Name: 在卵巢癌肿瘤起始细胞体外富集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习卵巢癌肿瘤起始细胞体外富集方法，使用无血清培养基和低吸附培养瓶进行细胞培养，通过流式细胞术检测CD133和ALDH活性，并在免疫缺陷小鼠体内验证致瘤性，为开发靶向治疗策略提供可靠的实验模型。

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我们感谢 John Risinger 博士和纪念健康大学医学中心（Memorial Health University Medical Center, Inc.）慷慨提供 ACI-23 细胞系。作者感谢美国国家普通医学科学研究所为 C. House 提供的博士后研究培训（PRAT）项目资助。

1. 卵巢癌细胞系的传统培养（贴壁条件）
注意：所有细胞和培养基的操作均应在无菌的组织培养罩内进行
<ol>
	<li>准备传统的细胞培养基。使用 1:1 的 DMEM:F12（含 L-谷氨酰胺，15 mM HEPES），并添加 10% 热灭活胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素。用 0.45 µm 真空滤器过滤溶液。</li>
	<li>准备一个传统的聚苯乙烯 75 cm2 组织培养瓶，并标注细胞系名称、日期和传代次数。从超低温冰箱或液氮中取出细胞冻存管，在 37°C 水浴中解冻 5 分钟。</li>
	<li>将冻存管中的细胞悬液转移至含有 3 ml 上述制备的传统细胞培养基的 15 ml 离心管中。在 4°C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。同时，向培养瓶中加入 16 ml 传统细胞培养基。</li>
	<li>吸除上清液。用 2 ml 传统细胞培养基将细胞沉淀吹打重悬，然后转移至培养瓶中。轻轻摇动培养瓶使细胞均匀分布。将培养瓶放入设定为 37°C 和 5% CO2 的加湿细胞培养箱中。每日观察细胞，直至达到 80% 汇合度。</li>
	<li>当细胞达到 80% 汇合度时，在细胞培养超净台中按 1:2 比例传代。吸除上清液，用预温的磷酸盐缓冲液（不含钙和镁）（PBS）洗涤。加入 1.5 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，室温孵育 3–5 分钟。</li>
	<li>准备两个新的聚苯乙烯 75 cm2 培养瓶，每瓶加入 16 ml 传统细胞培养基。将消化后的细胞用 4 ml 传统细胞培养基重悬，并等量分装至两个新培养瓶中。</li>
	<li>将培养瓶放入设定为 37°C 和 5% CO2 的加湿细胞培养箱中。每日观察细胞，直至再次达到 80% 汇合度。此后可继续传代培养，或冻存后置于 -80°C 或液氮中保存。</li>
</ol>
2. 利用悬浮或贴壁细胞从卵巢癌细胞系生成多细胞球体
注意：所有细胞和培养基的操作均应在无菌的组织培养罩内进行。在采用传统培养方法培养细胞系 2 - 3 代（第 1 部分）后，继续执行以下步骤。
<ol>
	<li>制备干细胞培养基。使用1:1比例的DMEM:F12（含L-谷氨酰胺，15 mM HEPES），并添加1%青霉素/链霉素（终浓度为100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素）、1%敲除血清替代物、0.4%牛血清白蛋白和0.1%胰岛素-转铁蛋白-硒。使用0.45 µm真空滤器过滤溶液。</li>
	<li>向干细胞培养基中加入人重组表皮生长因子（EGF）和人重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF），使其终浓度分别为20 ng/ml和10 ng/ml。 
	注意：生长因子应在使用前新鲜加入干细胞培养基中。</li>
	<li>建立悬浮型肿瘤起始细胞（TIC）培养。取出在传统贴壁培养条件下生长至80%汇合度的细胞培养瓶。收集培养基及所有悬浮细胞（单个细胞和细胞团块），保留贴壁细胞群体，将收集物转移至50 ml聚丙烯离心管中。在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。 
	注意：在传统培养条件下，贴壁细胞贴附于培养瓶后24–72小时即可观察到悬浮细胞和细胞团块。从80%汇合度的培养皿中通常可回收约1.0–5.0 × 105个活细胞，具体数量取决于细胞系。本研究中，从80%汇合度的贴壁培养中平均回收的悬浮细胞数量为：ACI-23细胞系5.0 × 105个，OVCAR5细胞系4.8 × 105个，CAOV3细胞系3.5 × 105个，TGS-3细胞系1.0 × 105个。转移后，多细胞球体在传统TIC培养和悬浮型TIC培养中均在数天内形成，但该过程在一定程度上依赖于细胞系。例如，ACI-23细胞比CAOV3细胞更容易形成细胞团块。</li>
	<li>同时，准备一个超低吸附表面的聚苯乙烯75 cm2组织培养瓶，标注细胞系名称、日期和传代次数。向瓶中加入10 ml含生长因子的干细胞培养基。</li>
	<li>离心完成后，吸除上清液，通过加入6 ml干细胞培养基并反复吹打使细胞沉淀重悬，随后将细胞转移至低吸附培养瓶中。将培养瓶置于设定为37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中。每2–3天观察一次细胞，监测球体形成情况。</li>
	<li>建立传统TIC培养。取出在传统贴壁培养条件下生长至80%汇合度的细胞培养瓶。吸除培养基，并用预温的PBS洗涤一次。加入1.5 ml 0.25% EDTA胰蛋白酶溶液，在室温下孵育3–5分钟。</li>
	<li>准备一个超低吸附表面的聚苯乙烯75 cm2组织培养瓶，标注细胞系名称、日期和传代次数。向瓶中加入10 ml干细胞培养基，并按前述方法补充EGF和FGF。</li>
	<li>向含胰蛋白酶的培养瓶中加入6 ml干细胞培养基。反复吹打细胞悬液，尽量使细胞从瓶壁脱落。将全部细胞悬液转移至含有10 ml干细胞培养基的超低吸附培养瓶中。将培养瓶置于设定为37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中。</li>
	<li>每48–72小时向TIC培养物中补充2 ml干细胞培养基以及新鲜的EGF和FGF，使终浓度分别为20 ng/ml和10 ng/ml。</li>
	<li>持续观察细胞直至达到60–80%汇合度。通过将细胞悬液等量分装至两个新的超低吸附培养瓶中，并补充新鲜干细胞培养基至终体积18 ml进行传代。或者，将全部细胞悬液在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，用含EGF和FGF的干细胞培养基重悬细胞后，均等分配至新的超低吸附培养瓶中。传代时无需将细胞解离为单细胞悬液。 
	注意：此时培养物可继续传代培养、冻存或用于实验分析。在60–80%汇合度时，回收的细胞数量如下：ACI-23细胞系中，传统贴壁培养为8.0 × 106，传统TIC培养为4.0 × 106，悬浮型TIC培养为5.0 × 106。尽管该现象可能具有细胞系依赖性，但我们发现TIC富集的最佳培养时间为5–10天，因为CD133+ALDH+细胞的比例在前3天较低，在5–10天达到峰值，14天后再次下降。</li>
</ol>
3. 从化疗耐药患者的腹水中分离原代上皮性卵巢癌细胞系及多细胞球体
注意：本方案已获得机构审查委员会批准。所有细胞和培养基的操作均应在无菌的组织培养罩内进行。
<ol>
	<li>将腹水液与传统细胞培养基按1:1比例接种。按第1节所述配制培养基，并向多个传统的聚苯乙烯75 cm2组织培养瓶中各加入10 ml。</li>
	<li>腹水液通常以1 L无菌真空瓶提供；取下真空瓶盖。小心将10 ml腹水液加入含有10 ml传统培养基的培养瓶中，置于设定为37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱内。静置培养72–96小时后再进行完全换液。此后每2–3天换液一次，直至细胞达到60–80%融合度。</li>
	<li>当细胞达到60–80%融合度时，按第1节所述以1:2比例传代。按第2节所述开始肿瘤起始细胞（TIC）培养。 
	注意：腹水中的红细胞在首次换液时将被去除，因其不具备贴壁能力。存在的成纤维细胞在胰蛋白酶处理后也将基本被去除，因其对胰蛋白酶更为敏感，仅需短暂暴露即可脱落。卵巢癌细胞的纯度通过流式细胞术分析确定，所用抗体为CA-125（MUC16）。</li>
</ol>
4. 用于流式细胞术验证肿瘤起始细胞标志物的细胞染色
<ol>
	<li>收集TIC培养物。将培养瓶中的内容物转移至50 ml聚丙烯离心管中。在400 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，并用预热的PBS洗涤。加入2 ml非酶细胞解离液，在37 °C孵育3–5分钟，反复吹打以打散细胞团块并解离成单细胞。加入4 ml干细胞培养基。</li>
	<li>收集贴壁培养物。吸除培养基，并用预热的PBS洗涤。加入3 ml非酶细胞解离液，在37 °C孵育3–5分钟。加入3 ml传统细胞培养基，反复吹打以使细胞从培养瓶脱落，并收集至离心管中。</li>
	<li>将TIC和贴壁细胞悬液均在400 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将每管沉淀重悬于含3%胎牛血清的1 ml PBS中，在室温孵育30分钟。同时，使用台盼蓝计数活细胞数量。在显微镜下观察细胞，确认类球体已完全解离为单细胞。</li>
	<li>为以下每种培养条件分别标记5个1.5 ml离心管：1）未染色（用于补偿调节的未染色对照），2）ALDH（用于FL-1通道补偿调节的单染阳性对照），3）CD133（用于FL-4通道补偿调节的单染阳性对照），4）ALDH + CD133（实验检测样本），5）DEAB + ALDH（分别用于FL-1和FL-4通道背景荧光的阴性对照）。</li>
	<li>将约5 × 105个细胞分别加入第1–4管中。在400 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于500 µl Aldefluor检测缓冲液中。向第5管中加入10 µl DEAB（ALDH抑制剂），作为实验阴性对照。</li>
	<li>向第2管中加入5 µl活化Aldefluor试剂，用于补偿阳性对照，轻轻弹击混匀。向第4管中加入5 µl活化Aldefluor试剂，用于实验分析。轻轻弹击混匀后，立即将第4管中一半体积的细胞（250 µl）转移至含有DEAB的第5管中。</li>
	<li>轻轻弹击各管以充分混匀。所有管在37 °C避光孵育30–45分钟。孵育中途轻弹管壁，防止细胞沉底。孵育结束后在400 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于500 µl Aldefluor检测缓冲液中。</li>
	<li>对于需进行CD133染色的管（第3和第4管），直接向Aldefluor检测缓冲液中加入CD133-APC抗体（1:11稀释）。冰上避光孵育15分钟。将CD133染色管在400 × g条件下离心5分钟。用500 µl Aldefluor检测缓冲液洗涤一次。分别将细胞重悬于500 µl Aldefluor检测缓冲液中。</li>
	<li>将悬液通过带细胞筛网帽的聚苯乙烯圆底管进行过滤。确保全部液体体积均通过筛网过滤。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析细胞群体。使用第1–3管设置补偿对照。根据前向散射和侧向散射参数设门圈选细胞，注意排除细胞碎片。分别利用FL-1和FL-4通道确定ALDH+和CD133+双阳性细胞。</li>
	<li>使用流式细胞分析软件，确认培养条件提高了TIC细胞的比例，因为富含TIC的培养物中这两种标志物的染色阳性率应更高。 
	注意：除CD133和ALDH外，还可根据流式细胞仪的检测能力，在单一样本中分析其他卵巢癌TIC标志物。</li>
</ol>
5. 体内 皮下注射验证细胞群体的致瘤性
注意：本方案已获得机构审查委员会批准。将6至8周龄的雌性裸鼠按每笼3只分入实验组，注射前让其适应环境数天。遵循美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会规定的仁道实验准则对小鼠进行观察；监测体重、外观变化，包括体重增减超过20%、消瘦、腹泻或皮炎等情况，符合上述标准的小鼠应采用CO2窒息法实施安乐死。
<ol>
	<li>按照第2节所述收集培养物。将每种细胞群体重悬于1 ml PBS中。使用台盼蓝染色法计数活细胞。</li>
	<li>准备15 ml离心管。为进行三复孔测量，将1.5 × 106个活细胞用2 ml PBS稀释后加入每根离心管中（每只小鼠右侧 flank 皮下注射0.5 ml体积中含5 × 105个细胞）。对照组小鼠仅准备0.5 ml PBS。</li>
	<li>使用27 G针头，将传统贴壁培养、传统TIC培养、悬浮TIC培养的细胞悬液或PBS各0.5 ml，分别皮下注射至每组3只小鼠的右侧 flank。注射后将小鼠放回原饲养笼。</li>
	<li>每周两次称量小鼠体重，并使用游标卡尺测量可触及肿瘤的两个维度，确定肿瘤的长和宽。 
	注意：肿瘤潜伏期通常为20–50天，具体取决于细胞系。</li>
	<li>采用标准方法计算肿瘤湿重体积（V = (宽度)2 × 长度/2）。 
	注意：尽管本研究仅比较了第一代TIC与贴壁细胞的成瘤能力，但已有其他研究完成在类似培养条件下生长的TIC的体内连续传代实验11,20。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案提供了一种高效且稳定的方法，用于从已建立的卵巢癌细胞系中富集具有干细胞特性的细胞，该方法同样适用于原代患者样本。该方法可在多种细胞系中成功富集肿瘤起始细胞（TICs）。通过该方法，可及时鉴定出富集TIC和/或致瘤表型的培养条件，而无需耗费时间将TICs从细胞群体中与非TICs进行物理分离。通过将传统贴壁培养与TIC培养进行比较，并结合多种功能检测手段，可评估不同信号通路对TIC表型的相对贡献。若需要获得纯化的TIC群体，可在流式细胞术流程中加入荧光辅助或磁珠分选步骤，即可轻松实现分离。
然而需要牢记的是，即使同一种肿瘤类型的细胞系或患者样本，其肿瘤起始细胞（TIC）标志物（如 CD133、CD44 或 ALDH）的表达也可能存在差异。例如，我们发现 OVCAR-5 细胞中 CD44 的表达水平高于 CD133，而在 ACI-23 细胞中则相反。因此，应以小鼠体内肿瘤起始能力及流式细胞术分析作为确定 TIC 存在的决定性依据。根据本实验方案，在干细胞培养条件下培养卵巢癌细胞时， consistently 观察到较高的 ALDH 活性。有趣的是，在传统 TIC 培养条件下培养的 ACI-23 细胞中 CD133 表达 consistently 较高，而 ALDH 活性则在悬浮培养的 TIC 条件下达到最高。相比之下，TGS-3 原代腹水细胞在悬浮 TIC 条件下 CD133 阳性率仅有小幅升高，但在传统 TIC 条件下 ALDH 活性显著增强。这些结果凸显了卵巢癌细胞的异质性以及 TIC 常见的可塑性特征。为进一步支持这些方法可富集 TIC 的结论，还观察到 TRA-1-60 阳性细胞的富集。TRA-1-60 是一种多能性标志物，已被用于鉴定卵巢和睾丸的胚胎性癌以及前列腺癌 TIC30-32。尽管我们的方法已在多种细胞系中取得成功，但标准 TIC 培养条件可能更适用于某些卵巢癌细胞，而改良的悬浮培养条件则可能在其他卵巢癌细胞群体中更有效地富集 TIC。这再次强调了来源于患者及已建立的卵巢癌细胞系中所存在的预期异质性。
除了细胞表面标志物外，还有一些转录因子被证明可用于表征卵巢癌肿瘤起始细胞（TICs），包括 Nanog、Sox2 和 Oct-411，尽管这些标志物并非卵巢癌 TICs 所特有，而是代表了在胚胎干细胞多能性和分化过程中起重要作用的因子33,34。我们检测了这些因子蛋白水平的变化，发现 Nanog 的表达水平在 TIC 培养条件下升高，这与先前报道的结果一致13,35，同时 CD133、TRA-1-60 和 CD117 也呈上调。进一步通过人源干细胞标志物 cDNA 芯片分析显示，在 TIC 培养条件下，CD133、Nanog、Melk 和 PODXL 基因的表达水平较传统贴壁培养条件均有所增加。值得注意的是，与细胞表面标志物类似，与卵巢癌 TICs 相关的转录因子在不同细胞系和患者样本之间可能存在差异。
我们观察到，如果细胞本质上为非贴壁性，则可能具有更强的致瘤性，并表达更高水平的干细胞标志物 体外 (即， 不贴壁的细胞（即不易附着于贴壁培养皿的细胞）。在培养过程中，ACI-23等细胞系在传统培养条件下通常含有大量存活的悬浮细胞和/或以堆叠方式垂直生长的细胞。尽管从悬浮细胞和细胞聚集体中有效富集肿瘤起始细胞（TICs）的方法可能仅适用于少数细胞系，包括本研究中涉及的细胞系以及OVCAR-312我们的研究结果表明，这一群体可能具有更强的致瘤性。因此，收集在标准组织培养板和培养基中生长的“悬浮”细胞群体，可作为对商业干细胞培养基适应性较差的肿瘤起始细胞富集的替代方法。
采用本文所述的不同培养方法，将能够快速富集肿瘤起始细胞（TIC）群体，并更深入地理解支持不同细胞中此类表型的关键因素。该方法的当前应用包括鉴定对维持这一独特细胞群体扩增至关重要的信号通路。这些研究结果将有助于阐明肿瘤进展和复发的机制。

卵巢癌是美国致死率最高的妇科恶性肿瘤，其发病率和死亡率高的主要原因是该疾病具有高度复发性和化疗耐药性。初始治疗通常包括最大限度的细胞减灭术，随后进行以铂类为基础的化疗，尽管有部分证据表明，在某些情况下新辅助化疗可能有益1。大多数患者对初始治疗反应良好，但不幸的是，其中一半患者会在18个月内复发2。
大多数卵巢恶性肿瘤为上皮性癌，可能起源于卵巢或输卵管的表面上皮3,4。多项研究支持女性生殖系统中存在体细胞干细胞，这些干细胞可能在排卵后组织修复过程中发挥作用5,6。排卵期间卵巢和输卵管均表现出较高的增殖活性，这可能是卵巢癌发生的重要因素（Gharwan, et al. 手稿已提交）。肿瘤形成细胞的来源尚不明确，但它们可能来源于正常的干细胞、前体细胞或已分化细胞，通过突变导致其失去对分裂或细胞命运的调控能力。这些细胞也被称为“癌症干细胞”或“肿瘤起始细胞”（TIC），在低贴附条件下可形成具有致瘤性的多细胞球状体。尽管TIC发展的层级模型可能是动态变化的，但TIC确实与正常干细胞共享许多相似特征，包括静息状态、对化疗的耐药性、长期自我更新能力以及分化为多种细胞谱系的潜能7,8。
多项研究支持卵巢癌中存在肿瘤起始细胞（TICs），目前正在进行的研究致力于阐明这些细胞促进肿瘤发生的机制9-11。已有多种标志物被提出用于鉴定具有增强致瘤性的卵巢TICs，包括CD133、ALDH1A1、CD117、CD44和MyD88，但每种标志物的确切作用尚不明确，且可能具有细胞类型特异性11-16。尽管尚未明确确立适用于卵巢TICs的通用标志物或标志物组合，但不同研究团队更常通过筛选CD44+、CD133+细胞和/或具有高醛脱氢酶（ALDH）活性的细胞来分离卵巢TICs13,17-21。CD44是一种跨膜糖蛋白，作为透明质酸的受体，调控多种对肿瘤进展至关重要的过程，包括黏附、增殖、迁移、血管生成和分化22。CD133也是一种跨膜糖蛋白，其功能尚不完全清楚，但研究表明其可能参与质膜拓扑结构的组织23。ALDH是一种细胞内酶，可催化醛类的氧化反应，可能是TICs中最通用的标志物，因为在从多种组织中分离出的干细胞中均检测到高水平的ALDH活性，并且已发现ALDH在维持正常干细胞和TICs功能中具有多种作用24。截至目前，CD133和ALDH1似乎是卵巢TICs中最具可重复性的标志物13,21。
除了了解肿瘤起始细胞（TICs）的特性外，目前还有大量研究致力于鉴定能够特异性靶向这一亚群的药物。卵巢癌的高复发率可能是由于现有化疗手段未能有效根除肿瘤起始细胞所致。尽管肿瘤的主体部分对现有疗法敏感，但肿瘤起始细胞被认为具有耐药性，且其密度低至常规方法无法检测。阐明治疗耐药和肿瘤复发的机制，对于提高卵巢癌患者的治疗反应率和总体生存率至关重要。
本文描述了从已建立的和原代卵巢癌细胞系中富集肿瘤起始细胞（TICs）的培养技术。本文所述的培养条件已被多个研究团队用于诱导具有干细胞特性的TICs或球形细胞的扩增11,12,14,16,20。尽管目前有多种常用于富集TICs/球形细胞的干细胞培养基和添加剂，但我们采用了一种无血清培养基配方，添加EGF和FGF，但未加入B27或N-2添加剂。这些添加剂通常用于神经细胞培养和干细胞富集，已被证明可促进间充质表型25,26，而目前领域内仍存在争议，尚不清楚具有间充质表型还是上皮表型的TICs更具致瘤性27-29。为了尽量减少不确定性和变量因素，我们选择使用最常用的配方，因为我们研究的是上皮性卵巢癌细胞。
在无血清培养基中使用低贴附力培养瓶培养细胞，可促进细胞球的形成，并支持具有 CD133 表达和高 ALDH 活性的细胞扩增。我们的研究还表明，在常规贴壁培养条件下悬浮生长的细胞也可能代表更具肿瘤发生能力的肿瘤起始细胞（TIC）群体。将在此类条件下培养的细胞接种至裸鼠体内，其致瘤潜能高于在含血清条件下贴壁培养的细胞。通过应用这些技术，可深入了解肿瘤起始细胞在卵巢癌发生、进展、治疗反应及疾病复发中的作用。

<table><tbody><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 超低吸附培养瓶</td><td>Corning</td><td>3814</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.002</td><td></td></tr><tr><td>Aldefluor 试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD133-APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-090-826</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子—人重组</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>按制造商说明配制</td></tr><tr><td>表皮生长因子—人重组</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>将 0.2 mg 溶于 1 ml 无菌 PBS 中配制</td></tr><tr><td>DMEM:F12（含 L-谷氨酰胺，含 5 mM HEPES）</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>1×杜氏磷酸盐缓冲液（不含钙和镁）</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Cellstripper 非酶细胞解离液</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（热灭活）</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>带 CN 膜的快速无菌一次性滤器（0.45 &amp;mu;m）</td><td>Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 无菌聚丙烯离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 无菌聚丙烯锥形管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液（溶于 0.85% NaCl）</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 富集卵巢癌肿瘤起始细胞

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

有证据表明，肿瘤细胞中存在具有独特自我更新和分化能力的小亚群细胞，这些细胞可能负责肿瘤的起始和（或）复发。阐明这些肿瘤起始细胞（TICs）支持肿瘤形成与进展的机制，可能有助于开发出具有临床优势的治疗策略。卵巢癌是一种异质性强且高度易复发的疾病。近期研究表明，TICs可能在该疾病的生物学行为中发挥重要作用。我们已确定了一种培养条件，可从卵巢癌细胞系中富集TICs。在低贴附培养板中，使用无血清培养基并添加生长因子，培养贴壁细胞或非贴壁的“悬浮”细胞，可促进表达干细胞标志物（CD133和ALDH活性）且成瘤能力增强的卵巢癌TICs的扩增，而无需在培养过程中将TICs从其他细胞类型中进行物理分离。尽管并非所有细胞系均普遍存在悬浮细胞，但这种天然低贴附特性的细胞群体可能具有较高的成瘤潜能。与在含血清条件下培养的贴壁细胞相比，TICs更易形成细胞球，在小鼠体内具有显著更高的成瘤性，并表达潜在的干细胞标志物。该培养体系易于快速建立，可用于研究维持干细胞特性的信号通路，并筛选靶向TICs的药物或药物组合。本文所述的培养条件适用于多种上皮来源的卵巢癌细胞，在深入理解TICs于肿瘤起始、进展及复发中所起作用方面将发挥关键作用。

在含有血清的传统贴壁培养条件下培养的已建立的卵巢癌细胞系和原发性腹水细胞系呈贴壁生长，具有鹅卵石样形态，而在肿瘤起始细胞（TIC）培养条件下培养的相同细胞则呈现悬浮的球状形态，这是TIC群体中常见的特征。图1A中的明场图像清晰地展示了不同培养条件下的形态学差异。图1B显示了将ACI-23和TGS-3的TIC培养物重新接种至传统贴壁培养条件后所获得的分化形态。在重新接种至贴壁条件仅24小时后，大多数多细胞球体发生解离并贴附于培养表面，形态上类似于典型的贴壁细胞。
为验证TIC条件是否富集了具有干细胞标志物的细胞，我们采用两种常见的卵巢TIC标志物——CD133表达和ALDH活性，进行了流式细胞术分析。图2A中的散点图显示，在低贴附、无血清条件下，CD133+细胞的比例显著升高。类似地，与传统的贴壁培养条件相比，这些条件下ALDH酶的活性也更高。尽管传统贴壁培养中也存在CD133+细胞，但在促进球体形成的条件下，其比例有所增加。对多能性标志物TRA-1-60的分析进一步支持了TIC条件能够富集TIC的观点，见图2B。图2C中的定量分析表明，双阳性（CD133+ALDH+）的ACI-23细胞主要局限于在TIC富集条件下培养的细胞中。此外，还检测了ACI-23细胞在TIC条件下培养5天后不同转录因子蛋白水平的变化。图2D显示，从传统培养到悬浮TIC条件，各标志物均呈现逐步上升趋势，而贴壁培养中的表达水平相对较低。有趣的是，在不同条件下培养的人类腹水细胞系在传统TIC条件下表现出最高的标志物表型，而在悬浮TIC条件下几乎无染色信号，见图2E。
通过将各培养条件下获得的等量活细胞皮下注射到无胸腺裸鼠群体中，验证了肿瘤起始细胞（TIC）培养条件的成瘤能力。图3显示，来自传统贴壁培养的ACI-23（A，B）和OVCAR-5（C）细胞的成瘤性低于TIC培养条件下的细胞。值得注意的是，悬浮型TIC培养产生的肿瘤更大且出现时间更短，相较于传统贴壁培养或传统TIC培养。这些数据表明，即使卵巢肿瘤起始细胞标志物仅有轻度增加，也会发生显著的表型改变。然而，在其他细胞系中（未显示），传统TIC培养细胞的成瘤性高于传统贴壁培养和悬浮型TIC培养细胞。
<img alt="不同条件下的细胞形态；显微镜图像；细胞培养比较；ACI-23、OVCAR5、CAOV3、TGS-3。" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 不同培养条件下类球体的形成。（A）建立的卵巢癌细胞系（ACI-23、OVCAR-5 和 CAOV3）以及来源于患者腹水的原代细胞（TGS-3）在无血清干细胞培养基的低黏附培养瓶中可迅速形成多细胞类球体。图像显示，在传统贴壁培养条件下，ACI-23、OVCAR-5、CAOV3 和 TGS-3 细胞均维持上皮样铺路石形态，而相同细胞在肿瘤起始细胞（TIC）培养条件下于96小时内形成类球体。比例尺：100 µm。（B）在传统贴壁培养条件下培养24小时后，原本在TIC培养条件下的类球体呈现分化表型，形态恢复至原始贴壁生长状态。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="AC-23细胞系流式细胞术图；CD133/ALDH1分析；蛋白表达；TNA-160图表。" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 低贴附、无血清条件富集具有肿瘤起始细胞（TIC）标志物的细胞。（A）使用APC标记的CD133抗体对ACI-23细胞进行流式细胞术分析，显示在低贴附培养瓶中，采用无血清干细胞培养基培养时，CD133+细胞比例升高。采用Aldefluor法进行的流式细胞术分析显示，在低贴附培养瓶中以无血清干细胞培养基培养的细胞中，ALDH活性升高。CD133阴性对照未加抗体，ALDH阴性对照为在ALDH抑制剂（DEAB）存在下的活化底物。（B）使用FITC标记的TRA-1-60抗体进行分析，显示在ACI-23细胞中，漂浮型TIC条件下TRA-1-60+细胞比例最高。阴性对照未加抗体。（C）在ACI-23细胞系中，传统TIC条件和漂浮型TIC条件下CD133+ALDH+细胞比例最高。误差线：标准误（SEM），N = 6，*p &lt; 0.05。（D）Western blot分析显示，ACI-23细胞在TIC条件下培养5天后，干细胞转录标志物的蛋白水平升高。全细胞裂解液（50 µg）以GAPDH作为上样对照进行检测。（E）TGS-3原代腹水细胞的代表性点图，分析方法同A。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤生长曲线、实验条件比较、小鼠研究中的平均肿瘤重量。" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 低附着、无血清培养条件可富集具有更高致瘤能力的细胞。 （A）将5 × 105个活ACI-23细胞以三复孔形式皮下注射至裸小鼠体内。每周两次称量小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤大小。A = 传统贴壁培养，F = 悬浮TIC培养，S = 传统TIC培养。*p &lt; 0.05。（B）分别在不同培养条件下培养ACI-23细胞25天后形成肿瘤的代表性图像。（C）将5 × 105个活OVCAR-5细胞以三复孔形式皮下注射至裸小鼠体内，并按（A）中方法进行监测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

肿瘤起始细胞（TICs）可能是治疗卵巢癌这一高复发性且致命性疾病的一个有效治疗靶点。本文介绍了一种培养条件的实验方案，可富集此类高致瘤性的细胞群体。

有证据表明，肿瘤细胞中存在具有独特自我更新和分化能力的小亚群，这些细胞可能是导致肿瘤...

以下实验的总体目标是确定最有利于富集卵巢癌肿瘤起始细胞的培养条件。首先将目标细胞转移至含有生长因子的无血清干细胞培养基中的低吸附培养瓶中进行培养；第二步通过流式细胞术检测细胞的CD133表达水平和ALDH活性。接下来，将肿瘤起始细胞标志物富集程度最高的培养细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠体内，以验证这些细胞培养物的成瘤性。最终，可通过流式细胞术和皮下异种移植模型来确定能够诱导出最高比例卵巢癌肿瘤起始细胞的培养条件。我们最初产生这一方法的想法，是由于注意到某些细胞系具有异常的生长特性，并以游离悬浮细胞簇的形式旺盛生长，这种表型很可能类似于卵巢癌患者体内实际发生的情况。该技术的应用前景涉及卵巢癌的治疗，因为卵巢癌具有较高的化疗耐药性复发率，且大量证据表明肿瘤起始细胞参与了这一现象。要建立漂浮型肿瘤起始细胞培养体系，首先将一个80%汇合度的细胞培养物中的悬浮细胞转移至一个50毫升的聚丙烯离心管中，在细胞离心沉淀的同时，向一个超低吸附表面的75平方厘米聚苯乙烯组织培养瓶中加入10毫升添加了生长因子的干细胞培养基，并在瓶上标记细胞系名称、日期和传代次数。随后吸除离心管中的上清液，将沉淀细胞重悬于6毫升干细胞培养基中。将细胞转移至培养瓶中，放入设定为37摄氏度、5%二氧化碳的湿化细胞培养箱中，每两到三天观察一次细胞，以监测类固醇形成，从而建立传统的肿瘤起始细胞培养体系。弃去80%汇合度细胞培养中的悬浮细胞，用预热的PBS洗涤贴壁细胞。接着，在室温下用1.5毫升胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞使其脱离。 三到五分钟之后，加入六毫升干细胞培养基终止反应，并将细胞悬液反复吹打数次，使细胞从培养瓶表面脱落。将解离后的细胞转移至含有十毫升干细胞培养基（添加生长因子）的超低吸附表面聚苯乙烯75平方厘米组织培养瓶中。随后将培养瓶放入细胞培养箱，并每隔48至72小时补充两毫升干细胞培养基及新鲜生长因子。监测传统的肿瘤起始细胞培养，直至细胞融合度达到60%至80%。然后通过将上清液等量转移至两个新的超低吸附培养瓶中，并加入足够的新鲜干细胞培养基，使最终体积达到18毫升，从而从化疗耐药患者的腹水中生成多细胞类固醇培养物。开始操作时，打开一升无菌真空瓶装腹水液体的瓶盖，将10毫升腹水转移至含有10毫升传统培养基的聚苯乙烯75平方厘米组织培养瓶中。将培养瓶放入细胞培养箱中培养72至96小时，当细胞融合度达到60%至80%时，进行首次完全换液。按前述方法将培养物以1:2比例传代，用于建立肿瘤起始培养物，以供后续细胞流式细胞术分析。首先，根据表格中列出的每种培养条件，标记五个1.5毫升离心管。接下来，将约500,000个细胞分别加入第1至第4号管中。然后离心收集细胞，将沉淀重悬于500 µL的Ala-Flu检测试剂缓冲液中，并向5号管中加入10 µL的DEAB（一种LDH抑制剂）。作为实验阴性对照，向2号和4号管中各加入5 µL活化的Ala-Theor试剂，轻轻弹动各管以混匀。随后立即从4号管中转移一半体积的细胞悬液至5号管，同样通过轻弹混匀5号管，然后将所有试管在37°C避光条件下孵育30至45分钟。孵育结束后，将所有试管离心，沉淀用 500 µL alor 检测缓冲液重悬。接着，向 3 号和 4 号试管中加入 CD133-APC，冰上避光孵育。15 分钟后，将细胞离心两次，沉淀用 500 µL alor 检测缓冲液重悬。然后将所有细胞悬液分别通过带有细胞筛网帽的聚苯乙烯圆底管进行过滤。确保全部体积均通过筛网帽过滤，随后使用第1至第3管在流式细胞仪上设置补偿对照，并根据前向散射和侧向散射参数对细胞设门，注意排除碎片。使用 FL1 和 FL4 通道分别建立 A LDH 和 CD133 双阳性细胞，然后对细胞进行分析。富含肿瘤起始细胞的培养物中，A LDH 和 CD133 细胞表面标志物的染色水平将高于非肿瘤起始细胞的培养物。为确认肿瘤起始细胞的成瘤性，首先按照前述方法从多细胞 OID 培养物中收集细胞。将每种细胞群体重悬于1毫升PBS中，然后通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量。接着，将1,500,000个细胞用2毫升PBS稀释后加入每种肿瘤对应的三个15毫升锥形管中，以启动细胞培养条件。随后使用27号针头，将0.5毫升来自传统贴壁培养、传统肿瘤起始细胞（TIC）悬浮培养、TIC培养或仅PBS的细胞，分别皮下注射至每组三只小鼠的右侧 flank 部位，注射后将每只小鼠放回原笼。最后称量动物体重，并使用游标卡尺每周两次以两个维度测量可触及肿瘤的大小，以确定肿瘤的长度和宽度，如这些点状图所示。与传统的贴壁培养相比，多细胞类球体培养中CD133阳性细胞比例升高，同时伴有更高的ALDH酶活性证据以及在无血清低黏附条件下生长，表明其中富集了肿瘤起始细胞群体。尽管传统贴壁培养中也含有CD133阳性细胞，但在有利于类球体（OID）形成的条件下，多能性标志物分析显示其阳性比例进一步升高。进一步绘制一个60可充分证实，肿瘤启动细胞的培养条件富含肿瘤启动细胞，事实上，CD133与ALDH双阳性AC123细胞主要局限于在促进肿瘤启动细胞生长的条件下培养的细胞中。从传统贴壁培养到悬浮肿瘤启动细胞培养条件，这些不同转录因子的表达水平呈现逐步升高趋势，相比之下，贴壁培养中的表达水平相对较低。最后，正如预期，来自传统贴壁培养的AC125和OVR5细胞的成瘤性低于来自肿瘤启动细胞培养的细胞。更重要的是，悬浮肿瘤启动细胞培养的细胞比传统贴壁培养或传统肿瘤启动细胞培养的细胞在更短时间内形成更大的肿瘤。这些数据表明，即使卵巢肿瘤起始细胞标志物仅有适度增加，富集培养的肿瘤起始细胞在表型上也会发生显著变化。在进行该操作时，需注意定期监测细胞状态，并及时补充新鲜培养基和生长因子。每两到三天更换一次培养基；培养时间过短不足以实现有效富集，而培养时间过长则可能导致细胞发生分化，进而导致其肿瘤形成能力相关标志物的丢失。

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体外富集卵巢癌肿瘤起始细胞

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