在卵巢癌肿瘤起始细胞体外富集
February 18th, 2015
肿瘤起始细胞 （TIC） 可能代表治疗卵巢癌的可行治疗靶点，卵巢癌是一种高度复发和致命的疾病。我们提出了一种培养条件方案，这些条件富集了这种高度致瘤的细胞群。
以下实验的总体目标是确定最富集卵巢癌肿瘤起始细胞的培养条件。这是通过首先将目标细胞转移到含有生长因子的无血清干细胞培养基中的低附着瓶中来实现的。作为第二步，进行流式细胞术以评估细胞的 CD 1、33 表达和 A LDH 活性。
接下来，将来自培养物中对肿瘤起始细胞标志物最富集的细胞皮下注射到免疫功能低下的小鼠中，以验证培养物的肿瘤生成性。最终，流式细胞术和皮下异种移植模型可用于确定引发最高百分比的卵巢癌肿瘤起始细胞的培养条件。当我们注意到我们的一些细胞系具有不寻常的生长特性并且似乎以自由漂浮的簇状生长时，我们第一次想到了这种方法，这种表型可能类似于卵巢癌患者体内发生的情况。
该技术的意义延伸到卵巢癌的治疗，因为卵巢癌的化疗耐药性疾病复发率很高，并且大量证据表明肿瘤起始细胞会导致这种现象为了产生漂浮的肿瘤起始细胞培养物，首先将 80% 共流细胞培养物的漂浮细胞转移到 50 毫升聚丙烯离心管中，同时细胞正在旋转。将 10 毫升补充有生长因子的干细胞培养基添加到标有细胞系名称、日期和传代号的超低附着表面聚苯乙烯 75 平方厘米组织培养瓶中。然后从离心管中吸出上清液，并将沉淀重悬于 6 毫升干细胞培养基中。
将细胞转移到培养瓶中，并将它们置于设置为 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿细胞培养箱中，每两到三天监测一次细胞，以观察类固醇的形成，从而产生传统的肿瘤起始细胞培养。丢弃 80% 汇合细胞培养物中的漂浮细胞，并用温热的 PBS 洗涤贴壁细胞。接下来，在室温下用 1.5 mL 胰蛋白酶 EDTA 溶液分离细胞。
3 到 5 分钟后，用 6 mL 干细胞培养基终止反应，并将细胞溶液研磨几次，以使细胞从培养瓶表面松动。将解离的细胞转移到超低附着表面聚苯乙烯 75 平方厘米的组织培养瓶中，该培养瓶含有 10 毫升干细胞培养基，并补充有生长因子。然后将培养瓶放入细胞培养箱中，每 48 至 72 小时补充一次细胞，再添加 2 毫升干细胞培养基和新鲜生长因子。
监测传统的肿瘤起始细胞培养物，直到达到 60% 至 80% 的汇合度。然后通过将等体积的上清液转移到两个新的超低附着瓶中来分离培养物，并加入足够的新鲜干细胞培养基以达到 18 毫升的最终体积，以从化疗耐药患者腹水中生成多细胞类固醇培养物。开始从 1 升无菌真空瓶中取下瓶盖，将 10 毫升腹水转移到装有 10 毫升传统培养基的 75 平方厘米聚苯乙烯组织培养瓶中。
将培养瓶置于细胞培养箱中 72 至 96 小时，然后在细胞达到 60% 至 80% 汇合时进行第一次完全培养基更换。如刚才所示，将培养物一至二分开，用作肿瘤起始培养物，以留在细胞中进行流式Cyto指标分析，首先为表中列出的每种培养条件标记五个 1.5 毫升的 einor管。接下来，将大约 500， 000 个细胞分配到 1 至 4 管中。
然后离心细胞，将沉淀重悬于 500 μL 的 Fluor 检测缓冲液中，并向 5 号试管中加入 10 μL DEAB 和 A LDH 抑制剂。对于实验阴性对照，向试管中加入 5 微升活化的 al theor 试剂，然后轻弹每根试管 4 次以混合。然后立即将细胞体积的一半从试管 4 转移到试管 5 中，也轻弹混合试管 5，然后将所有试管在 37 摄氏度避光孵育 30 至 45 分钟。
在孵育期结束时，旋转所有试管并将沉淀重悬于 500 微升 alor 测定缓冲液中。接下来，将 CD 1 33 A PC 添加到试管 3 和 4 中，并在避光的冰上孵育试管。15 分钟后，将细胞离心两次，并将沉淀重悬于 500 μL alor 检测缓冲液中。
然后通过带有细胞过滤器盖的单个聚苯乙烯圆底管过滤所有细胞悬液。确保整个体积通过盖子过滤，然后使用 1 到 3 号管在流式细胞仪上设置补偿控制，使用前向和侧向散射参数对细胞进行门控。注意排除碎屑。
使用 FL one 和 FL 四个通道分别建立 A LDH 和 CD 1 33 双阳性细胞，然后分析细胞。与非肿瘤起始细胞培养物相比，肿瘤起始细胞丰富的培养物将表现出更高水平的 A LDH 和 CD 1 33 细胞表面标志物染色。为了确认肿瘤起始细胞的肿瘤致病性，首先从多细胞 OID 培养物中收集细胞，如刚才所示。
将每个细胞群重悬于一毫升 PBS 中，然后通过 trian 蓝色排除法确定活细胞的数量。接下来，将 1， 500， 000 个用 2 毫升 PBS 稀释的细胞添加到每个肿瘤的三个 15 毫升锥形管中，开始细胞培养条件。然后使用 27 号针头，将来自传统贴壁培养物、传统 TIC 培养物漂浮物、TIC 培养物或 PBS 的细胞单独皮下注射到每组每三只小鼠的右侧腹腔，每只小鼠注射后将每只小鼠放回原来的笼子。
最后，称重动物并每周两次用旋转卡尺在二维上测量任何可触及的肿瘤，以确定肿瘤的长度和宽度，如这些点图所示。与传统贴壁培养相比，CD 1 33 阳性细胞的百分比增加，加上 A LDH 酶活性的更高证据和低附着血清游离条件，表明多细胞类固醇培养物中富含肿瘤起始细胞群。尽管传统的贴壁培养物含有 CD 1 33 阳性细胞，但在增强多能性标志物的 OID 形成分析的条件下，百分比会增加。
Draw one 60 进一步证实，肿瘤起始细胞培养条件和丰富的肿瘤起始细胞，事实上 CD 1 33 A LDH 双阳性 a CI 1 23 细胞在很大程度上局限于在肿瘤起始细胞增强条件下生长的培养物，并且与贴壁培养物中明显的相对较低的水平相比，从传统到漂浮性肿瘤起始细胞条件观察到这些不同转录因子中的每一种进行增加。最后，正如预期的那样，观察到来自传统贴壁培养物的 CI 1 25 和 OV R 5 细胞比来自肿瘤起始细胞培养物的细胞致瘤性更低。与传统贴壁细胞或传统肿瘤起始细胞培养物一起培养相比，引发的漂浮瘤细胞培养物在更短的时间内产生更大的肿瘤。
这些数据表明，即使卵巢肿瘤起始细胞标志物略有增加，肿瘤起始细胞富集培养物也存在显著的表型变化。在尝试此过程时，重要的是要记住监测细胞并用新鲜培养基和生长因子补充细胞。每两到三天培养期过短将无法提供足够的富集时间，过长可能会导致细胞分化，随后导致其肿瘤致病性标志物丢失。
概述
本研究提出了一种从卵巢癌细胞培养物中富集肿瘤起始细胞（TICs）的协议。富集的TICs可以作为治疗这种复发性和致命疾病的治疗靶点。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 癌症研究
背景
- 卵巢癌以高复发率和对化疗的耐药性而闻名。
- 肿瘤起始细胞被认为会导致治疗耐药。
- 识别TICs的有效培养条件可以增强治疗策略。
- 流式细胞术是评估TIC标志物的关键技术。
研究目的
- 识别富集卵巢癌TICs的最佳培养条件。
- 验证富集的TIC培养物的致瘤性。
- 探讨TICs在卵巢癌治疗中的意义。
使用的方法
- 将细胞转移到无血清培养基的低附着培养瓶中。
- 进行流式细胞术以评估细胞表面标志物。
- 将富集的细胞注射到免疫缺陷小鼠中进行致瘤性测试。
- 监测细胞培养物中TICs的生长和富集情况。
主要结果
- 培养条件显著影响TICs的富集。
- 流式细胞术显示富集培养物中TIC标志物水平更高。
- 皮下注射确认了TICs的致瘤潜力。
- 该方法为研究卵巢癌中的TICs提供了可靠的方法。
结论
- 可以使用特定协议有效地生成富集的TIC培养物。
- 了解TICs可能会导致卵巢癌的改良治疗策略。
- 未来的研究应该集中于靶向TICs以减少复发率。
常见问题
Executive Industry Relevance
Enriching ovarian cancer tumor-initiating cells (TICs) in vitro addresses a critical challenge in modeling tumor heterogeneity and recurrence risk during early discovery. This approach enables mechanistic de-risking and target validation by isolating cell populations with high tumorigenic potential and stem cell marker expression. The method supports predictive confidence for downstream screening and translational research in ovarian cancer portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tumorigenic subpopulations for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the role of TICs in tumor initiation and relapse.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing high-risk cellular phenotypes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated TIC-enriched cultures for robust downstream compound screening.
- Standardizes marker-based quantification using flow cytometry for reproducibility.
- Enables quantitative assessment of drug effects on TIC populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro TIC enrichment with in vivo tumorigenicity validation in xenograft models.
- Supports continuity from discovery through preclinical evaluation of candidate therapeutics targeting TICs.
- Provides a disease-relevant system for assessing relapse and resistance mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This TIC enrichment protocol integrates from early discovery through preclinical validation, bridging in vitro mechanistic studies with in vivo tumorigenicity assessment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on TIC-driven tumor initiation and progression.
- Screening: Provides reproducible, marker-defined TIC cultures for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative flow cytometry outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro TIC enrichment to in vivo tumorigenicity and relapse modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable across ovarian cancer cell lines of epithelial origin.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of TIC enrichment and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying TIC-driven risk in candidate selection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapies targeting tumor-initiating subpopulations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, flow cytometry, and in vivo xenograft modeling.
- Needs access to low-attachment cultureware, serum-free media, and growth factors.
- Demands standardized gating and marker analysis for cross-team reproducibility.
- Adaptable to various ovarian cancer cell lines but may require optimization for specific phenotypes.
- Culture duration and media replenishment are critical to maintain TIC enrichment and marker expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Multicellular Spheroid Generation from Ovarian Cancer Cell Lines
5:02
Cell Staining for Flow Cytometric Confirmation of Tumor-initiating Cells (TIC) Markers
7:39
Confirmation of Tumorigenicity by In vivo Subcutaneous Injections of TIC Cultures
9:03
Results: Low-attachment, Serum-free Conditions Enrich for Cells with TIC Markers and Tumorigenicity
11:06
Conclusion
