunnits vara jämförbara mellan arter (mus, råtta, hund) efter administrering av en ekvivalent massa och typ av lipid som ger viss tilltro extrapolera uppgifter lipidtransport över arter 27. Men transporten av en modell lipofilt läkemedel, halofantrin, rankad i ordningen djurets storlek (dvs, hund> råtta> mus). En skalfaktor kan således vara skyldig att extrapolate lymfatiska transport drog data från råtta till andra arter.

En begränsning av lymfa kanylemodeller, i allmänhet, är att passiv lymfa samling direkt från en lymfatisk kanal kan modifiera lymfflöde och transport eftersom lymfkärl arbetar mot en tryckgradient som ändras när fartyget kanyleras 33. Lymfan kanyle Modellen kan också vara svårt att fastställa i laboratorier som är obekanta med tekniken. Alternativa modeller har därmed beskrivits. Till exempel, transitering av faktorer via tarm lymfsystemet, såsom lipoproteiner och lipofila molekyler, har indirekt studerat via insamling av blod. En sådan modell innebär att jämföra blodkoncentrationer av lipider och / eller droger efter oral administrering i närvaro och frånvaro av hämmare (t.ex. colchicin, Pluronic L81, cykloheximid) av intestinal lipoprotein produktion som blockerar lymfatiska transporter 34. En fördelmodeller som kvantifierar lymfatiska transporter indirekt via insamling av blodprov är att den möjliggör en utvärdering av lymfatisk transporter hos människor som invasiv kirurgi inte krävs 35. Men hämmare av lymfatisk transporter är inte specifika och faktorer som transporteras via lymfkärlen späds och modifieras i den systemiska cirkulationen vilket komplicerar sådana bedömningar. In vitro alternativ har också beskrivits. Till exempel har caco-2 celler eller isolerade enterocyten kulturer använts för att studera mer i detalj tarmsekretion av molekyler som kommer in lymfkärlen 36-38. En avancerad in vitro-modell som är mer representativ för den mänskliga tarmmikro var också nyligen beskrivits 39. I denna modell en lymfatiska endotelcellskikt samar odlade med Caco-2-celler vilket möjliggör mer detaljerad analys av överföring av ämnen från tarmen in i lymfkärlen. Men i VITRo cellsystem saknar utbyte flöde och överföra dvs sammankoppling med en tarmlumen och underliggande blod och lymfatiska kärlförsörjning. I en alternativ metod, Kassis et al. Etablerat en dual-channel (höghastighetståg ljusfält video och fluorescens) in situ bildsystem som möjliggör kvantitativa jämförelser mellan kärlsammandragning, lymfflödet och fluorescerande lipidkoncentrationer i mesenteriska lymfkärl 33. En fördel med denna modell över den ovannämnda in vitro-system är att den möjliggör noggrann spårning av passagen av immunceller genom lymfkärlen. Absoluta mätningar av mass lipid (eller läkemedel) transporter finns dock ännu inte fastställts med hjälp av avbildningsmetoder. In vitro och in silico metoder att specifikt förutse omfattningen av lipofila läkemedelstransport via tarm lymfkärlen har också publicerats 40-42. Till exempel, den ex vivo affiniteten hos flera compounds för plasma kylomikroner befanns korrelera ganska bra med sin lymfatiska transporten in vivo 41. Därefter etablerade samma grupp en in silico modell för att förutsäga drog affinitet för kylomikroner baserade på flera fysikalisk-kemiska egenskaper 40. Holm et al. Också etablerat en relativt komplex in silico modell för att direkt förutsäga lymfatisk transport av lipofila föreningar utifrån molekylära deskriptorer 42. Dessa modeller kan ge ett användbart tillvägagångssätt för att förutsäga omfattningen av lymfatisk transport av okända droger. Validering av modeller med ett brett utbud av läkemedel och mellan olika labb kommer dock att krävas för att bekräfta sin noggrannhet och reproducerbarhet.

Kanyle av kröslymfknutor kanalen förblir alltså det enda sättet att direkt undersöka innehållet i lymfan dränering tunntarmen och transithastigheten för komplex samling faktorer (celler, proteiner,peptider, lipider, läkemedel) i lymfan i en in vivo-situation. Häri beskriver vi ett protokoll för kanyle av kröslymfknutor kanalen och halspulsådern som möjliggör insamling av kröslymfknutor och systemisk blod från sövda råttor. Representativa data visar hur modellen kan användas för att undersöka lipid och läkemedelstransport från tarmen via mesenteriska lymfsystemet. Detta följs av en diskussion om svårigheter som kan påträffas i upprättandet av modellen och en felsökningsguide. När etablerade modellen är ett kraftfullt verktyg för att undersöka tarm lymfatiska transporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De försök som beskrivs i detta manuskript har godkänts av den lokala djuretisk kommitté och genomfördes i enlighet med svenska och Nya Zeeland rådet för vård av djur i forsknings- och undervisnings riktlinjer. Innan du påbörjar något djur förfarande, se till att rätt tillstånd erhålls genom den lokala institution / organisation. Som med alla djur operationer, se till att operationen utförs av lämpligt utbildad operatörer, under aseptiska förhållanden och att anestetika, analgetika och antibiotika administreras vid behov för att säkerställa en etisk och framgångsrikt resultat.

1. Förberedelser Dagen före det kirurgiska ingreppet

  1. Snabb råttan kvällen innan operationen om det behövs. Se till råttan har fri tillgång till vatten.
  2. Förbered lösningar som skall administreras till råttan.
    1. Förbered en vätskeersättning som steril saltlösning eller Ringers lösning.
    2. Förbered enestetiska lösningar efter behov. Bedövningsmedlet som användes i de experiment som beskrivs här bestod av "Cocktail 1" framställes genom att kombinera 1,9 ml av ketamin 100 mg / ml, 0,5 ml xylazin 100 mg / ml, 0,2 ml acepromazin 10 mg / ml och 2,5 ml saltlösning och " Cocktail 2 "bestående av en ml av ketamin 100 mg / ml och 0,1 ml acepromazin 10 mg / ml. OBS: Inhalerad isofluran eller sevofluran kan föredragas eftersom det kan ge en kirurgisk plan av anestesi för en längre tidsperiod.
    3. Eventuellt bereda en formulering innehållande läkemedlet i, till exempel, en lipidemulsion. Utför lämpliga stabilitetsstudier för att säkerställa formuleringens stabilitet under lagringsperioden och administration.
      OBS: Den exakta karaktären hos formuleringen och läkemedel som skall administreras varierar med varje studie som syftar till lymfatiska transportstudier är oftast att utvärdera effektiviteten i lymfatisk läkemedelstransport som funktion av beredningen och läkemedels administrerad.
      1. Formuleringen som användes i de representativa experimenten i fig 4 och 5 här framställes, såsom beskrivits tidigare 43. I korthet, införliva 14 C oljesyra (2-5 ^ iCi) och halofantrin (200 | ig) i 40 mg oljesyra före dispersion i 5,6 ml av en vattenhaltig fas bestående av 5 mM natriumtaurokolat i fosfatbuffrad saltlösning (pH 6,9).
      2. För formuleringar innehållande 2-monoolein, tillsätt 7,1 mg 2-monoolein tillsammans med andra komponenter, till vattenfasen samtidigt som oljesyrafasen innehållande halofantrin. Förbered formuleringarna innehållande 2-monoolein omedelbart före administrering till råtta som 2-monoolein är relativt instabil och isomerises till 1-monoolein.
      3. Därefter emulgera formuleringarna genom ultraljuds under 2 min vid RT.
        NOTERA: Som har beskrivits tidigare 43, övervaka stabiliteten hos de formuleringar av i) visuell inspektion av emuleringssionen under polariserat ljus för att säkerställa att emulsionen inte fasen separeras, ii) partikelstorleksanalys omedelbart efter beredning och efter dosering med dynamisk ljusspridning för att ge en indikation på eventuella förändringar och / eller separation fas, och iii) analys av halofantrin koncentrationer med hjälp en validerad HPLC-analys.
  3. Förbered antikoagulerande lösning innehållande 10 mg / ml EDTA i sterilt vatten eller 10 lU / ml heparin i koksaltlösning för att spola lymfan kanylen. Förbereder också antikoagulant lösning innehållande 2,5-10 IE / ml heparin i saltlösning för att spola halspulsådern kanylen.
  4. Förbered polyetenkanyler för insättning i kröslymfknutor kanalen (0,8 mm YD, 0,5 mm ID), halspulsådern (0,96 mm YD, 0,58 mm ID, eller 0,8 mm YD, 0,5 mm ID) och tolvfingertarmen (0,96 mm YD, 0,58 mm ID )
    1. Skär kanyler till önskad längd (typiskt 25-30 cm för halspulsådern och duodenal kanylen och 10 - 15 cm för lymfan Cannula) och placera en avfasning vid spetsen av kanylerna med användning av en steril kirurgisk kniv (se figur 1).
      NOTERA: Detta ökar lättheten för kanylen införing och reducerar förekomsten av kanyl blockering inbladning.
    2. Placera en J form ankarpunkt i intraduodenal kanyl genom looping en liten del av kanylen tillbaka på sig själv, att värma den med en tändare eller värmeplatta och sedan kapning (se figur 1).
  5. Fäst lymfan kanyl till en 25 G-nål och spruta innehållande en antikoagulant lösning (framställd i steg 1.3). Fyll lymfan kanylen med anti-koagulerande lösning och lämna lösningen i kanyl O / N för att minska förekomsten av koagelbildning i lymfan kanylen under lymfa samling.
  6. Förbered rör för lymfan och blodprov samling. Pre-väger lymfan uppsamlingsrören, etikett rör för lymfan och blodprov insamling och lägga antikoagulant lösning. Tillsätt tillräcklig mängd antikoagulant solutjon för att uppnå en slutlig koncentration av 1 mg / ml EDTA i sterilt vatten eller 10-20 lU / ml heparin i det uppsamlade lymfa eller blod.

2. Förberedelser Omedelbart innan vi påbörjar det kirurgiska ingreppet

  1. Kontrollera alla kanyler genom spolning med steril saltlösning eller antikoagulant lösning för att säkerställa att de är patent.
  2. Förbered råttan för den kirurgiska proceduren.
    OBS: kröslymfknutor kanalen är mer synliga i råttor som har ätit eller administrerats en dos av olja som kröslymfknutor blir mjölkig och ogenomskinlig med högre lipid belastning. Vissa operatörer, särskilt de nya till operationen, därför har lättare att kanylera kröslymfknutor kanalen när råttorna är fördoserad med en olja (cirka 0,1-1 ml) såsom olivolja eller sojaolja 0,5-2 h före påbörjas operation . Men pre-doserings oljan påverkar lymfatiska transport av lipider, lipofila läkemedel och andra faktorer i lymfan sådan att det inte kan vara perfekt att pre-dos oljaberoende på syftet med experimentet.
    1. Söva råttan hela operationen och provinsamlingsperioden.
      1. Till exempel, initiera anestesi via subkutan injektion av 1,5 ml / kg av Cocktail I (från steg 1.2.2) i ett hudveck på baksidan av råttor halsen med hjälp av en 1 ml spruta kopplad till en 25 G nål. Bibehåll anestesi via intraperitoneal injektion av 0,44 ml / kg Cocktail 2 (från steg 1.2.2) ungefär varje timme som krävs, med hjälp av en 1 ml spruta kopplad till en 25 G nål.
      2. Innan inleds operationen att anestesidjupet är tillräckligt genom att observera andningsfrekvens, morrhår rörelse, muskeltonus och reaktioner på stimuli såsom nypa av mul. Administrera ytterligare anestesi behov.
    2. Raka pälsen från de kirurgiska regioner, vilka omfattar den högra sidan av buken för lymfan och tolvfingertarmen kanyle, och nacken och vänster nyckelbenet region för halspulsådern kanyltion.
    3. Rengör kirurgiska regioner aseptiskt använder povidine-jodlösning eller klorhexidin lösning och en 70% etanol skrubba. Upprepa detta 3 gånger för varje region, avslutar med en sista rengöring med 70% etanol.
  3. Placera djuret i ryggbakåtlutad kroppsställning på ett tomt ovanför en uppvärmd kirurgisk dyna (37 ° C).

3. Kanyle av kröslymfknutor Duct

  1. Placera djuret med dess högra sida som vetter mot användaren. Utför kirurgi med eller utan hjälp av en kirurgisk mikroskop efter behov.
  2. Öppna det översta lagret av den abdominala muskeln väggen med en rak 4 cm snitt som sträcker sig från mittlinjen (xyphoid processen) till den högra flanken ca 2 cm under bröstkorgen (costal marginal) med användning av en steril skalpell blad (se figur 2B).
  3. Öppna de återstående lagren av magmuskel väggen 4-5 mm i sidled med mittlinjen till höger flanken med ett lågt parav kirurgiska saxar (se figur 2B).
  4. Dra in tunntarmen under vänster magmuskel väggen och hålla den på plats med 2-3 stycken av steril gasväv mättad med normal saltlösning.
  5. Brygga råtta under en plastspruta 10 ml placeras horisontellt under råttans rygg på nivån för höger njure för att lindra visualisering av kröslymfknutor kanalen.
  6. Lokalisera mesenterica superior lymfa kanal: ett kärl ungefär 0,5-1 mm i diameter som är vinkelrät mot den högra njuren och omedelbart rostralt och parallellt med den mesenteriala artären (en pulserande mörkröd blodkärl; se figur 2C).
    OBS: I icke-fastande eller olje fördoserad råttor kärlet är vit, opak och lättare att visualisera än i fastande råttor i vilka det är ganska genomskinlig.
  7. Inspektera området omedelbart kaudalt om stora överlägsna kröslymfknutor kanal och mesenterialartären att avgöra om en andra, mindre tillbehör lymfa kanal ärnärvarande. Om de är närvarande, blockera flödet av lymfa genom kanalen genom att bryta kanalen och ockludera med superlim, eller knyta en sutur runt kanalen, för att säkerställa att hela volymen av lymfa som strömmar från tarmen uppsamlas från mesenterica superior lymfa kanal.
  8. Passera ett par raka pincett genom den peri-renal fett säng på nedre marginalen på höger njure, och genom de bindvävsskikt omedelbart under hålvenen, i en riktning parallell med den överlägsna kröslymfknutor kanal.
  9. Använda spetsen av tången tar tag i lymfan kanylen och dra den genom den peri-renal fett säng med en ände omedelbart intill den mesenteriala lymf kanalen och den andra exteriorised från djuret vid nivån för den högra njuren.
  10. Isolera kröslymfknutor kanalen från överliggande lager av bind och fettvävnad genom dissektion. Se till att inte punkteras eller skadas lymfan kanalen.
  11. Efter isolering lymfan kanalen, göra en liten hole i lymfan kanalen med antingen mikro-sax, den vassa spetsen på juvelerare pincett eller en 25 G nål. Se till att inte helt bryta fartyget.
  12. Kontrollera att lymfan kanylen är helt fylld med anti-koagulerande lösning (med användning av en spruta och 25 G-nål) med några luftspalter. Sätt i lymfan kanylen ca 2 - 4 mm innanför kröslymfknutor kanalen via det lilla hålet med hjälp av en liten pincett.
  13. Observera lymfan kanyl i ett par minuter. Beakta en gradvis flöde av tarm lymfa från den fria uppsamlings änden av kanylen om kanyler är framgångsrik. Om kanyler inte lyckas, upprepa steg från 3,8 till 3,12.
  14. Om kanyle lyckas fästa kanylen genom att placera en liten droppe av veterinär lim över ingångshålet in i lymfan kanalen. Se till att inte täppa till kärlet genom tillämpning av överskottet veterinär lim.
  15. Samtidigt väntar veterinär limmet att ställa, observe flödet av lymfa i flera minuter för att säkerställa att den kanyleförfarandet lyckades. När vissa av framgången med kanyler, ta bort gasväv bitar som placerades i bukhålan försiktigt och placera tunntarmen i sitt ursprungliga läge.
  16. Placera en lymfa uppsamlingsrör innehållande antikoagulant (se steg 1.6) i slutet av kanylen för att samla den friflytande lymfa.
  17. Därefter kanylera duodenum för infusion av vätskeersättningslösningar och / eller formuleringar.

