בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

סרטן השחלות הוא הגידול ממאיר גינקולוגיות הקטלנית ביותר בארצות הברית עם הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה להיות תכונות של מחלה זו חוזרות ונשנות מאוד, chemoresistant. טיפול ראשוני מורכב לרוב מניתוח cytoreductive מקסימאלי וטיפול פלטינה לאחר מכן מבוסס, אם כי יש כמה עדויות לכך טיפול neoadjuvant עשוי להיות מועיל במקרים מסוימים 1. רוב המטופלים מגיבים בחיוב לטיפול ראשוני, אך למרבה הצער המחצית תהיה להרע בתוך 18 חודשים 2.

רוב גידולים ממאירים בשחלות הם קרצינומה אפיתל ויכולים לנבוע epithelia של 3,4 צינור השחלה או השחלה לפני השטח. מספר מחקרים תומכים בקיומם של תאי גזע סומטיים במערכת הרבייה הנשית שככל הנראה לסייע בתיקון רקמות שצריך בעקבות ביוץ 5,6. פעילות שגשוג הגבוהה בשתי השחלות וחצוצרות במהלך ovulation עשוי להיות גורם חשוב בהתפתחות של סרטן השחלות (Gharwan, et al. כתב יד שהוגש). הגזירה של תאי יוצרי גידול לא ברורה אבל הם יכולים לנבוע מתאי נורמלים גזע, תאי אב, או תאים מובחנים באמצעות מוטציות ההופכות אותם לא הצליח להסדיר החלוקה או גורל. תאים אלה יש גם מכונים "תאי גזע סרטני," או "תאי סרטן-ייזום," ויכולים לגדול לתוך spheroids tumorigenic, רב-תאי בתנאי התקשרות נמוכים. למרות שהמודל ההיררכי של פיתוח TIC עשוי להיות דינמי, טיקים חולקים רבים של אותן התכונות כמו תאי גזע נורמלים כוללים quiescence, התנגדות לכימותרפיה, התחדשות עצמית לטווח ארוך ויכולת להתמיין שושלות תאים שונות 7,8.

מספר מחקרים תומכים בקיומה של טיקים בסרטן השחלות ומאמצים הנוכחיים נמצאים בעיצומם כדי להבהיר את המנגנון (ים) שבו תאים אלה תומכים ביצירת גידולים 9-11. כמה סמנים הוצעו לזהות טיקים השחלות עם tumorigenicity המשופר כולל CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, וMyD88, למרות שתרומתו של כל סמן המדויק אינה ברורה ויכולה להיות סוג התא ספציפי 11-16. בעוד סמן אוניברסלי או קבוצה של סמנים לא הוקם באופן חד משמעי לטיקי השחלות, קבוצות שונות הצליחו לבודד טיקים השחלות נפוצות יותר על ידי בחירה עבור CD44 +, CD133 + ו / או תאים עם dehydrogenase אלדהיד פעילות הגבוה (ALDH) 13,17-21. CD44 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני הפועל כקולטן לחומצה היאלורונית ומסדיר כמה תהליכים חשובים להתקדמות גידול, כוללים הדבקה, התפשטות, הגירה, אנגיוגנזה ובידול 22. CD133 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני שתפקידה עדיין לא ברור, אך מחקרים מראים שזה מארגן טופולוגיה קרום פלזמה 23. ALDH, אנזים תאיים שמזרז את החמצון של אלדהידים, עשוי להיות רוב היקוםסמן אל של טיקים כפעילות גבוהה זוהה בתאי גזע שבודדו ממגוון רחב של רקמות ותפקידים מרובים יוחסו לALDH בתמיכת תאי גזע נורמלים ו -24 טיקים. נכון לעכשיו, נראים CD133 וALDH1 להיות הסמנים לשחזור ביותר של טיקים השחלות 13,21.

בנוסף להבנת המאפיינים של טיקים, יש גם מאמץ גדול כדי לזהות תרופות שמתמקדות תת-אוכלוסייה זו. שיעור ההישנות הגבוה הקשורים לסרטן השחלות יכול להיות בגלל הכישלון של טיפולי הכימותרפיה הנוכחיות למיגור הצלחת טיקים. למרות שחלק הארי של הגידול הוא רגיש לטיפולים קיימים, טיקים נחשבים לעמיד ובצפיפות בלתי ניתנת לגילוי על ידי שיטות סטנדרטית. מנגנוני הבהרה של התנגדות טיפול והישנות של גידול הם חיוניים כדי לשפר את התגובה ושיעורי הישרדות כוללת של חולים עם סרטן שחלות.

כאן, טכניקות תרבות מתוארות הבלהעשיר לטיקים משורות תאי סרטן השחלות הוקמו ועיקריות. תנאי התרבות מתוארים כאן נעשו שימוש על ידי מספר קבוצות כדי לגרום להתפשטות של טיקים או תאי אליפטית עם איכויות תאי גזע 11,12,14,16,20. למרות שיש כמה במדיות תרבות תאי גזע ותוספים נפוצים להעשרת טיקים / spheroids השתמשנו נוסחת סרום ללא מדיה עם EGF וFGF, אך ללא תוספת של B27 או N-2 תוספים. תוספי מזון אלו, המשמשים בדרך כלל לתרבית תאים עצבית ומעשיר לתאי גזע, הוכחו לקדם פנוטיפ mesenchymal 25,26 ונותר אי ודאות בתחום, האם טיקים שיש mesenchymal או הפנוטיפ אפיתל הם tumorigenic יותר 27-29 . כדי למזער את חוסר ודאות ומשתנים אנו שבחרנו להשתמש בנוסחה הנפוצה ביותר, עם תאי סרטן השחלות אפיתל מאז אנו עוסקים.

שמירה על תאים בסרום ללא מדיה בבקבוק מצורף נמוךמאפשר היווצרות אליפטית ותומך בהתפשטות של תאים עם ביטוי CD133 ופעילות ALDH גבוהה. העבודה שלנו הראתה עוד, כי תאים צפים בתנאים חסיד נורמלים גם יכולים לייצג אוכלוסיית TIC tumorigenic יותר. הזרקה של תאים שגודלו בתנאים אלו לעכברים בעירום athymic מובילה לפוטנציאל גבוה יותר בהשוואה לתאים סרטני גדלו בתנאים מצורפים בנוכחות הסרום. מידע רב בנוגע לתפקידו של טיקים בייזום סרטן השחלות, התקדמות, תגובה לטיפול, והישנות מחלה ניתן להשיג באמצעות השימוש בטכניקות אלה.

Protocol

1. מסורתי תרבות של שורות תאי סרטן השחלות (תנאים חסידים)

הערה: כל הטיפול בתאים ותקשורת צריכה להתבצע בברדס רקמת סטרילית תרבות

  1. הכן תקשורת תרבית תאים מסורתית. השתמש 1: 1 DMEM: F12 (+ L-גלוטמין, + 15 מ"מ HEPES) ולהשלים עם סרום 10% חום מומת שור עוברי ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. פתרון סינון באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר ואקום.
  2. הכן בקבוק מסורתי קלקר 75cm תרבות 2 רקמות שכותרתו עם שם, התאריך, ומספר מעבר של הקו הסלולרי של interest.Remove הבקבוקון של תאים ממקפיא נמוך במיוחד או חנקן נוזלי. להפשיר על ידי הצבת 37 ° C אמבט מים במשך 5 דקות.
  3. העברת השעיה מבקבוקון לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר תקשורת מסורתית תרבית תאים (שהוכנה לעיל). ההשעיה צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 400 x גרם. בינתיים, להוסיף 16 תרבית תאי תקשורת מסורתית מיליליטר לבקבוק.
  4. לשאוב supernatant. באמצעות 2 מיליליטר תאי pipet תרבית תאי התקשורת מסורתיים למעלה ולמטה כדי לשחרר גלולה והשעית העברה לבקבוק. בעדינות בקבוק רוק לפזר באופן אחיד בקבוק cells.Place בתרבית תאי חממת humidified מוגדר 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. צג תאים יומי עד שיגיע למפגש 80%.
  5. ברגע שהתאים הם 80% ומחוברות לפצל את התרבות 1: 2 במכסת מנוע תרבית תאים. לשאוב supernatant ולשטוף עם מי מלח שנאגרו פוספט החם (ללא סידן ומגנזיום) (PBS). להוסיף 1.5 -EDTA 0.25% מיליליטר טריפסין ודגירה 3-5 דקות ב RT.
  6. הכן 2 75cm 2 צלוחיות קלקר חדשות ולהוסיף 16 מיליליטר תרבית תאי תקשורת מסורתית לכל בקבוק. Resuspend תאי trypsinized ב 4 מיליליטר תרבית תאי תקשורת מסורתית וכמויות שווים aliquot לכל אחד מהצלוחיות החדשות.
  7. צלוחיות מקום בתרבית תאי חממת humidified מוגדרות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. צג תאים יומי עד שיגיע למפגש 80%. תמשיך לפצל תאים ותרבות או הקפאה ולאחסן ב -80 או בחנקן נוזלי.

2. דור של התאי Spheroids משורות תאי סרטן השחלות באמצעות תאים צפים או חסיד

הערה: כל הטיפול בתאים ותקשורת צריכה להתבצע בברדס רקמת סטרילית תרבות. לאחר culturing שורות תאים תחת שיטות תרבות מסורתיות ל2-3 קטעים (סעיף 1) להמשיך בשלבים הבאים.

  1. הכן תקשורת בתאי גזע. השתמש 1: 1 DMEM: F12 (+ L-גלוטמין, + 15 מ"מ HEPES) ולהשלים עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין (לריכוז סופי של 100 U / ml פניצילין ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין), 1% החלפת סרום בנוקאאוט , 0.4% אלבומין בסרום שור, ושל 0.1% אינסולין transferrin-סלניום. פתרון סינון באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר ואקום.
  2. תקשורת בתאי גזע מוסף עם גורם אנושי רקומביננטי צמיחת אפידרמיס (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסית רקומביננטי האנושי (FGF) לריכוז סופי של 20 ng / ml ו -10 ng / ml, בהתאמה.
    יש להוסיף טריים לתקשורת בתאי גזע גורמי צמיחה תקין לפני השימוש: הערה.
  3. צור תרבות המצוף TIC. הסר בקבוק של תאים ומחוברות 80% גדלו בתנאי תרבות חסיד מסורתיים. לאסוף תקשורת וכל תאים הצפים (יחיד ומצרפים), שעזבה את האוכלוסייה חסיד מאחורי, ולהעביר 50 צינור צנטריפוגות מיליליטר פוליפרופילן. ההשעיה צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 400 x גרם.
    הערה: תאים ואגרגטים צפים ניכרים 24-72 שעות לאחר תאים חסיד מחוברים לבקבוק תחת התרבות המסורתית. מ- 80% אחזור צלחת ומחוברות של כ 1.0-5.0 x 10 ניתן לצפות 5 תאים צפים קיימא, בהתאם לקו התא. במחקר זה המספר הממוצע של תאים צפים שנאספו מ- 80% ומחוברות תרבות חסיד היה: 5.0 x 10 5 לACI-23, 4.8 x 10 5 לOVCAR5, 3.5 x 10 5 לCAOV3, ו1.0 x 10 5 לTGS- 3. עם ההעברה, multicellהיווצרות אליפטית רגילה בתרבות TIC מסורתית ומצוף מתרחשת בתוך כמה ימים אם כי זה קצת קו תא תלוי. לדוגמא, ACI-23 תאים ליצור אגרגטים בקלות רבה יותר מאשר תאי CAOV3.
  4. בינתיים מכין סנטימטר 2 בקבוק תרבות רקמת אולטרה קלקר משטח קובץ מצורף נמוך 75 שכותרתו עם שם, התאריך, ומספר קטע של שורת תאים. להוסיף 10 מ"ל נובע תקשורת סלולארי בתוספת גורמי גדילה לבקבוק.
  5. ברגע שצנטריפוגה היא, תקשורת מלאה לשאוב וגלול העברה לבקבוק מצורף נמוך על ידי הוספת 6 מ"ל נובע תקשורת סלולארי וpipetting מעלה ומטה כדי לשחרר גלולה. צלוחיות מקום בתרבית תאי חממת humidified מוגדרות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. צג תאים בכל 2-3 ימים כדי לבחון היווצרות אליפטית.
  6. צור תרבות TIC מסורתית. הסר בקבוק של תאים ומחוברות 80% גדלו בתנאי תרבות חסיד מסורתיים. תקשורת ולשאוב לשטוף עם PBS החם. להוסיף EDTA 0.25% 1.5 מיליליטר טריפסין ודגירה 3-5דקות ב RT.
  7. הכן סנטימטר 2 בקבוק תרבות רקמת אולטרה קלקר משטח קובץ מצורף נמוך 75 שכותרתו עם שם, התאריך, ומספר קטע של שורת תאים. להוסיף 10 מ"ל נובע תקשורת סלולארי, בתוספת EGF וFGF, כפי שתואר, לבקבוק.
  8. להוסיף 6 מ"ל נובע תקשורת סלולארי לבקבוק עם טריפסין. פתרון תא Pipet למעלה ולמטה וינסה לשחרר תאים מפני שטח הבקבוק. העבר את הנפח שלם של תאים לבקבוק מצורף נמוך במיוחד המכיל 10 מ"ל נובעים תקשורת סלולארי. בקבוק מקום בתרבית תאי חממת humidified מוגדר 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  9. להשלים תרבויות TIC כל 48 - 72 שעות עם 2 נוספים מ"ל נובע תקשורת סלולארי וEGF הטרי וFGF לריכוזים סופיים של 20 ng / ml ו -10 ng / ml, בהתאמה.
  10. צג תאים עד 60 - הוא הגיע למפגש 80%. תרבויות פיצול על ידי הצבת כמויות שווה ל -2 צלוחיות מצורפים נמוך במיוחד חדשות והוספת מדיה תאי גזע טרי כדי להשיג נפח סופי של 18 מיליליטר. אלטרנטיביly, צנטריפוגה כל ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 400 x גרם. תאים גלולים בתקשורת של תאי גזע בתוספת EGF וFGF ולהפיץ באופן שווה לתוך צלוחיות מצורפים נמוך במיוחד חדשות. תאים לא צריכים להיות מנותקים להשעיות תא בודדות לpassaging.
    הערה: בשלב זה תרבויות יכולות להמשיך להיות מפוצלות ותרבותי, קפוא, או באופן ניסיוני מניפולציות לניתוח. בגיל 60 - מפגש 80% הריכוזים של התאים הבאים נאספו לACI-23: 8.0 x 10 6 למסורתיים חסיד, 4.0 x 10 6 למסורתיים TIC, ו -5.0 x 10 6 לתרבויות הרחף TIC. למרות שזה עשוי להיות קו תא תלוי, מצאנו כי 5-10 ימים בתרבות הוא אופטימליים להעשרת TIC כאחוז מCD133 + ALDH + תאים הוא נמוך בתוך 3 הימים הראשונים, פסגות ב 5 - 10 ימים, ושוב מצטמצם ב 14 ימים.

3. דור של שורות תאי אפיתל הראשוני סרטן השחלות וSpheroids התאיממיימת חולה Chemoresistant

הערה: אישור Institutional Review Board הושג לפרוטוקול זה. כל הטיפול בתאים ותקשורת צריכה להתבצע בברדס רקמת סטרילית תרבות.

  1. מיימת צלחת נוזל 1: 1 עם תקשורת ותרבות תא מסורתית. הכן התקשורת כאמור בסעיף 1 ולהוסיף 10 מ"ל לכמה צלוחיות תרבית רקמת סנטימטר 2 מסורתיות קלקר 75.
  2. מיימת נוזל ניתן בדרך כלל בבקבוקי ואקום סטרילי 1 ליטר; להסיר את המכסה ואקום. בזהירות להוסיף 10 מיליליטר מיימת נוזל לבקבוק המכיל 10 מיליליטר תקשורת ומקום מסורתיים בתרבית תאי חממת humidified מוגדר 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. השאר באין מפריע במשך 72-96 שעות, לפני שאני עושה שינוי תקשורת מלא. שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים עד תאים מגיעים 60 - מפגש 80%
  3. ברגע שתאים מגיעים 60 - מפגש 80%, לפצל 1: 2 כפי שתואר בסעיף 1. תרבויות התחל TIC כפי שתואר בסעיף 2.
    הערה: אריתרוציטים הנוכחיים בascites יוסר לאחר שינוי התקשורת הראשון כפי שהם לא חסיד. כל fibroblasts הנוכחי יוסר במידה רבה לאחר טיפול עם טריפסין כפי שהם רגישים יותר ולהרים עם חשיפה מינימאלית לטריפסין. טוהר של תאי סרטן השחלות נקבע על ידי cytometry זרימת הניתוח באמצעות נוגדן לCA-125 (MUC16).

4. צביעת תאים לאישור cytometry הזרימה של סמני TIC

  1. לאסוף תרבויות TIC. העבר את התוכן של בקבוק לתוך שפופרת 50 מיליליטר צנטריפוגות פוליפרופילן. השעיות צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x גרם. תקשורת ולשאוב לשטוף עם PBS החם. הוסף 2 מיליליטר פתרון תא דיסוציאציה אינה אנזימטית, דגירה 3 - 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, וpipet למעלה ולמטה כדי לשבור את הגושים והתפרקו לתאים בודדים. הוסף 4 מ"ל נובע תקשורת סלולארי.
  2. לאסוף תרבויות חסיד. תקשורת ולשאוב לשטוף עם PBS החם. הוסף 3 מיליליטר פתרון תא דיסוציאציה אינה אנזימטית דגירה 3 - 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. הוסף 3 מיליליטר תא מסורתיתקשורת והתרבות וpipet למעלה ולמטה שוב ושוב לנתק את התאים מהבקבוק ולאסוף לתוך צינור צנטריפוגות.
  3. צנטריפוגה שני TIC והשעיות חסיד במשך 5 דקות ב 400 x גרם. בטל supernatant ו resuspend כל גלולה ב 1 מיליליטר PBS המכילה 3% בסרום שור עוברי. לדגור על RT 30 דקות. בינתיים, לספור מספר תאי קיימא באמצעות trypan כחול. שים לב תאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר spheroids הם ניתקו לתוך תאים בודדים.
  4. תווית 5 x 1.5 מיליליטר צינורות Eppendorf עבור כל אחד מהתנאים הבאים התרבות: 1) בלא כתם (השליטה בלא כתם לפיצוי), 2) ALDH (שליטת כתם יחיד חיובית לפיצוי), 3) CD133 (ביקורת חיובית כתם יחיד לפיצוי), 4 ) ALDH + CD133 (מדגם בדיקה ניסיוני), ו -5) DEAB + ALDH (בקרות שליליות לקרינת רקע בFL-1 וFL-4 ערוצים, בהתאמה).
  5. להפיץ כ 5 x 10 5 תאים לכל אחד צינורות 1 # - 4. השעיות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם. לשאוב supernataכדורי NT וגלולים ב500 μl Aldefluor Assay מאגר. להוסיף DEAB 10 μl (מעכב aldh) לצינור # 5 לביקורת שלילית ניסיונית.
  6. הוסף 5 μl מופעל מגיב Aldefluor לצינור מס '2 לביקורת חיובית פיצוי וקפיצי לערבב. הוסף 5 μl מופעל מגיב Aldefluor לצינור מס '4 לניתוח ניסיוני. צינור קפיצי לערבב ומייד להעביר מחצית הנפח של תאים מצינור # 4 לתוך צינור # 5 (μl 250) המכיל את DEAB.
  7. צינורות פליק למערבבים היטב. דגירה כל הצינורות ל30-45 דקות ב 37 ° C המוגנים מפני אור. צינורות פליק באמצע תקופת דגירה כתאים ליישב לתחתית. צנטריפוגה כל הצינורות במשך 5 דקות ב 400 x גרם. תאי supernatant ו resuspend לשאוב ב 500 μl Aldefluor Assay מאגר.
  8. לצינורות עם כתמי CD133 (# 3 ומס '4), להוסיף CD133-APC 01:11 ישירות למאגר assay Aldefluor. דגירה 15 דקות על הקרח המוגן מפני אור. צנטריפוגה צינורות CD133 במשך 5 דקות ב 400 x גרם. שטפי פעם עם500 μl Aldefluor חיץ assay. תאי Resuspend במאגר assay Aldefluor 500 μl, בהתאמה.
  9. השעיות מסנן לתוך צינורות תחתון עגולים קלקר אדם עם כובע מסננת תא. ודא שכל הנפח מסונן דרך הכובע.
  10. לנצל cytometer זרימה לנתח את אוכלוסיית התא. השתמש בצינורות # 1-3 לקביעת בקרות פיצוי. שימוש בקדימה ופרמטרי צד-פיזור, שער התאים, להיות בטוח שלא לכלול פסולת הסלולר. להקים + ALDH וCD133 + תאים כפולים באמצעות FL-1 וFL-4 ערוצים, בהתאמה.
  11. באמצעות תכנית ניתוח cytometric, לאשר את תנאי התרבות משופרים אחוז תאי TIC כתרבויות TIC העשיר צריכים מכתים גבוהות יותר עבור שני סמנים אלה.
    הערה: בנוסף לCD133 וALDH, ניתן לנתח טיקים סרטן אחרים markersof השחלות עם מספר הסמנים המשמשים בכל דגימה אחת תלויה ביכולות של cytometer זרימה.

5. בvivo

הערה: אישור Institutional Review Board הושג לפרוטוקול זה. להפיץ עכברים בעירום נשיים athymic 6-8 שבועות של גיל לקבוצות ניסוי בכלובים של 3 ולאפשר להסתגל לכמה ימים לפני זריקות. עקוב עכברים תחת הנחיות הומניות ניסיוניות לפי NIH טיפול בבעלי חי ועדת שימוש; לפקח על משקל גוף, מראה פיזי כולל ירידה במשקל או להרוויח יותר מ -20%, מראה כחוש, שלשול או דלקת עור ולהרדים עכברים התאימו לקריטריונים אלה על ידי CO 2 חנק.

  1. לאסוף תרבויות כפי שתואר בסעיף 2. Resuspend כל אוכלוסיית תא ב 1 מיליליטר PBS. ספירת תאי קיימא באמצעות assay trypan הכחול.
  2. הכן 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. לשלושה עותקים אמצעים להוסיף 1.5 x 10 6 תאי קיימא בדילול מלאים 2 מיליליטר PBS לתוך צינור אחד (5 x 10 5 תאים בנפח של 0.5 מיליליטר יהיה להזריק מתחת לעור לתוך תקין fכחוש של כל עכבר). הכן 0.5 מיליליטר PBS רק לעכברי ביקורת.
  3. באמצעות 27 מחטי G, subcutaneouslyinject 0.5 מיליליטר השעיה תא מתרבויות חסיד מסורתיות, תרבויות TIC מסורתיות, מצוף תרבויות TIC, או PBS לאגף הימני של כל אחד מעכברים 3 לכל קבוצה. חזור לעכברים לאחר הזרקת כלובים המקוריים.
  4. לשקול עכברים ולמדוד כל גידולים מוחשיים בשני ממדים פעמיים weeklyby קליפר Vernier, הקמת אורך ורוחב.
    הערה: זמן השהיה גידול הוא בדרך כלל 20-50 ימים בהתאם לקו התא.
  5. לחשב נפח רטוב גידול בשיטות סטנדרטית (V = (רוחב) x 2 אורך / 2).
    הערה: למרות שמחקר זה לעומת tumorigenicity של טיקים לעומת תאים חסיד עבור הדור הראשון בלבד, passaging הסידורי in vivo של טיקים גדלו בתנאים דומים הושלם על ידי אחרים 11,20.

Representative Results

הוקם שורות תאי סרטן השחלות ושורת תאי מיימת עיקריות גדלה בתנאי תרבות חסיד מסורתיים בנוכחות סרום תכנית המצורפת, מורפולוגיה מרוצפת, ואילו אותם התאים שגודלו בתנאי תרבות TIC התצוגה צף מורפולוגיה אליפטית, נפוצה באוכלוסיות TIC. תמונות Brightfield מוצגות באיור 1 מראות בבירור את ההבדלים מורפולוגיים בתנאי התרבות. איור 1 מציגה את המורפולוגיות מובחנות הושגו לאחר replating ACI-23 וTGS-3 תרבויות TIC בתנאים חסיד מסורתיים. רק 24 שעות לאחר זריעה בחזרה בתנאים חסיד, רוב spheroids הרב-תאיים לנתק ולחבר אל פני השטח, שמזכירים תאים חסיד טיפוסיים.

כדי לוודא שתנאי TIC להעשיר לתאים עם סמנים של תאי גזע cytometry זרימת הניתוח בוצע באמצעות שני סמנים משותפים של טיקים השחלות - expressio CD133n ופעילות ALDH. חלקות Dot שמוצגים באיור 2 מדגישות את אחוז המוגבר של CD133 + תאים בקובץ מצורף נמוך, ללא תנאים בסרום. בדומה לכך, הפעילות של אנזים ALDH היא גבוהה יותר בתנאים אלה בהשוואה לתנאי תרבות חסיד מסורתיים. למרות שהתרבויות חסיד המסורתיות מכילות CD133 + תאים, השיעור עולה בתנאים המשפרים את היווצרות אליפטית. ניתוח של סמן pluripotency, TRA-1-60, מעניק תמיכה נוספת לכך שתנאי TIC להעשיר לטיקים, איור 2 ב '. כימות באיור 2 C מוכיח כי חיוביים כפול (CD133 + ALDH +) ACI-23 תאים מוגבלים במידה רבה לתרבויות גדלו בתנאי שיפור TIC. שינויים ברמות החלבון של גורמי תעתיק שונים המתרחשים בACI-23 התאים לאחר חמישה ימים של תרבות בתנאי TIC גם נבדקו. עלייה הדרגתית בכל אחד מהסמןים נראה ממסורתי למצוף תנאי TIC בהשוואה לרמות הנמוכה יחסית לראות בתרבות חסיד, איור 2 D. מעניין שורת תאי מיימת אנושית הגדלה בתנאים השונים מציגה את הפנוטיפ הסמן הגבוה ביותר בתנאי TIC המסורתיים עם לא מעט הווה צביעה בתנאי TIC המצוף, איור 2 E.

Tumorigenicity של תנאי תרבות TIC קבל תוקף באמצעות זריקות תת עוריות של מספר שווה של תאי קיימא המתקבלים מכל התנאים לקבוצות של עכברים בעירום athymic. איור 3 מראה כי ACI-23 (A, B) וOVCAR-5 (ג) תאים מ תרבויות חסיד מסורתיות היו פחות tumorigenic מאלה מתרבויות TIC. שים לב שתרבויות TIC המצוף מיוצרות גידולים גדולים יותר בפרק זמן קצר יותר מאשר תרבויות TIC חסיד או מסורתיות המסורתיות. ד אלואתא מצביע על כך שאפילו עם עלייה מתונה בסמני TIC השחלות, יש שינוי פנוטיפי דרמטי. עם זאת בשורות תאים אחרות (לא מוצג) תרבויות TIC המסורתיות היו יותר tumorigenic מאשר תאי התרבות המסורתיים חסיד ומצוף TIC.

איור 1
שורות תאי סרטן השחלות איור 1. פיתוח ספרואיד בתנאי תרבות שונים. (א) הוקם (ACI-23, OVCAR-5 וCAOV3) ותאים ראשוניים המופקת מחולת מיימת (TGS-3) גדלו בצלוחיות מצורפים נמוכות עם סרום ללא תקשורת בתאי גזע בקלות ליצור spheroids רב-תאי. תמונות מראות תנאי תרבות חסיד מסורתיים לשמור על מורפולוגיה מרוצפת אפיתל בACI-23, OVCAR-5, CAOV3 וTGS-3 תאים, ואילו אותם תאים שנוצרו בתוך 96 שעות spheroids בתנאי TIC. בר סולם 100 מיקרומטר. (ב) עם חשיפת 24 שעותלתנאי תרבות חסיד מסורתיים, המורפולוגיות תרבות TIC להציג פנוטיפ מובחן המזכיר את המורפולוגיה חסיד המקורית. בר סולם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. נמוך מצורף, תנאי סרום ללא להעשיר לתאים עם סמני TIC. () Cytometry זרימת הניתוח של ACI-23 תאים באמצעות APC מצומדות נוגדן CD133 מדגים אחוז מוגבר של CD133 + תאים בצלוחיות מצורפים נמוכות עם גזע סרום ללא תא תקשורת. Cytometry זרימת הניתוח באמצעות מופעי assay Aldefluor פעילות מוגברת ALDH בתאים בתרבית בצלוחיות מצורפים נמוכות עם תקשורת בתאי גזע סרום ללא. ביקורת שלילית CD133 אינו מכילה נוגדנים וcon השלילי ALDH trol הוא המצע מופעל בנוכחות מעכב ALDH (DEAB). (ב) ניתוח באמצעות נוגדן TRA-1-60 מצומדות FITC מדגים אחוז הגבוה ביותר של תאים + TRA-1-60 בתנאי TIC המצוף בACI-23 תאים. ביקורת שלילית לא מכילה נוגדן. CD133 (C) + ALDH + תאים הגבוהים ביותר הוא בTIC המסורתי ומצוף תנאי TIC בשורת תאי ACI-23. ברים שגיאה: SEM, N = 6, * p <0.05. ניתוח כתם המערבי (ד ') מראה עלייה ברמות חלבון של סמני תעתיק של תאי גזע בACI-23 התאים בתרבית בתנאי TIC במשך 5 ימים. lysates התא כולו (50 מיקרוגרם) נותח עם GAPDH כביקורת טעינה. (E) חלקות נקודת נציג של TGS-3 תאי מיימת עיקריים ניתחו כמו ב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ep-together.within-page = "תמיד"> איור 3
איור 3. נמוך מצורף, תנאי סרום ללא להעשיר לתאים עם tumorigenicity המוגבר. (א) 5 x 10 5 ACI-23 תאי קיימא הוזרקו תת עורי לעכברים בעירום athymic בשלושה עותקים. עכברים נשקלו ונמדדו על ידי גידולי קליפר פעמיים בשבוע. = תרבות מסורתית חסיד, תרבות F = רחף TIC, תרבות S = המסורתי TIC. * P <0.05. (ב) נציג תמונות של גידולים נוצרו מACI-23 לאחר 25 ימי שימוש בתאים שגודלו בתנאי תרבות שונים. (ג) 5 x 10 5 OVCAR-5 תאים קיימא הוזרקו תת עורי לעכברים בעירום athymic בשלושה עותקים ופיקוח כמו ב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מציג שיטה יעילה ועקבית להעשרת תרבויות לתאים עם תכונות של תאי גזע משורות תאי סרטן השחלות הוקמו וישים לדגימות חולים עיקריות. שיטה זו מעשירה בהצלחה לטיקים על פני מגוון רחב של שורות תאים. היא מאפשרת בזמן זיהוי של תנאים המעשירים לTIC ו / או הפנוטיפ סרטני, מבלי לקחת זמן כדי למיין את הטיקים מהלא-טיקים באוכלוסייה מבחינה פיזית. באופן זה, רמות היחסית של מסלולי איתות שונים ניתן להעריך על תרומתם לפנוטיפ TIC ידי השוואת תרבויות חסיד מסורתיות לTic תרבויות תוך שימוש במגוון של מבחני תפקודיים. אם אוכלוסיית TIC טהורה היא רצויה, בידוד יכול להיות מושגת בקלות על ידי שילוב צעד מיון בסיוע הקרינה או מגנטית בזרימת cytometry פרוטוקול.

חשוב לזכור, עם זאת, כי הביטוי של סמן TICים, כגון CD133, CD44, או ALDH, עשוי להשתנות בין שורות תאים או דגימות חולים אפילו מאותו סוג הגידול. לדוגמא מצאנו כי יש לי OVCAR-5 התאים ביטוי גבוה יותר של CD44 ביחס לCD133, ואילו ההפוך הוא נכון עבור ACI-23. לכן זה רלוונטי להסתמך על התחלה של גידול בעכברים וזרימת cytometry ניתוח כמוחלט של נוכחות TIC. בעקבות פרוטוקול זה, פעילות הגבוהה ALDH נצפתה באופן עקבי כאשר תאי סרטן השחלות גדלו בתנאים בתאי גזע. מעניין, ביטוי CD133 הוא גבוה באופן עקבי בACI-23 תאים שגודלו בתנאי תרבות TIC מסורתיים, ואילו ALDH הוא גבוהה ביותר בתנאי TIC מצוף. בניגוד TGS-3 תאי מיימת העיקריים להציג עלייה קטנה בחיוביות CD133 בתנאי TIC מצוף, אבל גידול מרשים בפעילות ALDH בתנאי TIC מסורתיים. ממצאים אלו מדגישים את ההטרוגניות של תאי סרטן השחלות והפלסטיות נפוצים הקשורים טיקים. כדי לתמוך בCLA נוסףim כי שיטות אלה לשפר את הטיקים, העשרת TRA-1-60 תאים חיוביים נצפתה גם. TRA-1-60 הוא סמן pluripotency ונעשה שימוש כדי לזהות קרצינומה עוברית של השחלה ואשכים, כמו גם סרטן ערמונית TICS 30-32. למרות שהשיטות שלנו היו מוצלחות עם שורות תאים רבות, זה אפשרי, כי תנאי TIC סטנדרטיים עשויים להיות מתאימים יותר לחלק מתאי סרטן השחלות, ואילו תנאי המצוף שונה טובים יותר להעשיר לטיקים באוכלוסיות תאי סרטן השחלות אחרות. זה מדגיש שוב את ההטרוגניות הצפויה בתוך שני שורות תאי סרטן השחלות-המטופל נגזרות והקימו.

בנוסף לסמנים פני תא יש כמה גורמי תעתיק שהוכחו לאפיין טיקים סרטן השחלות כוללים Nanog, Sox2, אוקטובר -4 11, אם כי סמנים אלה אינם ספציפיים לטיקי סרטן השחלות ולא מייצגים גורמים חשובים לpluripotency בתאי גזע העוברי וDIFferentiation 33,34. בחנו את השינויים ברמות חלבון של גורמים אלה ומצאנו כי רמות Nanog להגדיל בתנאי תרבות TIC, בהסכם עם אחרים 13,35 כמו גם CD133, TRA-1-60, וCD117. מערך cDNA סמן תאי גזע אנושי נוסף הראה עלייה בגנים CD133, Nanog, מלק, וPODXL בתנאי TIC בהשוואה לתנאים חסיד מסורתיים. חשוב לציין, יש לציין כי, כעם סמנים פני תא, גורמי תעתיק הקשורים לטיקי השחלות עשויים להשתנות בין שורות תאים ודגימות מטופל.

ראינו כי תאים סרטניים עשויים להיות יותר ולהביע את הרמות גבוהות יותר של סמנים בתאי גזע אם הם מטבעם לא חסיד במבחנה (כלומר, צף תאים שאינם מוכן לצרף לצלחת חסיד). בתרבות, יש לי שורות תאים כגון ACI-23 בדרך כלל רבים תאי קיימא צפים ו / או תאים שגדלים בצורה אנכית באופן לערום תחת קונדיט התרבות המסורתייונים. למרות העשרה מוצלחת של טיקים מהתאים ואגרגטים צף יכולה להיות שורות תאים החלים על מעטים יחסית כולל אלה שבמחקר הנוכחי וOVCAR-3 12, הממצאים שלנו מציעים זה עשוי לייצג אוכלוסיית tumorigenic יותר. לכן, קציר האוכלוסייה "צף" של תאים שגודלו בצלחות תרבית רקמה סטנדרטית ותקשורת יכול לשמש כדרך חלופית להעשרת TIC, לתאים שיתאימו בצורה גרועה לתקשורת בתאי גזע המסחרית.

שימוש בשיטות התרבות השונות שהוצגו בכתב היד הזה יאפשר העשרה מהירה של אוכלוסיות TIC והבנה טובה יותר של גורמים שתומכים בפנוטיפ זה בתאים שונים. יישומים הנוכחיים של שיטה זו כוללים אפיון שמסלולי איתות חיוניים לתמיכה בריבוי של אוכלוסייה ייחודית זו של תאים. תוצאות ממחקרים אלה יסייעו להבהיר את המנגנונים של התקדמות גידול ולהרע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
  2. Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
  3. Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
  4. King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
  5. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  6. Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
  7. Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
  8. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
  9. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
  11. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
  12. Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
  13. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
  14. Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
  15. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
  16. Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
  17. Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
  18. Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
  19. Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
  20. Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
  23. Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
  24. Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
  25. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
  26. Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. (2014).
  27. Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
  28. Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
  29. Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
  30. Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
  31. Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
  32. Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
  33. Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
  34. Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
  35. Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics