देखभाल के ग्लियोब्लास्टोमा मानक के संदर्भ में दत्तक थेरेपी के लिए कार टी कोशिकाओं की पीढ़ी

Immunology and Infection

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Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

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Abstract

Introduction

Glioblastoma (जीबीएम) सबसे आम प्राथमिक घातक ब्रेन ट्यूमर है और सदा ही घातक है। देखभाल कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी के गैर विशिष्ट मानक के साथ युग्मित शल्य लकीर पूरी तरह से इस रोग एक साथ रोगियों में कम से कम 15 महीने की एक निराशाजनक रोग का निदान, जिसके परिणामस्वरूप में घातक कोशिकाओं को खत्म करने में विफल रहता है। इसके विपरीत, immunotherapy के लिए विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक सटीक तरीका प्रदान करता है, और इस तरह जमानत के विषाक्तता 2-4 की कम जोखिम के साथ एक अत्यधिक प्रभावी उपचार के मंच के रूप में काम करने की क्षमता है। टी कोशिकाओं चिमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर्स (कार) ट्यूमर प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए एक बहुमुखी रणनीति की पेशकश को व्यक्त करने के पूर्व vivo इंजीनियर। सीएआर परिसर में एक पूरी लंबाई की प्रमुख उतक अनुरूपता के एवज में एक या एक से अधिक इंट्रासेल्युलर टी सेल संकेत अणु (एस) के साथ एक एंटीबॉडी का बाह्य चर क्षेत्र fusing द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं (एमएचसी) टी सेल रिसेप्टर 5 -restricted। एंटीबॉडी की तरह प्रतिजन सम्मान की यह विधाप्रतिक्रियाशील प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को समझते हैं और एमएचसी के अभाव में ट्यूमर एंटीजन का जवाब और एक लगभग अनंत प्रतिजन प्रदर्शनों की सूची के लिए अनुकूलित किया जा सकता करने के लिए पर अनुमति देता है।

ट्यूमर एंटीजन की एक किस्म के खिलाफ इंजीनियर कार टी कोशिकाओं क्लिनिक 6-9 में पूर्व नैदानिक ​​प्रभावकारिता और बकाया वादा दिखाया है। विशेष रूप से, जीबीएम के संदर्भ में, एक कार टी सेल मंच को लक्षित epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर संस्करण तृतीय (EGFRvIII), एक ट्यूमर विशेष उत्परिवर्तन कोशिका की सतह पर 10 व्यक्त की, तंत्रिकाबंधार्बुद असर चूहों 11 में अस्तित्व को लम्बा करने के लिए दिखाया गया था। उनकी बहुमुखी प्रतिभा के बावजूद, हालांकि, कार दत्तक चिकित्सा के नैदानिक ​​लाभ पूरी तरह से कारण ट्यूमर जुड़े प्रतिरक्षादमन और प्रतिरक्षा चोरी 12-16 के रूप में अच्छी तरह से स्थापित करने और इन विवो में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को बनाए रखने में चुनौतियों का सामना करने के हिस्से में महसूस नहीं किया गया है। Immunotherapy के साथ देखभाल (समाज) के मानक का इस्तेमाल संभावित इन एल के कई दूर कर सकते हैंनकल, दोनों पूर्व नैदानिक ​​और नैदानिक ​​सेटिंग में बढ़ाया प्रभावकारिता में जिसके परिणामस्वरूप।

के बाद लकीर जीबीएम के लिए समाज के उच्च खुराक temozolomide (TMZ), एक डीएनए क्षारीकरण एजेंट 17, और पूरे मस्तिष्क विकिरण (WBI) के होते हैं 1। इन उपचार ट्यूमर एमएचसी अभिव्यक्ति 18-20 की upregulation और मृत ट्यूमर कोशिकाओं 17,19,21,22 द्वारा एंटीजन के छप्पर के माध्यम से ट्यूमर टीकों के साथ तालमेल कायम करने के लिए माना जाता है। दरअसल, पूर्व नैदानिक ​​सेटिंग में प्रतिरक्षा आधारित उपचार के लिए बढ़ाया अर्बुदरोधी प्रभावकारिता को TMZ 20,23 या WBI 18,24 सुराग के अलावा। इसके अलावा, कई गैर विशिष्ट साइटोटोक्सिक केमोथेरापी तरह, TMZ दत्तक चिकित्सा प्लेटफार्मों 27-29 के लिए मेजबान कंडीशनिंग के एक साधन के रूप में leveraged किया जा सकता है, जो प्रणालीगत lymphopenia 25,26, पैदा करने के लिए जाना जाता है। TMZ की मध्यस्थता lymphodepletion एक adop की वृद्धि की प्रभावकारिता के लिए अग्रणी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की आवृत्ति और समारोह को बढ़ाने के लिए दिखाया गया हैintracranial ट्यूमर 30 के खिलाफ सक्रिय चिकित्सा मंच। कार चिकित्सा के संदर्भ में, lymphodepletion दोनों इस प्रकार अर्बुदरोधी गतिविधि 11,34 बढ़ाने, अंतर्जात शमन टी कोशिकाओं 31 की संख्या को कम करने, और साइटोकिन्स 33 के लिए कम प्रतियोगिता के माध्यम से समस्थिति प्रसार 32 उत्प्रेरण द्वारा मेजबान कंडीशनिंग के एक साधन के रूप में कार्य करता है। समाज के संदर्भ में उपन्यास दत्तक चिकित्सा और टीका प्लेटफार्मों का मूल्यांकन प्रभावकारिता के बारे में सार्थक निष्कर्ष ड्राइंग के लिए महत्वपूर्ण है, जीबीएम समाज और immunotherapy प्लेटफार्मों के बीच synergistic संबंध को देखते हुए।

इस प्रोटोकॉल में, हम EGFRvIII पॉजिटिव intracranial ट्यूमर (उपचार समय के लिए चित्रा 1 देखें) असर चूहों में TMZ और WBI साथ murine EGFRvIII-विशिष्ट कार टी कोशिकाओं की पीढ़ी और नसों में प्रशासन के लिए एक विधि रूपरेखा। संक्षेप में, कार टी कोशिकाओं रेट्रोवायरल पारगमन द्वारा पूर्व vivo बना रहे हैं। मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं तो काटा और समानांतर में सुसंस्कृत हैं कि सक्रिय murine splenocytes transduce करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो वायरस, निर्माण करने के लिए (कार वेक्टर और PCL-पारिस्थितिकी प्लास्मिड युक्त) एक डीएनए / लिपिड जटिल का उपयोग कर ट्रांसफ़ेक्ट हैं। कार पीढ़ी के दौरान, EGFRvIII पॉजिटिव intracranial ट्यूमर असर murine मेजबानों नैदानिक ​​समाज के लिए तुलनीय खुराक पर fractionated पूरे मस्तिष्क एक्स-रे विकिरण और प्रणालीगत TMZ उपचार प्रशासित रहे हैं। कार टी कोशिकाओं तो lymphodepleted मेजबानों को नसों के द्वारा दिया जाता है।

निम्नलिखित प्रक्रिया सात अलग चरणों में वर्णित है: ट्यूमर असर, ट्यूमर असर चूहों की (2) पूरे दिमाग विकिरण, चूहों (3) अभिकर्मक के लिए Temozolomide (1) प्रशासन, (4) splenectomy और टी सेल तैयार करना, (5 ट्यूमर असर चूहों को (6) कार टी सेल संस्कृति और हार्वेस्ट, और (7) कार टी सेल प्रशासन) पारगमन,। इन चरणों को 6-7 दिनों की अवधि और समवर्ती प्रदर्शन कर रहे हैं कि कई कदम से मिलकर बनता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल 10 चूहों 10 7 कार टी कोशिकाओं से प्रत्येक के साथ व्यवहार कर रहे हैं, जहां एक प्रयोगात्मक डिजाइन पर आधारित है। यह 10 8 कार टी कोशिकाओं की जरूरत होगी कि इसका मतलब है; उपज व्यवहार्यता में नुकसान के लिए खाते में 5 10 x 7 -1 एक्स 10 8 द्वारा overestimated किया जाना चाहिए। निम्नलिखित प्रोटोकॉल लगभग 200 x 10 6 कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए बढ़ाया गया है। कोशिकाओं तो मौजूदा KR158B तारिकाकोशिकार्बुद या B16 मेलेनोमा सेल लाइनों से विकसित की है, नौ दिन स्थापित syngeneic EGFRvIII पॉजिटिव intracranial ट्यूमर के साथ महिला C57BL / 6 चूहों को नसों के द्वारा प्रशासित रहे हैं। समन्वित रूप से कार टी सेल पीढ़ी के साथ, ट्यूमर असर चूहों lymphodepletive TMZ (60 मिलीग्राम / किग्रा) और WBI (16.5 Gy) के नैदानिक ​​प्रासंगिक खुराक प्रशासित रहे हैं।

चूहे बनाए रखा और ड्यूक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (DUMC) में रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत नस्ल थे। सभी पशु प्रयोगों ड्यूक विश्वविद्यालय संस्था द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गयाअल पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC)।

ट्यूमर असर चूहों को Temozolomide 1. प्रशासन

दिन के माध्यम से 4 0:

  1. चूहों की कुल संख्या इंजेक्शन जा गणना और बाहर छलकते (16.5 मिलीलीटर TMZ के लिए खाते में (उदाहरण के लिए, 30 चूहों एक्स 0.5 मिलीलीटर = 15 मिलीलीटर TMZ) की जरूरत TMZ के समाधान की मात्रा निर्धारित करने और इस मात्रा को 1.5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए 0.5 से इस गुणा )।
  2. 3 मिलीग्राम से इस कुल मात्रा गुणा / एमएल की जरूरत lyophilized TMZ का वजन निर्धारित करने के लिए (जैसे, 16.5 एक्स 3 = 49.5 मिलीग्राम TMZ)। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में इस वजन।
    चेतावनी: TMZ साँस लेना, घूस, और आंखों, त्वचा के साथ संपर्क है, और श्लैष्मिक झिल्लियों से विषैला होता है। जोखिम के जोखिम को कम करने पर सिफारिशों के लिए संस्था की व्यावसायिक सुरक्षा और / या पर्यावरणीय स्वास्थ्य और कल्याण विभाग के साथ परामर्श करें।
  3. डाइमिथाइल sulfoxide की मात्रा निर्धारित करने के लिए 0.15 से कुल मात्रा गुणा (DMSO) (उदाहरण के लिए, 16.5 X जरूरत0.15 = 2.475 मिलीलीटर DMSO)। फिल्टर एक बाँझ ट्यूब में एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से DMSO के इस खंड (प्लस बाहर छलकते के लिए खाते में एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर) बाँझ। TMZ पाउडर बाँझ DMSO के 2.475 एमएल जोड़ें।
  4. 10-15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर पानी की एक बीकर में TMZ / DMSO के समाधान रखें। TMZ के लिए पूरी तरह से भंग हो जाने के बाद, समाधान रंग में हल्के पीले हो जाना चाहिए; समाधान गुलाबी हो जाता है, तो TMZ अपमानित किया जाता है, और एक नए समाधान TMZ के एक ताजा बहुत कुछ के साथ तैयार रहना चाहिए।
  5. कुल मात्रा (0.85 एक्स 16.5 मिलीलीटर = 14.025 मिलीलीटर खारा) द्वारा 0.85 गुणा करके जरूरत बाँझ खारा की उचित मात्रा की गणना। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार बाँझ खारा के 15 मिलीलीटर जोड़ें। TMZ DMSO के 65 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी खारा में भंग कर रहा है।
  6. भंवर TMZ / DMSO के समाधान TMZ पाउडर पूरी तरह से भंग कर दिया है और धीरे धीरे TMZ / DMSO के समाधान के लिए गरम खारा से जोड़ रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए।
  7. तुरंत तैयार होने के बाद, पूरी तरह से 15 एक्स 1 मिलीलीटर टुबरकुलीन syring लोडचार दिन की स्थापना ट्यूमर असर चूहों के लिए प्रशासन के लिए TMZ के समाधान के साथ तों।
  8. पांच TMZ प्रशासन की कुल के लिए 4 के माध्यम से दिन के 1 पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ।

ट्यूमर असर चूहों की 2. पूरे दिमाग किरणन

दिन 4 में से 2:

  1. एक्स-रे irradiator पर पावर और यह वार्म अप करने के लिए पूर्ण वोल्टेज के लिए अनुमति देते हैं। उपयुक्त फिल्टर जगह और इनपुट उचित वोल्टेज और वर्तमान सेटिंग्स (2A चित्रा) में है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: irradiator की dosimetry वोल्टेज सेटिंग और ग्रिड लेआउट (2A चित्रा, बी) उचित निर्धारण करने के लिए पहले से स्थापित किया जाना चाहिए।
  2. 5.5 Gy के एक्स-रे विकिरण में परिणाम के लिए जरूरी है कि समय की लंबाई की गणना। एक्स-रे दो Gy / मिनट की दर से वितरित कर रहे हैं, तो उदाहरण के लिए, तो 2.75 मिनट 5.5 Gy की कुल वितरित करने के लिए आवश्यक है। इनपुट उचित समय अवधि।
    नोट: तालिका 2 माउस WBI एक खुराक प्रदान करता हैमानव में एन डी उनके नैदानिक ​​समकक्ष। उच्च ग्रेड gliomas के संदर्भ में, 60 Gy के WBI (6 सप्ताह के लिए दो Gy के भिन्न, 5 दिन / सप्ताह) fractionated देखभाल के नैदानिक ​​मानक है, और यहां इस्तेमाल murine बराबर 16.5 Gy (Gy के एक्स 3 5.5) है।
  3. 2 मिलीलीटर ketamine और अंतिम समाधान 10 मिलीग्राम / एमएल ketamine और 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine है कि इस तरह के एक मिलीलीटर xylazine मिलीलीटर से 17 खारा जोड़कर प्रणालीगत संज्ञाहरण के लिए ketamine / xylazine की एक ताजा समाधान तैयार है।
  4. चूहों का वजन और जानवरों 100 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine पर ketamine की एक खुराक प्राप्त ऐसी है कि शरीर के वजन के प्रति ग्राम intraperitoneally ketamine / xylazine के 10 μl प्रशासन। चूहे पूरी तरह से बेहोश और दिख ketamine / xylazine प्रशासन के दो मिनट के भीतर साँस लेने में किया जाना चाहिए।
  5. बेहोश पशुओं में नेत्र नमी बनाए रखने के लिए, धीरे हर आंख पर कृत्रिम आँसू मरहम की एक छोटी राशि रगड़ें।
  6. सिर में उच्चतम एक्स-रे प्राप्त करता है उस क्षेत्र में तैनात कर रहे हैं कि इस तरह के ग्रिड पर बेहोश चूहों रखेंशर्मंदगी (चित्रा 2B, सी)। नीचे उचित साथ गर्दन से शील्ड निकायों प्रणालीगत एक्स-रे वितरण (चित्रा 2 डी) ब्लॉक करने के लिए नेतृत्व ट्यूबिंग आकार।
  7. ग्रिड लेआउट पर एक्स-रे किरण का केन्द्र बिन्दु denoting लेजर समन्वय (0,0) पर है कि इस तरह के एक्स-रे किरण के तहत तैनात चूहों रखें। एक्स-रे वितरण शुरू करो।
  8. एक्स-रे प्रसव पूर्ण होने पर, एक गर्म हीटिंग पैड पर irradiator और जगह से जानवरों को हटा दें। जानवरों sternal लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक होश में जानवरों के साथ बेहोश जानवरों को घर मत करो। पशु, sternal लेटना बनाए रखने के वापस उनके उपयुक्त पिंजरों में होश में जानवरों जगह कर सकते हैं एक बार।
  9. विकिरण के तीन fractionated खुराक की कुल के लिए दिन के 3 और 4 पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ।

3. अभिकर्मक

पहला दिन:

  1. है Dulbecco एम के 500 मिलीलीटर के लिए 50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जोड़कर D10 मीडिया को तैयारodified ईगल मध्यम (DMEM)।
  2. 500 एमएल RPMI-1640 मीडिया के लिए 5.5 मिलीलीटर एल Glutamine, 5.5 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट, 5.5 मिलीलीटर गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, और 5.5 मिलीलीटर pencillin / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) जोड़कर टी सेल मीडिया (टीसीएम) तैयार करें। अगला, 2-मर्केप्टोइथेनाल और 550 μl जेंटामाइसिन के 550 μl जोड़ें। अंत में, 50 मिलीलीटर FBS के जोड़ें।
  3. फसल में इन विट्रो सुसंस्कृत HEK293T कोशिकाओं और D10 के मीडिया में 7.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए ले आओ।
  4. प्लेट 10 मिलीलीटर D10 मीडिया और 16 x 10 सेमी पाली डी lysine (पीडीएल) लेपित प्लेटों में से प्रत्येक में HEK293T सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।

दिवस 0:

  1. कोशिकाओं transfecting से पहले 10 मिलीलीटर ताजा D10 के कम से कम 30 मिनट के साथ मीडिया की जगह।
  2. +1 (= 17 16 + 1) 14.1 माइक्रोग्राम प्रति द्वारा प्लेटों की कुल संख्या गुणा करके अभिकर्मक के लिए आवश्यक वेक्टर प्लाज्मिड की राशि, PCL-पारिस्थितिकी वेक्टर, और लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक का निर्धारण करते हैंवेक्टर प्लाज्मिड (14.1 x 17 = 239.7 माइक्रोग्राम प्रति), 9.9 माइक्रोग्राम प्रति PCL-पारिस्थितिकी वेक्टर (9.9 x 17 = 168.3 माइक्रोग्राम प्रति), और 60 μl लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक (60 x 17 = 1020 μl)। सभी अभिकर्मकों समाधान तैयार करने से पहले कमरे के तापमान पर होना चाहिए।
  3. , ट्यूब एक में दो ट्यूबों ए और बी लेबल 239.7 माइक्रोग्राम प्रति वेक्टर प्लाज्मिड और (1.5 एक्स 17) को 168.3 माइक्रोग्राम प्रति PCL-पारिस्थितिकी वेक्टर जोड़ने कम सीरम ईगल मध्यम (राज्यसभा सदस्य) संशोधित एमएल। ट्यूब बी में, (1.5 एक्स 17) मिलीलीटर रुपये सदस्य को 1020 μl लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अलग से ए और बी सेते हैं।
  5. (1-2 सेकंड के लिए भंवर या कई बार पलटना) धीरे एक साथ ए और बी मिक्स और लिपिड / डीएनए जटिल प्रपत्र कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. 10 सेमी डिश में HEK293T कोशिकाओं के लिए बुद्धिमान लिपिड / डीएनए जटिल बूंद जोड़ें।
  7. 6-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं या रात (24 घंटा से अधिक नहीं है)।
  8. 6-8 घंटा ऊष्मायन के बाद, वायरल उत्पादन के लिए नए सिरे से टीसीएम के 12 मिलीलीटर के साथ मध्यम बदलें। यह मीडिया चढ़ायाटी सेल पारगमन के लिए वायरल सतह पर तैरनेवाला के रूप में दिन 2 पर इस्तेमाल किया जाएगा।

4. splenectomy और टी सेल तैयार

दिवस 0:

  1. तिल्ली संग्रह के लिए बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार और जगह में टीसीएम के 10 एमएल डालो।
  2. सीओ 2 asphyxiation और माध्यमिक कत्ल द्वारा जानवरों की उपयुक्त संख्या बलिदान: जगह जानवरों पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन के दिशा निर्देशों (अधिक से अधिक 5 जानवरों किया जा सकता है प्रति 10-30% पिंजरे मात्रा / मिनट के प्रवाह की दर, कम से सीओ 2 को प्राप्त करने के एक पिंजरे में श्वसन समाप्त जब तक और उसके बाद दो मिनट के लिए) एक साथ बलिदान कर दिया। सीओ 2 चैम्बर से जानवरों निकालें और सिर काटना।
    नोट: लगभग 4.5-5 10 x 7 splenocytes निकलेगा एक 6-12 सप्ताह पुराने महिला C57BL 6 / माउस के एक तिल्ली। इधर, चार spleens लगभग 200 x 10 6 कोशिकाओं के लिए काटा किया जाएगा।
  3. इसके दाईं ओर का सामना करना पड़ रहा है कि इस तरह के माउस रखे, और70% इथेनॉल के साथ स्प्रे। संदंश के साथ, बाएं ribcage के नीचे त्वचा की एक पतली गुना हड़पने के लिए और कैंची के साथ एक मामूली सा चीरा काट दिया। पील वापस त्वचा, ध्यान से संदंश के साथ पेरिटोनियम की एक पतली गुना ले लो, और एक छोटे से गुहा काटा।
  4. तिल्ली एक चपटी सेम जैसा दिखता है कि एक छोटी सी, लम्बी, गहरे लाल अंग है; नाजुक आसपास के संयोजी ऊतक दूर काटने से संदंश और उत्पाद शुल्क के साथ तिल्ली हासिल किया है। बर्फ पर टीसीएम के 10 मिलीलीटर युक्त शंक्वाकार में excised spleens रखें।
  5. एक 70 माइक्रोन जाल सेल छलनी पर spleens डालो और एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के अंदर की कुंद अंत के साथ mashing द्वारा disaggregate। दो spleens की एक अधिकतम जाल छलनी प्रति disaggregated किया जाना चाहिए।
  6. ध्यान से किसी भी शेष splenocytes इकट्ठा करने के लिए disaggregation निम्नलिखित झरनी धोने के लिए टीसीएम की एक छोटी मात्रा का प्रयोग करें। एक एकल कोशिका निलंबन में सभी disaggregated spleens पूल। एक धोने के लिए एक टीसीएम के साथ 50 मिलीलीटर अंतिम मात्रा लाओ10 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन चाहते हैं।
  7. 5 मिलीलीटर 10x lysis बफर से 45 मिलीलीटर बाँझ पानी जोड़कर 1x lysis बफर के समाधान तैयार है। धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण लाल रक्त कोशिकाओं, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में तिल्ली प्रति 1x lysis बफर के 5 मिलीलीटर में resuspend गोली, को समाप्त करने के लिए। 5 spleens से अधिक है, तो एक 250 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग करें। 5 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शंक्वाकार या अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें।
  8. पानी के स्नान से सेल प्रतिक्रिया निकालें और एक एक पर टीसीएम जोड़ें: प्रतिक्रिया बेअसर करने के लिए lysis बफर के साथ एक अनुपात। 10 मिनट के लिए 300 XG पर कताई द्वारा धो लें।
  9. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा टीसीएम में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और पूरी तरह से resuspend गोली (2 मिलीग्राम / तिल्ली, 4 spleens के लिए 8 मिलीलीटर कुल)।
  10. 190 μl trypan नीले (01:20 कमजोर पड़ने) के लिए सेल निलंबन के 10 μl जोड़कर कोशिकाओं की गणना। कुल सेल नंबर प्राप्त करने के लिए 20 एक्स 10 4 एक्स कुल मात्रा (8 मिलीग्राम) द्वारा चार gridded वर्गों में से एक में प्राप्त संख्या गुणा (जैसे, 125 कोशिकाओं x 20 x 10 4 6 splenocytes)।
  11. 2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / concanavalin ए (ConA) और 50 आइयू / एमएल पुनः संयोजक मानव इंटरल्यूकिन -2 (rhIL-2) के साथ पूरक टीसीएम में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता, कोशिकाओं पतला। इस प्रकार, 200 एक्स 10 6 splenocytes के लिए, 8 मिलीलीटर कोशिकाओं, 200 माइक्रोग्राम प्रति ConA, और 5000 आइयू rhIL-2 के लिए 92 एमएल मीडिया जोड़ें।
  12. 4 x 10 6 कोशिकाओं में अच्छी तरह से प्रत्येक में हैं कि इस तरह के, 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति में इलाज प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 2 एमएल कोशिकाओं जोड़ें (उदाहरण के लिए, कोशिकाओं की 100 मिलीलीटर लगभग चार प्लेटों की आवश्यकता होगी)।
  13. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।

5. पारगमन

पहला दिन:

  1. गैर टिशू कल्चर की संख्या दो से काटा spleens की संख्या (8 प्लेटें 4 spleens के लिए आवश्यक हैं) गुणा करके पारगमन के लिए आवश्यक 24 अच्छी तरह प्लेटों में इलाज की गणना।
  2. इसके बाद, पुनः संयोजक मानव फ़ाइब्रोनेक्टिन टुकड़ा (RHFF) समाधान के लिए आवश्यक मात्रा की गणनागुणा करके कोट प्लेटों के लिए आवश्यक (कुओं की कुल संख्या + 3) 0.5 मिलीलीटर एक्स (8 प्लेटें एक्स 24 कुओं = 192 + 3 = 195) 0.5 मिलीलीटर = 97.5 मिलीलीटर एक्स।
  3. 25 माइक्रोग्राम प्रति (97.5 x 25 = 2437.5 माइक्रोग्राम प्रति) द्वारा कुल मात्रा से गुणा करके 25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की एकाग्रता में RHFF युक्त 97.5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें। 97.5 मिलीलीटर पीबीएस को RHFF की इस राशि में जोड़ें।
  4. कोट गैर टिशू कल्चर अच्छी तरह से प्रति 0.5 मिलीलीटर पीबीएस / RHFF समाधान जोड़कर 24 अच्छी तरह से प्लेटों का इलाज किया।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।

दूसरा दिन:

  1. गैर टिशू कल्चर से पीबीएस / RHFF समाधान डंप 24 अच्छी तरह से प्लेटों का इलाज किया।
  2. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  3. मजबूती से थाली upending द्वारा बीएसए निकालें। 2 मिलीलीटर पीबीएस जोड़कर धो लें।
  4. एक 250 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रत्येक HEK293T पीडीएल थाली से मीडिया के हस्तांतरण से वायरल सतह पर तैरनेवाला लीजिए और 500 x जी पर 10 मिनट के स्पिन।
  5. ध्यान से वायरल सु हस्तांतरणयकीन गठन हो सकता है कि सेल गोली परेशान नहीं किया जा रहा है, एक ताजा 250 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में pernatant।
  6. अंतिम मात्रा RHFF लेपित कुओं के लिए आवश्यक राशि से 3 मिलीग्राम अधिक है कि इस तरह के वायरल सतह पर तैरनेवाला के लिए ताजा टीसीएम जोड़ें। उदाहरण के लिए, 192 RHFF लेपित कुओं के लिए, 192 + 3 मिलीलीटर = 195 मिलीलीटर वायरल सतह पर तैरनेवाला की मात्रा लाने के लिए।
  7. 3 बार प्रत्येक में अच्छी तरह से - धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 2 इनक्यूबेटर और resuspend से सुसंस्कृत splenocytes निकालें। एक 250 मिलीलीटर शंक्वाकार पर स्थानांतरण। इस चरण में तेजी लाने में मदद मिलेगी हस्तांतरण करने से पहले एक बाँझ जलाशय का उपयोग करते हुए, एक multichannel विंदुक का उपयोग करते हैं। के रूप में पहले 10 मिनट के लिए 300 XG पर वर्णित और स्पिन गणना।
  8. RhIL -2 जोड़ें वायरल सतह पर तैरनेवाला 50 आइयू / एमएल की एकाग्रता में। उदाहरण के लिए, जोड़ने के लिए 50 एक्स 195 = 9750 आइयू वायरल सतह पर तैरनेवाला की 195 मिलीलीटर-2 rhIL।
  9. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर वायरल सतह पर तैरनेवाला में splenocytes Resuspend
  10. RHFF लेपित 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए / अच्छी तरह से splenocyte निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  11. निम्नलिखित सेटिंग्स के अनुसार 90 मिनट के लिए स्पिन: 770 XG, त्वरण = 4, ब्रेक / मंदी = 0, 32 डिग्री सेल्सियस।
  12. 50 आइयू / एमएल rhIL-2 के साथ एक टीसीएम समाधान तैयार है। उदाहरण के लिए, 10,000 आइयू rhIL-2 जोड़कर एक 200 टीसीएम समाधान तैयार है। Centrifugation के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए rhIL-2 / टीसीएम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  13. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृति।

6. कार टी सेल संस्कृति और हार्वेस्ट

दिन 3 और 4:

  1. टी कोशिकाओं> 80% संगम को प्राप्त करते हैं, तो कोशिकाओं (यह आमतौर पर दिन में 3 या 4 दिन से होता है) विभाजित किया जा सकता है। कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, धीरे से ऊपर pipet और प्रत्येक अच्छी तरह से 2-3 बार में नीचे, और एक ताजा 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति में इलाज थाली के नए कुओं में अच्छी तरह से प्रत्येक से 1 मिलीलीटर चाल है। फिर, अंतिम मात्रा सभी कुओं में 2 मिलीलीटर है कि प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 आइयू / एमएल आईएल -2 के साथ नए सिरे टीसीएम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. कोशिकाओं> 80% संगम तक पहुँच नहीं है, तो धीरे-धीरे प्रत्येक के ऊपर से मीडिया के 1 मिलीलीटर बंद pipetting अच्छी तरह से एक आधा मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं। डी बचेंमीडिया को हटाने जबकि तल पर बसे कोशिकाओं isturbing। RhIL-2 मिलीलीटर 50 आइयू / युक्त ताजा टीसीएम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।

दिन 5:

  1. एक 250 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब resuspend कार टी धीरे से ऊपर pipetting द्वारा कोशिकाओं और अच्छी तरह से प्रत्येक में नीचे तीन बार और हस्तांतरण। 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
  2. गोली परेशान बिना पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला Aspirate। एक दूसरी बार पहले से वर्णित के रूप में कोशिकाओं की गिनती, और पीबीएस के साथ धोने, पीबीएस के साथ एक बार धो लें। एक ठेठ कार टी सेल उपज अच्छी तरह से प्रति लगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं (8 प्लेटें एक्स 24 कुओं = 192 एक्स 10 6 कार टी कोशिकाओं) है।
  3. 200 माइक्रोग्राम प्रति की मात्रा में एक 10 x 7 का एक इंजेक्शन के लिए 5 10 x 7 / एमएल की एकाग्रता में पीबीएस में Resuspend कोशिकाओं (जैसे, 192 एक्स 10 6 कार टी कोशिकाओं के लिए, resuspend के 3.84 मिलीलीटर पीबीएस में गोली धोया)।

ट्यूमर असर चूहों को 7. कार टी सेल प्रशासन

दिन 5:

  1. परिवहननसों में इंजेक्शन के लिए जानवरों की सुविधा के लिए बर्फ पर आर टी कोशिकाओं। लोड 27 से इंसुलिन सिरिंज में 500-1,000 μl - सभी बुलबुले निष्कासित कर दिया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए 31 जी सुई,।
  2. पूंछ के आधार पर एक माउस को पकड़ो और ट्यूब restrainer में जगह है।
  3. नस ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ तना हुआ पूंछ खींच लें, और यह पूंछ नस के समानांतर डालने से नस में सुई त्वचा के नीचे लगभग 1-2 मिमी सरकना। धीरे-नस में 200 μl निष्कासित। सुई सही ढंग से नस में डाला जाता है, तो मात्रा में आसानी से बहेगा; अन्यथा वहाँ प्रतिरोध किया जाएगा और सुई पूंछ से हटा दिया जाना चाहिए और सही ढंग से डाला रहे हैं की आवश्यकता होगी।

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Representative Results

कार टी कोशिकाओं EGFRvIII कार रेट्रोवायरल वेक्टर 11 के साथ पारगमन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। इस वेक्टर, MSGV1, murine स्टेम सेल वायरस (MSCV) लंबे टर्मिनल दोहराता है, विस्तारित झूठ क्षेत्र और लिफाफा ब्याह साइट शामिल है जो SFGtcLuc_ITE4 वेक्टर 35, से विकसित (ब्याह दाता, एसडी, और स्वीकर्ता ब्याह, एसए), और वायरल गया था पैकेजिंग संकेत (ψ)। Murine CD8TM के साथ मिलकर में मानव विरोधी EGFRvIII एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) 139, युक्त EGFRvIII कार, CD28, 4-1BB, और CD3ζ इंट्रासेल्युलर क्षेत्रों, नीचे की ओर रेट्रोवायरल वेक्टर NcoI साइट में क्लोन किया गया था (चित्रा 3)

पारगमन के बाद, कार टी कोशिकाओं मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और प्रवाह cytometry द्वारा phenotyped। EGFRvIII कार टी कोशिकाओं (एसए / पीई) एक streptavidin-phycoerythrin के शामिल एक 2-रंग पैनल के साथ देखे जा सकते हैं EGFRvIII व्युत्पन्न multimer और विरोधी CD3 FITC biotynlated संयुग्मित। संस्कृति और पारगमन prot का प्रयोगocols हम नियमित murine splenocytes (चित्रा -4 ए) 11 का 55-70% के बीच कार अभिव्यक्ति का निरीक्षण, यहाँ का वर्णन किया। वैकल्पिक रूप से, कारों को भी बकरी-विरोधी मानव एफ (अटल बिहारी ') का उपयोग कर अभिव्यक्ति के लिए दाग किया जा सकता है किया गया है, जो प्राथमिक 2-बायोटिन और एसए / पीई माध्यमिक एंटीबॉडी पहले से 36 में वर्णित है। कार टी कोशिकाओं आगे दो-रंग की कार पैनल के लिए अन्य fluorescently लेबल एंटीबॉडी के अलावा द्वारा phenotyped जा सकता है। उदाहरण के लिए, सीडी 8 और सीडी 4 के लिए धुंधला सीडी 4+ टी कोशिकाओं (4B चित्रा) कर रहे हैं 20%, जबकि transduced कारों के 70%, CD8 + टी कोशिकाओं रहे हैं कि पता चलता है। यह अभिव्यक्ति की प्रोफाइल के साथ कार टी कोशिकाओं को आसानी से मस्तिष्क के लिए यातायात और intracranial ट्यूमर के इलाज के लिए दिखाया गया है।

तालिका 1:। पशु वजन के आधार पर Temozolomide खुराक Temozolomide खुराक 60 मिलीग्राम / किग्रा की कुल खुराक के आधार पर गणना की गई।

शरीर का वजन आयतन
25 ग्राम 0.50 मिलीग्राम
0.48 मिलीग्राम
23 जी 0.46 मिलीग्राम
22 ग्राम 0.44 मिलीग्राम
21 जी 0.42 मिलीग्राम
20 ग्राम 0.40 मिलीग्राम
19 जी 0.38 मिलीग्राम
18 ग्राम 0.36 मिलीग्राम
17 जी 0.34 मिलीग्राम
16 जी 0.32 मिलीग्राम
15 ग्राम 0.30 मिलीग्राम
14 जी 0.28 मिलीग्राम
13 जी 0.26 मिलीग्राम
12 ग्राम 0.24 मिलीग्राम
11 जी 0.22 मिलीग्राम
डी # भागों बिस्तर समाज
16.5 5.5 3 62 जीबीएम
14 7 2 63 जीबीएम
20 4 5 60 जीबीएम
12 6 2 48 एलजीए
16 4 4 48 एलजीए
21 3 7 52.5 एलजीए
12 3 4 30 मिला
16 2 8 32 मिला

तालिका 2:। नैदानिक ​​प्रासंगिक जैविक रूप से बराबर विकिरण खुराक विकिरण खुराक बिस्तर पर हिसाब से गणना की गई है = डी [1 + डी / (α / β)], जहां डी = कुल खुराक, डी = fractionated खुराक, और α / β = 2)। murine होस्ट करने के लिए WBI के रूप में दिलाई कुल खुराक वें के संदर्भ में दिखाया गया हैई वितरित आंशिक खुराक और उन खुराक अंशों से मॉडलिंग की है कि मानव खुराक। मॉडल प्रयोजनों के लिए, बिस्तर देखभाल के मानक है, जिसके लिए द्रोह भी दिखाया गया है।

चित्र 1
चित्रा 1:। ट्यूमर असर चूहों के उपचार और देखभाल कीमोथेरेपी की समवर्ती पूर्व vivo कार पीढ़ी मानक और पूरे दिमाग विकिरण के लिए इस समय चार दिनों ट्यूमर आरोपण (ए) के बाद शुरू होता है। इस समय अंतराल के दौरान, कार टी कोशिकाओं उत्पन्न और सुसंस्कृत पूर्व vivo (बी) और मेजबान कंडीशनिंग का पूरा कोर्स करने के बाद दिया जाता है।

चित्र 2
चित्रा 2: लेआउट और विकिरण प्रसव के लिए सेटिंग्स।एक्स-रे वांछित खुराक (ए) के अनुसार चुना एक चर अवधि के साथ, 320 केवी और 10 मा के एक dosimetry के अनुसार वितरित कर रहे हैं। एक्स-रे विकिरण के फोकल क्षेत्र एक संकीर्ण 2.5 सेमी क्षेत्र है। (सी) एक्स-रे किरण के एक छोर से देखने से पता चलता है; बेहोश जानवरों को उनके सिर उच्चतम एक्स-रे तीव्रता के क्षेत्र में झूठ बोलते हैं कि इस तरह ग्रिड (बी) के अनुसार व्यवस्थित कर रहे हैं। लगभग चार जानवरों इस ग्रिड लेआउट (बी, डी) के अनुसार एक्स-रे प्रशासन के एक कोर्स के दौरान irradiator के तहत किया जा सकता है। लीड ट्यूबिंग WBI (डी) के लिए खुल ही उनके सिर छोड़ रहा है, शरीर को ढाल करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है।

चित्र तीन
चित्रा 3: संशोधित SFGtcLuc_ITE4 रेट्रोवायरल वेक्टर, MSGV1, कार टी कोशिकाओं के पारगमन और पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया था।Murine CD8TM, CD28, 4-1BB, और CD3ζ इंट्रासेल्युलर क्षेत्रों के साथ मिलकर में मानव विरोधी EGFRvIII एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) 139, युक्त EGFRvIII कार डालें, लीटर (murine स्टेम सेल वायरस (MSCV) लंबे टर्मिनल दोहराता द्वारा flanked है )। कार डालने के अपस्ट्रीम विस्तारित झूठ क्षेत्र और लिफाफा ब्याह साइट हैं (ब्याह दाता, एसडी, और स्वीकर्ता ब्याह, एसए), और वायरल पैकेजिंग संकेत (ψ)।

चित्रा 4
चित्रा 4:। EGFRvIII सीएआर टी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं पारगमन निम्नलिखित 48 घंटा, टी कोशिकाओं LEEKKGNYVVTDHC-कश्मीर (बायोटिन) -NH 2 / streptavidin के पीई से बना एक multimer का उपयोग कर EGFRvIII कारों की सतह अभिव्यक्ति के लिए दाग रहे थे। वही दाता से Untransduced टी कोशिकाओं को भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में दाग रहे थे। डाटा स्टेशन के लिए सकारात्मक कार टी कोशिकाओं (वाई अक्ष) की संख्या पता चलता हैअभिव्यक्ति 60.9% (ए) होना पाया गया था, जहां एक टी सेल मार्कर, के रूप में CD3 + कोशिकाओं पर gated पीई संयुग्मित EGFRvIII multimer (एक्स अक्ष) द्वारा ining। सीडी 4-PerCP-Cy5.5 और CD8-एपीसी के लिए दाग कार टी कोशिकाओं 21.7% और 70.9%, क्रमशः (बी) की अभिव्यक्ति प्रोफाइल दिखाने के लिए।

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Discussion

यहाँ वर्णित उपचार समय की देखभाल के नैदानिक ​​मानक मॉडल और कार दत्तक चिकित्सा के लिए अपने प्रभाव का लाभ उठाने के लिए डिजाइन किया गया था। कार टी सेल खुराक, TMZ परहेजों, और रेडियोथेरेपी प्रशासन विवो टी सेल गतिविधि, lymphodepletion, और ट्यूमर को मारने में वृद्धि करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। TMZ परहेजों मेजबान myeloablation और adoptively हस्तांतरित कोशिकाओं में 30 की वृद्धि हुई विस्तार उपज के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस प्रकार समाज की tumoricidal गुण circumventing, - (6 Gy 4) एकल अंश कुल शरीर विकिरण (TBI) इसके अलावा, TMZ के lymphodepletive प्रभाव कम खुराक से recapitulated जा सकता है। यहाँ लागू विकिरण आहार 60 Gy की एक जैविक रूप से बराबर खुराक mimics; हालांकि, भिन्न और आंशिक खुराक की संख्या अन्य चिकित्सीय खुराक (तालिका 2) की नकल करने देखते जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, समाज के हमारे मॉडल बाहरी बीम विकिरण ट्यूमर और एमए के लिए focally वितरित करने के बजाय, WBI की जैविक रूप से बराबर खुराक का इस्तेमालrgins, जैसा कि अक्सर क्लीनिक में उपयोग किया जाता है, और इस तरह के ट्यूमर के लिए दिया विकिरण के एक कम खुराक और स्वस्थ माउस मस्तिष्क को विषाक्तता का खतरा बढ़ पैदा हो सकती है। इन सीमाओं के बावजूद, तथापि, WBI एक पूर्व नैदानिक ​​सेटिंग में नैदानिक ​​रेडियोथेरेपी मॉडलिंग के लिए एक स्वीकृत तकनीक है।

कार टी सेल खुराक में वृद्धि हुई है या ट्यूमर को मारने और समग्र अस्तित्व पर 11 खुराक प्रभाव का पालन करने के लिए कम किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, उपचार और प्रसव के मार्ग के समय प्रभावकारिता में मतभेद देखने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कार टी कोशिकाओं ट्यूमर साइट पर गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए intracranially दिया जा सकता है। कार सकारात्मक टी कोशिकाओं की उपज पारगमन की क्षमता पर निर्भर करता है भिन्न हो सकते हैं। एक सफल पारगमन सुनिश्चित करने का एक तरीका यह प्रक्रिया भर में एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -control ले जाने से है। ऐसा करने के लिए, एक HEK293T 10 सेमी पीडीएल थाली रोड़ी के लिए टी कोशिकाओं की एक भी अच्छी तरह से GFP अभिकर्मक और पारगमन के लिए आवंटित किया जा सकता हैदिनों 3-5 पर GFP के लिए एन। पारगमन क्षमता में एक महत्वपूर्ण कारक वायरल सतह पर तैरनेवाला के अलावा पर टी सेल सक्रियण और प्रसार की हद तक है। हम संस्कृति के माध्यम से ConA के अलावा द्वारा हासिल की है जो टी सेल सक्रियण, के बारे में हमारी विधि के बीच एक महत्वपूर्ण विसंगति ध्यान दें, और कहा कि CD3 और CD28 एगोनिस्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के द्वारा प्राप्त नैदानिक ​​सेटिंग में इस्तेमाल किया। उत्तरार्द्ध नियमित तौर पर रोगी रेट्रोवायरल transduced कार टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है और यह भी murine टी कोशिकाओं के पारगमन में सफल रहा है हालांकि, हम पहले से ConA उत्तेजना बेहतर और अधिक सुसंगत transductions 37 के लिए नेतृत्व किया है कि निर्धारित। हम भी समग्र कार टी सेल उपज कदम 5.18 प्रदर्शन किया है जब के आधार पर भिन्न हो सकते हैं मनाया है। आप गरीब कार टी सेल उपज का अनुभव करते हैं, हम तुरंत कदम 5.17 के बजाय 5-6 घंटा ऊष्मायन के लिए प्रतीक्षा करने के बाद कदम 5.18 प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं। इस पारगमन की दक्षता को प्रभावित कर सकता है, हम महत्वपूर्ण अलग नहीं मनाया हैहमारे अध्ययन में कार की सतह अभिव्यक्ति में ferences।

पारगमन के बाद, कार टी कोशिकाओं मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और फ्लो द्वारा phenotyped; हम (एसए / पीई) एक streptavidin-phycoerythrin के शामिल एक 2-रंग पैनल के साथ हमारे EGFRvIII कार टी कोशिकाओं दाग EGFRvIII व्युत्पन्न multimer और विरोधी CD3 biotynlated संयुग्मित। वैकल्पिक रूप से, कारों को भी बकरी-विरोधी मानव एफ (अटल बिहारी ') का उपयोग कर अभिव्यक्ति के लिए दाग किया जा सकता है किया गया है, जो प्राथमिक 2-बायोटिन और एसए / पीई माध्यमिक एंटीबॉडी पहले से 36 में वर्णित है। हम नियमित murine splenocytes 11 के 55-70% के बीच कार अभिव्यक्ति निरीक्षण करते हैं। हम पहले से आसानी से मस्तिष्क के लिए यातायात और ट्यूमर का इलाज कर सकते हैं इस कार अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ टी कोशिकाओं की है कि प्रसव से पता चला है। TMZ- या TBI प्रेरित lymphopenia कार पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति और उनके समग्र अर्बुदरोधी प्रतिक्रिया में वृद्धि, adoptively हस्तांतरित कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार बढ़ाती है। कार टी कोशिकाओं को एक साथ परिधीय रक्त धुंधला द्वारा vivo में लगाया जा सकता हैppropriate टेट्रामर; इस समय और कार टी सेल समारोह और दृढ़ता पर मेजबान कंडीशनिंग के प्रभावों पर कार टी सेल अस्तित्व को समझने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। कोई टेट्रामर प्रतिजन रिसेप्टर के लिए उपलब्ध है, तो वैकल्पिक रूप से, एक फ्लोरोसेंट संवाददाता कार वेक्टर निर्माण में शामिल किया जा सकता है, या कार टी कोशिकाओं लेबल किया जा सकता पूर्व vivo Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर के साथ (CFSE) vivo में ट्रैकिंग के लिए प्रशासन के पहले।

ट्यूमर मॉडल, प्रतिरक्षा चिकित्सा मंच है, और समाज आहार पर निर्भर करता है, दत्तक चिकित्सा या टीकों के साथ प्रशासित नैदानिक ​​समाज विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। TMZ गैर विशिष्ट सेल हत्या की ओर जाता है कि एक डीएनए क्षारीकरण एजेंट है, और खुराक murine मेजबानों में वजन घटाने और रुग्णता में परिणाम कर सकते तेज हो गया। उच्च खुराक और WBI के लंबे समय तक अंशों जलशीर्ष में परिणाम कर सकते हैं। इसके अलावा, मजबूत टीका और / या adoptively हस्तांतरित टी सेल प्रतिक्रिया से भड़काऊ प्रभाव रुग्णता के कारण पैदा कर सकते हैंविषाक्त साइटोकाइन तूफान। यह रुग्ण जानवरों पर प्रणालीगत संज्ञाहरण के प्रभाव को नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। TMZ और WBI महत्वपूर्ण विषाक्तता के लिए नेतृत्व अगर जानवरों ही बेहोश और छोटे विकिरण खुराक की डिलीवरी के लिए 10 मिनट के लिए स्थिर करने की आवश्यकता के रूप में, तो ketamine / xylazine खुराक 2- (मृत्यु के जोखिम को कम करने के लिए 20-25% की कमी की जा सकती है 8 Gy)।

होस्ट कंडीशनिंग दत्तक हस्तांतरण भी शामिल है कि सभी immunotherapy के प्लेटफार्मों के लिए महत्वपूर्ण है। प्रतिरक्षा चिकित्सा परीक्षणों अक्सर समाज के संदर्भ में मूल्यांकन कर रहे हैं के रूप में, immunotherapies की पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन नैदानिक ​​परिदृश्य पुनरावृत्ति करने के लिए इस सेटिंग के भीतर किया जाना चाहिए। हम यहाँ lymphodepletive और कार टी कोशिकाओं का उपयोग कर दत्तक चिकित्सा के साथ समाज के tumoricidal प्रभाव लाभ का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं। इस आहार संयुक्त समाज के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अन्य immunotherapy के प्लेटफार्मों के लिए आवेदन किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

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