4. Kanyle av duodenum

  1. Fäst duodenum kanyl till en spruta (t.ex. 10 ml) fylld med vätskeersättning.
  2. Identifiera tolvfingertarmen som den ljust rosa (med fler blodkärl) delen av tunntarmen, som vid mild nedåt dra avslöjar magen.
  3. Gör en liten punktionshålet i tolvfingertarmen ungefär 2 cm nedanför korsningen av magsäcken och tolvfingertarmen (pylorus) med användning aven steril 23 G-nål.
  4. Sätt i J formade hooked änden av duodenal kanylen genom punktionshålet. Säkra på plats med en droppe cyanoakrylatlim.
  5. Påbörja hydrering av råttan genom att fästa kanylen till rehydrering sprutan fyllts på i en infusionspump. Enligt litteraturen rehydrering varierar 0,5-3 ml / timme 15,25.
  6. Efter fullbordan av lymfa och duodenum kanyle stänger snittet i bukmuskeln väggen med suturer. Stäng sedan hudsnittet genom att tillämpa några droppar vävnadsadhesiv (cyanoakrylat) längs sidan av snittet och att klämma ihop huden på båda sidor om snittet tillsammans.

5. Kanyle av carotis

Halsartären kanyler kan utföras före eller efter kanylering av den mesenteriala lymfa kanalen. Vissa operatörer föredra att kanylera karotidartären före kanyle lymfan kanalen för att minska potentially rubbas lymfan kanyl när du flyttar djuret.

  1. Placera ett märke på halspulsådern kanylen 2,5 cm från koniska spetsen för att identifiera den del av slangen för att infoga i artären. Anslut den andra änden av kanylen (dvs utan avfasning) till en 23 eller 25 G nål fäst till en spruta fylld med anti-koagulerande lösning och fyll kanylen med anti-koagulerande lösning som gör att inga luftspalter är närvarande.
  2. För att underlätta kanyle, placera sövd råtta i rygg VILA med halsen sträckt och huvud pekar mot operatören. Observera att vissa operatörer föredrar att utföra denna teknik med råttans svans pekande mot operatören.
  3. Placera en 1-1,5 cm längsgående snitt genom huden skiktet ovanför vänster av trakea i sagittalplanet.
  4. Dissekera subkutan bindväv med trubbiga spets pincett för att exponera de underliggande parade nackmusklerna.
  5. Fäll nackmusklerna to avslöja vänstra halspulsådern (finns ~ 1 cm under ytan och pulserande hud). Rengör liggande bindväv från artären genom trubbig dissektion.
  6. Isolera en ~ 1 cm avsnitt av artären noga med trubbiga vävnads pincett, noga med att inte skada intilliggande vagusnerven spår. Utför detta genom att öppna och stänga de trubbiga spets pincett vertikalt längs vardera sidan av artären för att befria det från den omgivande vävnaden och vagusnerven.
  7. Med fin spets pincett, trä två silkessuturer under halspulsådern och placera dem i varje ände av den isolerade artärsektionen. Knyt bort suturen närmast operatören och längst bort från råttans hjärta och nyckelbenet (Figur 3A).
  8. Täppa till blodflödet genom artären genom att placera ett par raka fin spets pincett under artären (figur 3B).
  9. Använda de fina spets iris sax, placera ett litet snitt på den övre ytan av artären (ca 3/1 av denvägen ner från toppen av det isolerade området). Spola utspilld blod på ytan av artären med hepariniserad saltlösning och torka försiktigt med bomull tips.
  10. In spetsen av kanylen in i artären med en par krökta spets pincett. När isatt, ta bort de raka fina spets pincett täppa blodflödet och avancera kanylen 2,5 cm in i artären använder två par pincett, en för att hålla kanylen inne i artären för att stoppa blodet från att läcka tillbaka och den andra för att sätta in kanylen.
  11. Använd en liten artär klämma för att hålla kanylen inuti artären och avlägsna de raka fin spets pincett som placerades under artären i steg 5,8 för att täppa till blodflödet.
  12. Bekräfta öppenheten hos kanylen genom att injicera anti-koagulerande lösning in i kanylen och dra tillbaka en liten mängd blod (figur 3C). Spola sedan kanylen med antikoagulerande lösning och försegla änden med hjälp av lågan från en tändare eller en kanyl plugg.
  13. Bind the kanyl på plats med de två suturer hänförts artären i steg 5.8.
  14. Ta artären klämman och säkra en tredje sutur runt artär och kanylen. Stäng halsen lindas med suturer.

6. Post-kirurgisk Period och Formulering Infusion

  1. Fortsätt att upprätthålla råtta under anestesi och på den uppvärmda plattan.
  2. Rehydrera råttan via infusion av vätskeersättning i tolvfingertarmen i minst 0,5 timmar efter slutförandet av kanyle. Observera lymfan flöde minskning (~ 0,1-0,5 ml / timme) under den första tiden efter kanyle och snart öka till en stabil baslinje (0,4-2,5 ml / h beroende på rehydrering hastighet).
  3. Efter återhämtningsperioden, ingjuta formuleringen av intresse (innehållande lipider, läkemedel, etc.) in i duodenum via kanyl. Eventuellt använda en infusionspump för att reglera flödeshastigheten av formuleringen. OBS: I beskrev protokollet här djuren kvar anaesthetised hela operationen och lymfa insamlingsperioden och euthanizeds under anestesi, så att ytterligare analgesi inte krävs. Om protokollet ändras och djuren möjlighet att återfå medvetandet sedan lämplig smärtlindring och postoperativ vård kommer att krävas.
  4. Vid slutförandet av beredningen infusion fortsätta att rehydrera råtta vid hastighet av 1,5-3 ml / h med normal saltlösning in i tolvfingertarmen för att förhindra uttorkning.
  5. Fortsätt att hålla råttan på 37C uppvärmda kirurgiska pad att hålla temperaturen (enligt steg 2.3), express urin från blåsan via skonsam nedåt tryck på den nedre delen av magen efter behov och åter oftalmologiska salva varje timme (enligt steg 2.2. 3). Regelbundna kroppspositionsändringar rekommenderas om djuret är att återfå medvetandet efter ingreppet.

7. Insamling av lymfa och blodprover för att bedöma Lipid and Drug Absorption

  1. Samla lymfan kontinuerligt inrör innehållande antikoagulant. Ändra rören vid de obligatoriska tidsintervall (t.ex. per timme).
  2. Samla blodprov vid inställda tidpunkter.
    1. Täppa till blodflödet genom kanylen genom att böja kanylen tillbaka omkring 2 cm från den förseglade änden. Bryta förseglingen kanylen genom att skära av den tätade änden eller avlägsna kanylen pluggen.
    2. Använda en tom spruta, dra hepariniserad saltlösning från kanylen tills blodet fyller hela kanylen.
    3. Med hjälp av en ny tomma sprutan, dra önskad volym av blod och plats i ett rör innehållande antikoagulant.
    4. Använda den första sprutan, byt blodet tas före provtagning för att minska onödiga blodförlust. Före injektion flick sprutan medan du håller den upprätt för att säkerställa att inga luftbubblor in i kanylen.
    5. Med hjälp av en spruta, ersätta den volym av blod som avlägsnats från råttan med anti-koagulerande lösning. Se till att inga rest blod syns i kanylen som eventuellt kvar kan koaguleraoch blockera kanylen.
    6. Böj kanylen ca 2 cm från oförseglade änden för att blockera blodflödet och ta sprutan. Använda flamma av en tändare eller en kanylplugg, återförslut kanylen.
  3. Vid slutförandet av blod och lymfa samling från råtta, euthanize råttan via intraperitoneal administration av> 100 mg / kg natriumpentobarbiton.
  4. Bestäm lymfa flödeshastighet genom att mäta massan av lymfa samlats in under varje tidsperiod.
  5. Mät koncentrationen av läkemedel och lipid i lymfa och blod med användning av, till exempel, HPLC, HPLC-MS eller med hjälp av kommersiella kit, för att bedöma lipid och läkemedels absorptionseffektivitet.
  6. Beräkna masstransport av läkemedel och lipider i lymfan från produkten av de uppmätta halterna och volym lymfa insamlade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaten av ett representativt experiment för att kvantifiera den kumulativa omfattningen och hastigheten av lipid och läkemedelstransport via det lymfatiska systemet efter tarm leverans med hjälp av kröslymfknutor kanyle modellen visas i Figur 4 och Figur 5. I detta experiment, 200 ^ g av modellen lipofila drog halofantrin administrerades in i duodenum av råttor över 2 h i en formulering innehållande 40 mg oljesyra (inklusive 2-5 pCi 14 C-oljesyra) och 7,1 mg 2-monoolein dispergerad i 5,6 ml av 5 mM natriumtaurokolat i fosfatbuffrad saltlösning pH 6,9. Efter formulering administrering råttorna rehydrerades med en hastighet av 2,8 ml / timme med normal saltlösning infuserades in i duodenum. Lymfa samlades kontinuerligt i rör ändrade varje timme för 10 timmar. Formuleringen framställdes, och experimentet utfördes, enligt ett protokoll som beskrivits tidigare för en formulering innehållande alla samma COMPONäldrar utom det inte inkluderar 2-monoolein 43.

Såsom visas i fig 4, i dessa experimentella betingelser medelvärdet lymfa flöde för framgångsrikt kanyle råttor var mellan 0,4-1,3 ml / timme. I vissa råttor var flödeshastigheten lymfan något lägre under första 1-3 tim efter kanyler och därefter ökat. Detta är allmänt sett efter lymfan kanyle. Vidare visas i figur 4 är lymfan flöde för ett misslyckat försök. I detta fall förblev flödeshastigheten avsevärt lägre än den som ses i de framgångsrika försök under hela insamlingsperioden. Likaså den kumulativa lymfatiska transporten av triglycerider och halofantrin var betydligt lägre i den förlorande experimentet (figur 5A och B). Den genomsnittliga kumulativa halofantrin transport i den framgångsrika gruppen var 15,1% av dosen, den kumulativa triglycerider transport var 61 mg under 10 timmar och andelen av den administrerade radiolabelled exogena lipiddos transporteras i lymfan var 54% (figur 5C). Dessa värden är inte signifikant den som ses för en liknande formulering som innehöll samma komponenter förutom frånvaron av 2-monoolein 43 (tabell 1). Detta tyder på att formuleringar som innehåller fettsyror i avsaknad av en källa till monoglycerid kan stödja liknande lipid och läkemedelstransport i lymfan till dem som gör innehåller monoglycerid. Detta resultat beskrivs vidare i diskussionsavsnittet.

Figur 5D visar representativa data för graden av halofantrin och triglycerider transporter i lymfan över tid efter administrering. Transporttakten både triglycerider och drog in i lymfan toppar ett par timmar efter lipid och läkemedelsadministration och återgår sedan till basnivåer. Som är typiska i tarm lymfatiska lipid och transportdrogexperiment, hastigheten för läkemedels transport i lymfan under varje tidsperiod speglar som sett på triglycerider transporter som läkemedel transporteras in lymfa tillsammans med de triglyceridrika lipoproteiner.

Figur 1
Figur 1. Schematisk representation av formen på den avfasade spetsen av en halspulsådern eller lymfa kanyl, och den J-formade avfasade spetsen på en duodenal kanyl.

Figur 2
Figur 2. Fotografier av (A) buken rakat förberedelse till kanylera lymfan kanalen, (B) den magmuskelväggen öppnas med en rak 4 cm snitt som sträcker sig från mittlinjen till den högra flanken att komma lymfan kanalen, och (C ) den överlägsna kröslymfknutor kanal (i gul cirkel) vinkelrätt mot den högra njuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Fotografier av (A) halspulsådern isoleras med två siden suturer med en närmast operatören bunden av, (B) halspulsådern isoleras och blodflöde tilltäppt med ett par raka fin spets pincett placeras under artären, och (C) en halspulsådern med kanyl på plats och öppenhet som kontrolleras genom att rita upp en liten mängd blod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 "src =" / filer / ftp_upload / 52.389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Representativa data för kröslymfknutor flöde (l / h) över tiden. Råttor administrerades en formulering innehållande 200 ug halofantrin, 40 mg oljesyra (med 2 ^ Ci 14 C-oljesyra) och 7,1 mg 2-monoolein i 5,6 ml 5 mM natriumtaurokolat i fosfatbuffrad saltlösning (pH 6,9) 0-2 h. Data som visas är medelvärdet ± SEM för n = 3 lyckade experiment (slutna cirklar, ●) och n = 1 misslyckat utfall (öppna trianglar, Δ).

Figur 5
Figur 5. Representativa data för lipid och läkemedelstransport i kröslymfknutor. Ackumulerad transport av (A) modellen drog halofantrin (Hf,% dos), (B) triglycerid (TG, mg) och (C) exogen fettsyra (% dose), och hastigheten för transport av (D) TG (mg / h) och Hf (% dos / h) in i kröslymfknutor över tid efter administrering av en formulering innehållande 200 ug halofantrin, 40 mg oljesyra (med 2 ^ Ci 14 C-oljesyra) och 7,1 mg 2-monoolein i 5,6 ml 5 mM natriumtaurokolat i fosfatbuffrad saltlösning (pH 6,9) 0-2 h. Data som visas är medelvärdet ± SEM för n = 4 lyckade experiment (slutna cirklar, ●) och n = 1 misslyckat utfall (öppna trianglar, Δ). Exogen fettsyra transport mättes inte i misslyckade experimentet men är vanligtvis lågt på misslyckade experiment. Data för den förlorande experimentet utelämnas från Panel D för tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Utan monoolein Med 2-monolein
Medelvärde SEM Medelvärde SEM
Halofantrin (% dos) 15,1 0,8 15 1,6
Triglycerid (mg) 67 4 61 6
Total fettsyra (imol) 261 16 248 23
Exogent oljesyra (pmol) 82 5 65 6
Endogen fettsyra (imol) 180 17 183 28

Tabell 1. Jämförelse av kumulativa lymfatiska transportdata över 10 timmar efter administrering av 200 mikrogram halofantrin att kröslymfknutor kanal kannulerade råttor i formuleringar innehållande 40 mg oljesyra (containing 1 ^ Ci 14 C-oljesyra) emulgerad i 5 mM natriumtaurokolat i fosfatbuffrad saltlösning (pH 6,9) med och utan 7,1 mg 2-monoolein. Data representerar medelvärde ± SEM för n = 4 råttor. Inga statistiskt signifikanta skillnader ses mellan de två grupperna.

a I gruppen doserad med 2-monoolein detta inte ett exakt mått av endogen fettsyratransport som oljesyra fäst till 2-monoolein ryggraden inte redovisas i den uppmätta exogena oljesyra transport in lymfan.

b Uppgifterna för halofantrin och total fettsyratransport i gruppen doserad utan 2-monoolein har tidigare publicerats i figur 5 i referens 43 och återges här i tabellform.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Råttan kröslymfknutor kanylemodell möjliggör direkt kvantifiering av koncentrationen och hastigheten för transport av olika celler och molekyler (såsom lipider och läkemedel) från tarmen in i lymfan och förändringar av dessa som inträffar som svar att utmana olika ämnen (kost , antigen, droger, formuleringar, etc.) 10,27 och sjukdom (cancer, virus, kolit, insulinresistens, etc) 5-7. Komponenterna som samlats in i lymfan kan också användas vidare i ytterligare experiment. Till exempel kan celler odlas 44, lipoproteiner fraktioneras och lymfa eller dess komponenter, såsom lipoproteiner eller celler, laddade med markörer inklusive läkemedel, radiomarkörer och fluorescerande prober. Dessa kan sedan åter infunderas i mottagande djur till mer direkt utvärdera deras funktion, metabolism, clearance och / eller vävnadsdispositionsmönster 45-47. Råttan lymfa kanyle modellen har flera fördelar jämfört med den other in vitro, in situ, in silico, och in vivo-modeller som beskrivs i inledningen. Viktigast är kanyle den enda metod som ger direkt tillgång till hela volymen av komponenter i lymfvätska. När utförs i händerna på en erfaren operatör modellen är kan uppnås robusta, reproducerbara och experimentella framgångsrika av> 80%. Däremot kan den kirurgiska tekniken vara svårt att initialt bemästra, särskilt i ett laboratorium som inte är bekant med tekniken.

Flera steg är avgörande för framgång för kröslymfknutor kanylemodell. Den första är rätt val av kirurgiska instrument och kanyl typ och förberedelser. Vårt labb använder PE kanyler med måtten OD 0,8 x ID 0,5 mm. Dock har andra labb upplevt framgång med PVC kanyler av samma dimension 15. Avfasning spetsen på kanylen och pre-blötlägga den i en antikoagulant även hjälper till att förhindraocklusion av, och bildandet av blodproppar inuti, kanylen inbladning (steg 3,13). Det första steget av det kirurgiska förfarandet att vissa operatörer finner särskilt kritisk tar hand för att rengöra lager av bind och fettvävnad ovanför lymfan kanalen (steg 3.10). Detta hjälper till att undvika införande av kanylen mellan vävnaden och lymfa kanalen snarare än in i lymfan kanalen. Emellertid är detta rengöringssteg svårt som lymfan kanalen är skör och lätt att skada. För vissa är det här steget och införande av kanylen mest framgångsrikt avslutats med hjälp av ett operationsmikroskop även andra hitta ett mikroskop är inte nödvändigt. Vid isättning av kanylen in i kanalen i vilken riktning och insättningsdjupet i förhållande till den fasade spetsen kräver viss hänsyn för att förhindra kanylen förslutas genom kärlväggen (steg 3,12). Varje operatör tenderar att hitta sin egen individuella preferenser. Också viktigt är att undvika luftbubbelbildning inom cannula under införande som luftspalter gäller mottryck till det fria flödet av lymfa (steg 3,12). Slutligen bör tillämpningen av veterinär lim för att fästa kanylen på plats vara under insättningspunkten i kanalen som lim placeras direkt ovanpå kanalen kan orsaka fartyget att kollapsa och täppa till kanylspetsen (steg 3,14).

Det enklaste initiala guide huruvida en operation är framgångsrik är flödeshastigheten av lymfa. När kanylen är på plats lymfa allmänhet börjar flyta långsamt i den första 30 min och sedan ökar. Vanligtvis flöden för framgångsrika kanyle hos råttor> 250 g är> 0,1 ml / h under den första timmen och därefter öka till> 0,4 ml / h vid steady-state som visas i figur 4. Även naturligtvis kan variera beroende på . experimentell skick Mässigt felsökning, om ingen lymfan flyter genom kanylen eller flödeshastigheten är låg kan detta bero på:

    kanylen var inte korrekt insatt i kanalen
  1. kanylen är i kanalen men tilltäppt av sidan av kärlväggen
  2. kanylen är i kanalen utan tilltäppt av lim appliceras i fel läge
  3. kanylen är i kanalen och en luftbubbla i kanylen är att bromsa flödet
  4. en koagel har bildats i kanylen

Noggrann inspektion avslöjar oftast den underliggande faktorn. Om operatören tror kanylen inte korrekt placerad i första hand (dvs, lymfa aldrig flyter) sedan återinsättnings är nödvändigt. Om kanylen verkar vara på rätt plats sedan den första faktorn att kontrollera är om en luftbubbla eller koagel är närvarande. Luftbubblor i allmänhet passerar genom kanylen som lymfan flöden och tillfälligt långsamt flöde. Det är ibland möjligt att ta bort luftbubblor eller blodproppar genom att rita tillbaka på kanylen med hjälp av en 25 G nål fäst, exempelvis en 1 ml spruta. Om det inte finns någon luftbubbla eller koagel kan det vara bra att försöka åter positionering råtta och / eller vrida eller dra kanylen något. Detta kan ibland ställa om kanylen så att den inte är blockerad mot kärlväggen. Ibland avlägsna limmet med eller utan liten rörelse av kanylen möjliggör lymfan att flyta igen också. Men om allt annat misslyckas kanylen måste återinföras. Enligt vår erfarenhet experiment mindre framgångsrika när kanylen inte var korrekt insatt på första försöket. Dock är det möjligt kirurgisk räddning. En annan komplikation som kan uppstå är svårt att kanyle grund av anatomiska variationer mellan råttor. Till exempel passerar den kröslymfknutor kanalen ibland i en besvärlig riktning eller finns det ett tillbehör lymfa kanalen på den motsatta sidan av den mesenteriala artären till den större mesenterica superior lymfa kanal. I experiment som kräver insamling av hela volymen av lymfa som strömmar från tunntarmen (såsom är falletvid bedömning total lipid och läkemedelstransport från tarmen via lymfkärlen), behöver tillbehöret lymfa kanalen som skall tillslutas så att alla lymfan är riktad till den överlägsna lymfa kanalen. Detta är svårt att uppnå, men kan startas genom att knyta en sutur runt tillbehörskanal eller avskärande tillbehörskanal och ockludera den med veterinär adhesiv (steg 3.6). Närvaron av ett tillbehör lymfa kanal är en av de viktigaste faktorerna som resulterar i experimentell misslyckande i lymfatiska transportdrogexperiment. Om tillbehöret fartyget inte är helt tilltäppt, lymfflödet och lipid och läkemedelstransport är betydligt lägre än väntat.

I protokollet presenteras här djuret förblir sövd under hela lymfan insamlingsperioden. Den nedsövda råttmodellen (snarare än medvetna modeller som beskrivs nedan) ökar experimentell genomströmning som operationen och experiment kan genomföras inom en snarare än flera dagar och det kirurgiska framgång råt är större eftersom det är lättare att hålla kanylen öppenheten i immobiliserade djur. Anestesi kan teoretiskt minska ventrikeltömning, intestinal lipid bearbetning och lymfflödet och transport. Vår erfarenhet är dock lymfatiska lipid och läkemedelstransport är liknande i sövda råttor administrerade läkemedlet direkt in i tolvfingertarmen (till bypass magtömningen) inom pre-smält och pre-spridda fordon (t.ex., fettsyra och monoglycerid micellära system spridda med tensider ) jämfört med medvetna råttor administrerade läkemedlet via oral sondmatning i magen i en ekvivalent triglycerid 21,23,27. I själva verket har de flesta av intestinala lymfatiska transportdrogexperiment i vårt labb i de senaste 10 åren genomförts i sövd modellen på grund av den högre genomströmning som kan uppnås. I dessa experiment har vi oftast administrerade droger i formuleringar innehållande fettsyra (t.ex. oljesyra) och ytaktivt medel 43.Fettsyror syntetiseras till triglycerider före införlivande i intestinala lymf lipoproteiner och detta kräver en källa till komponenter för att bilda glycerolhuvudkedjan av triglycerid (dvs 2-monoglycerid eller glycerol-3-fosfat). Detta tyder på att administrering av fettsyror i avsaknad av en glycerolkälla kan leda till minskad lymfatiska transporter. Administration av fettsyra, dock möjliggör direkt beräkning av bidraget från den exogena administrerade fettsyra och endogena lipider till lymfatiska lipid och läkemedelstransport 43. Dessutom är 2-monoglycerid dyra och allmänt instabilt eftersom det lätt isomerises till 1-monoglycerid som digereras till glycerol i intestinala lumen. I de studier som rapporteras här vi vidare visa att lymfatiska lipid och läkemedelstransport är ekvivalent efter administrering av modelläkemedlet halofantrin med en fettsyra (t.ex. oljesyra) och ytaktivt medel (gallsalt) formulering i antingen presence eller frånvaro av glycerolkälla 2-monoolein (tabell 1). Endogena källor av glycerol tycks således tillräckligt för att stödja motsvarande lymfflöde och lipid och läkemedelstransport efter administrering av denna modelläkemedlet med fettsyror (t.ex. oljesyra) i frånvaro av en glycerolkälla. Detta ger förtroende för att representativa lymfatiska transportdata kan erhållas med enkla fettsyra formuleringar.

Den nedsövda modellen lätt utsträckas till en medveten modell när så erfordras. I de medvetna modellerna formuleringar kan sondmatades direkt in i magen eller infunderas i tolvfingertarmen eller intravenöst, kan direkta jämförelser göras till farmakokinetiska studier som utförts i icke-lymfa kanyl medvetna djur och resultaten kan anses vara mer fysiologiskt relevant. Ju längre tid tillåts i medvetna djur har också den fördelen att den samling av mer kompletta farmakokinetiska profiler för drug koncentrationer i blodet, medan det i sövda experiment, blodprofiler ofta ofullständiga, särskilt för långa halveringstid droger. Som beskrivits ovan, dock är framgång för medvetna lymfan kanyl studier lägre och försök ta längre tid att slutföra. Det finns två typer av medvetna lymfa kanyle modeller som beskrivs i litteraturen. I medvetna återhållna modeller 15, efter lymfan kanyle kirurgi, är djuret helt enkelt vrids på sin främre och placeras i en lämplig fasthållningsanordning för återstoden av experimentet med lymfan kanylen externalis och införd i ett uppsamlingsrör. Djuret får sedan återfå medvetandet och återhämta sig från det kirurgiska ingreppet O / N. Framgången med denna modell är mycket bra i händerna på erfarna operatörer, men det kan vara svårt att få etik klartecken att hålla djur för längre tid som krävs för lymfan samling. En alternativ modell är där lymfan samlasfrån medvetna och fritt rörliga råttor. Denna modell har detaljerade tidigare 25. I denna modell långa kanyler sätts in i kröslymfknutor kanalen, tolvfingertarmen och halspulsådern. Kanylerna sedan tunnlas under huden, exterioriserades vid halsens baksida och placeras genom ett vridbart system. Råttan placeras i en sele fäst till den vridbara och tilläts återfå medvetandet och för att återhämta sig från det kirurgiska ingreppet O / N. Djuret har fri rörlighet inom en metabolisk bur och lymfa och blodprover kan samlas in från kanyler externalise utanför buren.

Kröslymfknutor kanyle förblir det enda verktyg som möjliggör direkt utvärdering av lymfan komponenter i sitt gryende tillstånd. Lymfa kanyle beskrivs oftast hos råttor som operationen är mindre komplex än mindre och stora djur, modellen billigare än stora djur och resultatet visas någorlunda jämförbara mellan arter 27. Läget råttal kan modifieras efter experimentell behov och framgången är hög i händerna på erfarna operatörer. Modellen kan också kopplas till andra in vitro eller in vivo-studier för att undersöka, i detalj, metabolismen eller funktionen av intestinala lymfa komponenter. När etablerade den kröslymfknutor kanyl råttmodell är alltså ett kraftfullt verktyg för att utvärdera koncentrationen, transporter, funktion och metabolism av olika parametrar som passerar direkt från tarmen till lymfsystemet (och i många fall flyter så småningom till den systemiska cirkulationen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124, (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77, (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362, (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21, (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27, (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4, (12), e8442 (2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7, (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92, (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60, (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261, (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6, (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27, (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42, (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33, (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89, (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50, (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24, (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30, (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35, (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64, (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69, (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90, (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16, (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17, (8), 086005 (2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24, (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821, (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20, (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9, (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40, (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103, (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61, (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26, (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272, (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22, (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78, (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102, (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101, (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80, (4), 196-200 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics