Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Förmågan hos inflammerat endotel att rekrytera leukocyter från flödet regleras av mesenkymala stromaceller. Vi beskriver två in vitro-modeller innehåller primära humana celler som kan användas för att bedöma neutrofila rekrytering från flödet och undersöka vilken roll mesenkymala stromaceller spela i regleringen av denna process.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stromalceller reglerar rekryteringen av cirkulerande leukocyter under inflammation genom överhörning med grann endotelceller. Här beskriver vi två in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av cirkulerande neutrofiler från flödet av inflammerade endotelceller. En stor fördel med dessa modeller är förmågan att analysera varje steg i leukocytadhesionen kaskad i ordning, som skulle uppträda in vivo. Vi beskriver också hur båda modellerna kan anpassas för att studera rollen av stromaceller, i detta fall mesenkymala stamceller (MSC), i regleringen av leukocytrekrytering.

Primära endotelceller odlades ensamma eller tillsammans med humant MSC i direkt kontakt på Ibidi microslides eller på motsatta sidor av en Transwell-filter under 24 timmar. Kulturer stimulerades med tumömekrosfaktor alfa (TNFa) under 4 h och införlivas i en flödesbaserad vidhäftningsanalys. En bolus av neutrofiler perfunderadesöver endotelet under 4 min. Fångst av flödande neutrofiler och deras interaktioner med endotelet visualiserades genom faskontrastmikroskopi.

I båda modellerna, ökad cytokin-stimulering endothelial rekrytering av flödande neutrofiler i ett dosberoende sätt. Analys av beteendet av rekryterade neutrofiler uppvisade en dosberoende minskning i valsning och en dosberoende ökning av transmigration genom endotelet. I co-kultur, MSC tryckt neutrofiladhesion till TNF-stimulerad endotel.

Våra flödesbaserade-vidhäftningsmodeller likna de inledande faserna av leukocytrekrytering från cirkulationen. Förutom leukocyter, kan de användas för att undersöka rekrytering av andra celltyper, såsom terapeutiskt administrerade MSC eller cirkulerande tumörceller. Våra flerskiktade co-kultur-modeller har visat att MSC kommunicerar med endotel att ändra sitt svar på pro-inflammatoriska cytokiner, Altering rekrytering av neutrofiler. Ytterligare forskning med hjälp av sådana modeller krävs för att till fullo förstå hur stromaceller från olika vävnader och villkor (inflammatoriska sjukdomar eller cancer) påverka rekryteringen av leukocyter under inflammation.

Introduction

Inflammation är ett skyddande svar på mikrobiell infektion eller vävnadsskada som kräver tät reglering av leukocyt inträde i och utträde ur den inflammerade vävnaden att tillåta upplösning 1,2. Överhörning mellan endotelceller (EG) att linje blodkärl, cirkulerande leukocyter och vävnads bosatt stromaceller är avgörande för att samordna denna process 3. Men okontrollerad rekrytering av leukocyter och deras ineffektiva avslut främja utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar 4. Vår nuvarande förståelse av leukocytrekrytering i hälsa och sjukdom är ofullständig och mer robusta modeller behövs för att analysera denna process.

De mekanismer som stöder rekryteringen av leukocyter från blod genom kärl EG i postkapillära venoler har väl beskrivits 1,2,5. Cirkulerande leukocyter fångas av specialiserade receptorer (t.ex. VCAM-1, E-selektin, P-selektin), vilkaär uppreglerat på inflammerat endotel. Dessa transienta interaktioner tillåter leukocyter att interagera med ytan bundna kemokiner och lipid-härledda mediatorer (antingen endotelceller eller stromala ursprung) som aktiverar integriner som uttrycks av leukocyter 6- 11. Detta i sin tur stabiliserar vidhäftning och enheter migration över endotelet och in i vävnaden 12- 15. Inom mjukpapper, rekryterade leukocyter utsätts för stromala-härledda ämnen som påverkar deras rörlighet, funktion och överlevnad 16,17. Växande bevis tyder starkt på att signaler som tas emot i varje skede av rekryteringsprocessen villkor leukocyter för nästa. Dock kvarstår vår förståelse av leukocytrekrytering ofullständig och mycket lite är känt om komponenter formande leukocyt rörelse inom mjukpapper.

I Birmingham har vi utvecklat flera in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av leukocyter frånflöde 9,18,19. Vi förstår nu att vaskulär EG agera som omedelbara regulatorer av leukocytrekrytering reagera på förändringar i sin lokala mikromiljö. Specifikt kan vävnads bosatt stromaceller aktivt reglera det inflammatoriska svaret, delvis av att samtala med grannkärl EG att påverka sin roll i rekryteringen 3. Vi har tidigare visat att olika stromaceller modulera förmågan hos EG att stödja adhesion och migration av leukocyter i ett vävnadsspecifikt sätt, och att dessa effekter blir förändrad i kroniska sjukdomar 13,16,20,21. Således stromaceller etablera vävnads "adress-koder" som definierar ramen för varje inflammatoriskt svar 22. På senare tid har vi visat att benmärg härledd MSC (BMMSC) potent nedreglera svaret från EG till cytokiner, vilket leder till en minskning av rekrytering av både neutrofiler och lymfocyter 23.

Mekanismerna governing rekrytering klar in vitro har i stor utsträckning använt analyser innehåller en enda celltyp (t.ex. EG) eller protein isolerat. Men dessa studier inte hänsyn till effekterna av den lokala vävnadsmiljön (dvs. förekomst av stromaceller) om rekrytering av leukocyter och deras efterföljande migration in i vävnaden. Här beskriver vi två flödesbaserade metoder där stromaceller, speciellt mesenkymala stamceller (MSC), samar odlade med EG 23. Sådana modeller tillåter oss att undersöka effekten av stromal cell på endotelceller svar, särskilt deras förmåga att stödja leukocytrekrytering från flödet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering och odling av primära humana endotelceller och mesenkymala stamceller

  1. Isolering och odling av humana umbilikalvensendotelceller (HUVEC):
    1. Sätt navelsträngen på en bricka med hushållspapper och spraya med 70% etanol. Placera i en vävnadskultur huva. Identifiera venen och kanylera i båda ändar. Placera ett buntband runt kanyl änden för att fästa den.
    2. Skölj venöst blod med PBS med hjälp av en spruta. Fyll sprutan med luft och passera genom venen för att ta bort och kassera den resterande PBS.
    3. Tina 10 mg / ml kollagenas typ Ia och späd 1:10 i PBS (med kalcium och magnesiumklorid) till en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Pass kollagenas lösning i venen tills båda kanyler är fyllda. Stäng klämmorna på kanyler i båda ändar.
    4. Täck facket med vävnad och spraya med 70% etanol. Placera sladden i en inkubator i 20 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
    5. Ta ut linanav inkubatorn och dra åt buntband. Massera linan försiktigt under 1 minut. Spola cellsuspensionen med 10 ml PBS och samla i en 50 ml centrifugrör.
    6. Fyll sprutan med luft och passera genom venen för att avlägsna eventuellt kvarvarande PBS två gånger, uppsamling av PBS i en 50 ml centrifugrör användes i steg 1.1.5. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT.
    7. Sug supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml komplett EG medel. EG-medium består av M199 supplementerat med 35 | ig / ml gentamicinsulfat, 10 ng / ml human epidermal tillväxtfaktor, en pg / ml hydrokortison, 2,5 ng / ml amfotericin B, och 20% fetalt kalvserum.
    8. Tillsätt 4 ml EG medium och EG suspensionen till en 25 cm 2 kolv. Ändra medium på följande dag och sedan varje 2 dagar.
    9. EG uppvisar en kullersten liknande morfologi (Figur 1ai). För vidhäftningsanalyser, är EG allmänhet seedade när de når 100% sammanflödet (se avsnitt 1.4
  2. Isolering av Wharton s gelé mesenkymala stamceller (WJMSC) från mänskliga navelsträngar:
    1. Isolera Wharton gelé-derived MSC (WJMSC) från färska navelsträngar eller från sladdar som redan har använts för att isolera EG. Skär navelsträng i 5 cm långa bitar. Skär varje del i längdled för att avslöja blodkärlen (2 artärer [vita, stela] och 1 ven [gul, utspänd]).
    2. Använda steril sax och pincett bort blodkärlen och kasta. Klipp alla vävnaden till 2 - 3 mm 3 st. Använd pincett plats 2-3 mm 3 stycken i ett 50 ml centrifugrör.
    3. Tina 100 mg / ml förråds kollagenas typ II och späd 1: 100 i 10 ml PBS till en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Tina 20000 U / ml förråds hyaluronidas och späd 1: 400 till en slutlig koncentration av 50 U / ml i den kollagenaslösning.
    4. Lägg enzymatisk cocktail till centrifugröret som innehåller vävnadsfragment. Inkubera vävnads fragmenteringts för 5 timmar vid 37 ° C på en långsam rotator.
    5. Späd cellsuspensionen 1: 5 i PBS. Placera en 100 | im por-filter i en ny 50 ml centrifugrör. Häll cellsuspension på 100 | im por-filter.
      OBS: Återstående vävnadsfragment kommer att behållas på filtret och cellerna kommer att samlas i 50ml centrifugrör.
    6. Kassera filtret. Centrifugera cellsuspensionen vid 400 xg under 10 min vid RT. Aspirera supernatanten och återsuspendera WJMSC pelleten i 12 ml fullständigt WJMSC odlingsmedium (DMEM med låg glukos, 10% FCS och 100 U / ml penicillin + 100 | ig / ml streptomycin mix).
    7. Seed alla celler i en 75 cm 2 vävnadsodlingskolv. Ändra mediet efter 24 h med 12 ml fullständigt WJMSC odlingsmedium. Byt medium var 2-3 dagar. Celler bör nå 70-80% sammanflödet inom 2 veckor. Passage när WJMSC når 70-80% sammanflödet (se avsnitt 1.4).
  3. Utbyggnad av benmärg-härledda MSC (BMMSC): Isolera human benmärg-härledda MSC (BMMSC) såsom tidigare beskrivits 24. Tillsätt 10 ml förvärmda MSC tillväxtmedel (MSCGM) i en 15 ml centrifugrör.
  4. Tina en flaska med p2 BMMSC genom att placera i ett 37 ° C vattenbad under 2 minuter. Till BMMSC suspensionen till centrifugröret innehållande MSCGM. Blanda väl genom pipettering.
  5. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT. Sug ut supernatant helt.
  6. Resuspendera cellerna i 1 ml MSCGM och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en digital cellräknare såsom en cellometer.
  7. Seed celler i 75 cm 2 odlingskolvar vid en densitet av 5000 - 6000 celler per cm 2 i 12 ml MSCGM. Ändra mediet efter 24 timmar med 12 ml MSCGM. Foder celler med 12 ml MSCGM varje 2-3 dagar.
  8. Passage när BMMSC når 70-80% sammanflödet (se avsnitt 1.4). Celler uppvisar en fibroblastisk morfologi (Figur 1Aii).
  • Avlossning av EG och MSC: Aspirera medium från 25 cm 2 odlingskolvar. Tillsätt 2 ml av 0,02% EDTA under ca 2 min. Aspirera EDTA och tillsätt 2 ml trypsin (2,5 mg / ml). Utsikt under mikroskop tills cellerna blir runda.
  • Tryck kolven att lossa cellerna. Inaktivera trypsinet genom att tillsätta 8 ml odlingsmedium (beroende på celltyp; EG medium för HUVEC, DMEM LG för WJMSC och MSCGM för BMMSC) till odlingskolven och överföra suspensionen till en 15 ml centrifugrör.
  • Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT. Sug ut supernatant och suspendera pelleten som beskrivs nedan.
    1. För passage av MSC, resuspendera pelleten i 3 ml odlingsmedium. Lägg 11 ml odlingsmedium i tre separata 75 cm 2 odlingskolvar. Tillsätt 1 ml cellsuspension till varje odlingskolv (1: 3 split). Passage WJMSC och BMMSC 3 gånger (P3) före användning i samarbete kulturanalyser.
    2. För sådd EG eller MSC i adhesionsanalyser - se avsnitten 2 och 3.
  • Frysning MSC:
    1. Vid passagen 3 detach MSC som beskrivs i avsnitt 1.4. Aspirera supernatanten och återsuspendera i 3 ml iskall CryoSFM. Pipettera 1 ml alikvoter av cellsuspension i 1,5 ml iskall kryokärl. Sätt cryovials i en frysbehållare.
    2. Förvara behållaren vid -80 ° CO / N. Överföring till flytande kväve. Tina flaska med MSC (uppföljning steg 1.3.1 - 1.3.6). Resuspendera MSC i 5 ml odlingsmedium (välj lämpligt medium för WJMSC eller BMMSC) och frön i en 25 cm 2 kolv.
  • 2. Upprätta Endothelial-mesenkymala stamceller Samkulturer på Ibidi Microslides

    1. Trypsinisera ett sammanflytande 25 cm 2 kolv med EG (~ 1.5 x 10 6 celler; som avsnitt 1.4). Resuspendera EG 380 pl MSCGM (1 x 25 cm 2 kolv kommer seeda två 6-kanals Ibidi microslides (~ 1,25 x 10 5 / kanal), för adhesionsanalyser alla cell TYpes odlas i MSCGM). Lägg 30 pl EG fjädring till varje kanal (detta kommer att täcka tillväxtområde genom kapillärkraften). Inkubera Ibidi mikros vid 37 ° C och 5% CO2 under 1 h.
    2. Lägg 140 l MSCGM till varje kanal och sedan aspirera bort det. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar. Lägg 140 l MSCGM och plats i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 timmar.
    3. För samkulturer loss MSC (avsnitt 1.4). Utför en celltal med hjälp av en hemocytometer eller en cellometer. Justera koncentrationen av MSC till 1,5 x 10 5 celler / ml.
    4. Sug skjutande medel från Ibidi kanaler (vilket innebär att endast tillväxtområdet kanalen i medium). Lägg 30 pl av MSC fjädring till Ibidi kanalerna. Sug mediet som sköts ut från tillväxtområdet av kanalen och lägga till ytterligare 30 pl MSC fjädring. Upprepa en gång till och sedan placera Ibidi mikros i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 </ Sub> 1 timme.
    5. Lägg 140 l MSCGM till varje kanal och sedan aspirera bort det. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar. Lägg en slutlig volym av 140 | il MSCGM till varje kanal och plats i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 timmar.
    6. Tina 1 x 10 5 U / ml lager TNFa och späd 1: 1000 i MSCGM till en slutlig koncentration av 100 U / ml (ekvivalent med ~ 10 ng / ml). Utför en seriespäd genom att späda 100 U / ml TNFa genom 1:10 i MSCGM att erhålla 10 U / ml. Späd 10 U / ml TNFa genom 1:10 i MSCGM att erhålla en E / ml.
    7. Behandla kanaler med TNFa vid 37 ° C under 4 h före analysen. Temperaturvariationer under cytokinbehandling kommer att förändra de mönster av neutrofila rekrytering observerade. Lägg färska MSCGM till obehandlade kanaler.

    3. Upprätta Endothelial-mesenkymala stamcellen Samkulturer på filter

    1. Lossa WJ eller BMMSC som beskrivs i avsnitt 1.4. Resuspendera pelleteni 1 ml MSCGM. Utför en celltalsceller med hjälp av en hemocytometer eller en cellometer.
    2. Justera volymen så att den slutliga koncentrationen är 5 x 10 5 MSC i 500 l av MSCGM.
    3. Använda steril pincett invertera 6-väl, 0.4 um PET Transwell filter och plats i en steril låda.
    4. Seed 5 x 10 5 MSC på den yttre ytan av filtren. Inkubera filter vid 37 ° C och 5% CO2 under 1 h.
    5. Samla media från den yttre ytan på filtret. Räkna antalet icke vidhäftande MSC i medierna. Re-invertera filter med steril pincett och placera det i en matchande 6-brunnar innehåller 3 ml MSCGM.
    6. Lägg 2 ml MSCGM på den inre ytan av filtret (Figur 1B). Placera i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 timmar. Trypsinisera ett sammanflytande 25 cm 2 kolv med EG (Figur 1ai; som avsnitt 1.4).
    7. Resuspendera EG i 8 ml MSCGM (1 x 25cm 2 kolv will frö fyra 6-well filter; ~ 5 x 10 5 EG / filter). Aspirera medium från toppen och botten av de porösa filtren. Lägg 3 ml färskt MSCGM i den nedre kammaren (under filtret). Lägg 2 ml EG suspensionen till den inre ytan av varje filter. Inkubera i en timme vid 37 ° C och 5% CO2.
    8. Sug medium för att tvätta bort icke vidhäftande EG och ersätta med färsk MSCGM. Ställ upp parallella EG mono-kultur filter genom sådd celler på insidan utan att först sådd MSC. Inkubera O / N vid 37 ° C och 5% CO2.
    9. Kontrollera att EG cellslager är sammanflytande och innehåller inga luckor. Sub-sammanflytande monoskikt kan inte användas för vidhäftningsanalyser (Figur 1B).
    10. Behandla de övre och undre kamrarna i filtren med en, 10, eller 100 U / ml TNFa (ekvivalent med ~ 10 ng / ml) vid 37 ° C under 4 h före analysen (beskrivet i avsnitt 2).

    4. Isolering av leukocyter

    1. Ta venösblod från friska frivilliga och delmängd omedelbart till EDTA-rör. Invert rör försiktigt för att blanda.
    2. Layer 2,5 ml Histopaque 1077 på 2,5 ml Histopaque 1119 i en 10 ml rundbottnad rör. Layer 5 ml helblod på Histopaque gradienten. Centrifugera vid 800 xg under 40 min vid RT.
    3. Skörda perifera polymorfonukleära neutrofiler (PMN) vid gränsytan av Histopaque 1077 och 1119 (ovanför erytrocyt skiktet). Placera i en 10 ml rundbottnad rör och späd till 10 ml med PBSA. Vänd försiktigt rör och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT.
    4. Späd 7,5% BSA-lösning 1:50 i 100 ml PBS (med kalcium och magnesiumklorid) till en slutkoncentration av 0,15% (vikt / volym; PBSA). Aspirera supernatanten och återsuspendera i 10 ml PBSA. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT.
    5. Resuspendera i 1 ml PBSA. Ta en 20 ul alikvot av cellsuspensionen och lägga till 380 l PBSA (1:20 utspädning). Räkna celler med användning av en hemocytometer eller en cellometer. Späd till önskad concentration (1 x 10 6 / ml för Transwell filter och Ibidi mikros) i PBSA. Bibehåll neutrofil suspension vid RT tills analysen.

    5. Montera Flow System

    1. Ställ in systemet flödet såsom visas i figur 1C. Slå på värmaren och inställd på 37 ° C. Fäst en 20 ml spruta (avlägsna kolven) och en 5 ml spruta till en 3-vägskran. Fäst kranen till Perspex kammare med hjälp Micropore tejp.
    2. Mät och kapa en lång bit av kisel 2/4 mm (tjock) slang som är ungefär avståndet mellan ventilen och 3-vägs kran. Skär en 8 - 10 mm lång bit av 1/3 mm (tunn) slang och sätt in ena änden av den tjocka slangen. Fäst den tjocka slangen sidan på 3-vägs kran.
    3. Anslut den tunna slangen slutet på en hamn i den elektroniska 3-vägs mikroventil. Detta är den "tvättbehållaren". Skär en 6-8 mm lång bit av tjocka och tunna slangar.
    4. Sätt den tunna slangen i ena änden av den tjocka slangen. AttACH den tjocka slangen slutar på en 2 ml spruta (ta bort kolven).
    5. Anslut den tunna slangen slutet av 2 ml sprutan på en port på den elektroniska mikroventilen att göra "provbehållaren". Anslut ventilen till flödeskammaren filtret genom att mäta och skära av en lång bit av tunn slang som är avståndet mellan mikroventil och centrum av mikroskop scenen.
    6. För mikrosmodellen, bifoga en 8 - 10 mm bit tjock slang till slutet av den tunna slangen. Placera en L formad kontakt till slutet av den tjocka slangen. Detta kommer att ansluta till mikros. För filtermodellen, bifoga en 8 - 10 mm bit Portex Blue Line Manometer ansluter slangen till slutet av den tunna slangen.
    7. Placera den tunna slangen änden på mikroventil. Detta är den gemensamma utgången för tvätt- och prov reservoarer. Fyll reservoarer med PBSA. Prime slang genom strömmande PBSA genom dem för att ta bort eventuella luftbubblor.
    8. Fäst manometerslangen till en 29 mm (50 ml) glas syringe. Prime sprutan genom att fylla med 10 ml PBSA. Vänd sprutan så att den ände som är ansluten till slangen är vänd uppåt och tryck ut alla luftbubblor. Fyll på med 5 ml PBSA.
    9. För mikros modellen, bifoga en 10-12 mm bit tjock slang till slutet av manometerslangen leder till sprutan glaset. Placera en L formad kontakt på änden av den tjocka slangen. Placera sprutan glaset i en sprutpump för infusion / uttag.
    10. Beräkna refill flödet (Q) som krävs för att generera den önskade vägg skjuvspänningen (τ w i Pascal, Pa) 0,1 Pa (Transwell filter) eller 0,05 Pa (Ibidi microslides) med hjälp av följande formler:
      γ w = (6.Q) / (wh 2)
      τ = n.γ
      Där w = inre bredden och h = inre djup av strömningskanalen. n = viskositeten hos den strömmande lösningen; PBSA är n = 0,7 mPa.s. För den parallella plattfiltret flödeskammare, är bredden (w) 4 mm och djupet (h) är 0,133 mm. Den depth av kammaren kan variera något på grund av skillnader i tjockleken på Parafilm packning används. För Ibidi mikros är bredden 3,8 mm och djupet är 0,4 mm.
      OBS: På grund av skillnader i dimensioner flödeskanalen, och fånga dynamiken vi använder olika skjuvspänningar för mikrosmodellen jämfört med filtermodellen 6.

    6. Installera Parallel Plate Flow avdelningen Införliva Filter

    1. Klipp en bit Parafilm (samma storlek som glaset täckglas) med användning av en metallschablon. Skär ut en 20 x 4 mm spår i Parafilm (för att skapa flödeskanalen) med hjälp av en metallmall. Använd packningen för att markera flödeskanalen på glaset täckglas.
    2. Justera kanterna på den 6-brunnars filter på glastäckglas. Se till att filtret täcker flödeskanalmarkeringar. Skär försiktigt ut filtret med en typ 10A skalpell.
    3. Försiktigt täcka filtret med en Parafilm packning, se till att flödeskanalenslits är i mitten av filtret (figur 1D). Använd en bit ren servett och tryck ut eventuella bubblor.
    4. Placera täckglas i urtagningen av bottenplattan av Perspex flödeskammaren. Placera den övre plexiglasplattan över toppen av packningen och skruva ihop plattorna (figur 1D).
    5. Vrid 3-vägskran för att tillåta tvättbuffert (PBSA) att strömma genom ventilen. Anslut manometerslangen till inloppsporten av den övre Persex plattan. Kör PBSA genom flödeskanalen så att bubblor kan passera.
    6. Anslut manometerslangen från sprutpumpen in i utloppsporten av Perspex plattan. Ställ sprutpumpen för att fylla på och tryck springa. Rengör PBSA som har droppat in på den övre plattan av kammaren.
    7. Placera kammaren på scenen av en inverterad faskontrastmikroskop. Justera fokus att visualisera EG ovanför filtren (Figur 1B).

    7. Konfigurera Microslides för Flow </ P>

    1. Placera mikros på scenen av en inverterad faskontrastmikroskop. Anslut L formade kontakten till inloppet av en kanal. Kör PBSA genom flödeskanalen.
    2. Placera L formad kontakt från sprutpumpen in i utloppsporten hos kanalen. Ställ sprutpumpen för att fylla på och tryck springa. Rengör PBSA som har droppat in på mikros. Justera fokus att visualisera EG monolager.

    8. Perfusion av leukocyter Over endotelceller

    1. Sätt 2 ml av renade neutrofiler in i provbehållaren och låt värmas till 2 min. Tvätta endotelet med PBSA i 2 min.
    2. Vrid ventilen ON för att BEGJUTA neutrofiler över endotel. Leverera neutrofila bolus under 4 min. Vrid ventil AV och BEGJUTA PBSA från tvättbehållaren under återstoden av experimentet.
    3. Säkerställ att luftbubblor inte passerar genom flödeskanalen vid varje punkt under analysen, eftersom detta kommer att störa EG monolayer och orsaka avlossning av vidhäftande neutrofiler.

    9. Inspelning neutrofila Capture och beteende

    1. Record neutrofila rekrytering antingen under neutrofila flöde eller post-perfusion.
    2. Gör alla digitala inspelningar av minst 5-10 fält i centrum av flödeskanalen. Identifiera mitten av kanalen genom att flytta målet till kanten av kanalen vid inloppsporten och identifiera mitten av porten.
      1. För inspelning under neutrofila flöde, ta bilder av ett enda fält var 10 sek i 1 min. Flytta längs kanalen och spela in ett annat fält i 1 min. Upprepa löptid för bolus.
      2. För inspelning efter perfusion, gör 10 sek inspelning av 5 - 10 fält ner mitten av flödeskanalen för bedömning leukocyt beteende (vanligtvis 2 min efter slutet av neutrofila bolus). Ta bilder varje sekund inom 10 sek intervall. Detta tillåter tillräcklig tid för avskiljning från flöde och beteende vidhäftande neutrophils som skall analyseras.
      3. Spela in ett enda fält som innehåller minst 10 transmigrated neutrofiler i 5 min, ta bilder varje 30 sek. Detta kan användas för att beräkna hastigheten hos migrerade celler (antingen över eller under endotelet).
      4. Spela en annan serie av 10 sek fält (vanligtvis 9 min post-perfusion). Detta gör att neutrofiler tid att vandra genom det endothelial monolager.
      5. Stoppa sprutpumpen och avlägsna slangen. Demon flödet kammaren och skölj provbehållaren och slangar. Upprepa för efterföljande filter / Microkanaler.

    10. Analys av leukocytrekrytering och beteende

    1. Räkna antalet neutrofiler i varje fält under de 10 sek inspelningar vid 2 min tidpunkt. Alla cellerna måste vara närvarande i den första andra fältet för att räknas. Celler som är delvis i fält på 2 sidor (t.ex. övre / högra gränsen) i synfältet ingår iräkningarna, så länge de är kvar i området för hela 10 sek.
    2. Beräkna medel antalet vidhäftande neutrofil per fält. Mät längden och bredden av det inspelade området. Beräkna arean av fältet. Räkna ut hur många områden finns det i 1 mm 2. Multiplicera det genomsnittliga antalet neutrofiler med antalet fält i 1 mm 2.
    3. Beräkna det totala antalet neutrofiler som perfunderas genom att multiplicera mängden av neutrofiler perfusion (t.ex. 2 x 10 6 / ml * Q [t.ex., 0,0999 ml / min under parallell plattflödeskammare]) med varaktigheten bolus (t.ex., 4 min ).
    4. Dela upp neutrofiler / mm 2 med det totala antalet neutrofiler perfusion att fastställa det totala antalet celler som har anslutit sig (vidhäftande celler / mm 2/10 6 perfusion).
    5. Bedöma om de vidhäftande neutrofiler rullar, fast vidhäftande eller transmigrated (Kompletterande Video 1 och 2).
      1. ENrullande neutrofila är fas ljust och kommer sakta röra sig längs endothelial monolager (1 - 10 um / sek; Kompletterande Video 1).
      2. Fast vidhäftande cellerna är fas ljusa och bunden till EG ytan, antingen står stilla (dvs inte rör sig under inspelning) eller har genomgått formförändring och flyttar över EG ytan (Figur 1Ei).
      3. En transmigrated neutrofila är fas mörk och under EG lagret (Figur 1Eii).
    6. Beräkna andelen anhängare celler som rullande, stationära och transmigrated. Alternativt kan neutrofila beteende uttryckas som totala cellantal som uppvisar de olika beteenden genom att tillämpa samma formel som används för att beräkna den totala vidhäftning (som beskrivs i steg från 10,6 till 10,7).
      1. Markera framkanten av en rullande neutrofil. Märk den främre kanten av samma cell vid slutet av den 10 sek sekvensen. Rita en linje satsninglan de två punkterna och mät avståndet att cellen har rest.
      2. Dividera detta värde genom hela inspelningen, i vilken cellen är rullande (dvs. 10 sek). Försök och välj neutrofiler som är på fältet för hela 10 sek intervall.
    7. För att beräkna hastigheten hos neutrofiler migrerar över ytan (formade ändrade fas ljusa) eller under endotelet (fas mörk) använder 5 min inspelning (Kompletterande Video 2).
      1. Rita en skiss av migrerade celler i början av sekvensen och spåra deras rörelser i hela sekvensen. Anteckna X- och Y-positioner av tyngd vid varje 1 min intervall för varje cell. Subtrahera värdena för X- och Y-position från den första bilden i sekvensen från värdena i den andra bilden. Detta är baserat på Pythagoras sats.
      2. Subtrahera värdena från den andra bilden från den tredje bilden. Gör detta för alla bilder i sekvensen. Fyrkantig tHan X- och Y-värden och lägg ihop dem.
      3. Kvadratroten det resulterande värdet. Beräkna hastigheten för varje cell som genomsnittet hastigheterna beräknade vid varje minutersintervall. Spår 10 migrerade neutrofiler och beräkna medelhastigheten.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Inledningsvis analyserade vi effekten av att stimulera EG med TNF på rekrytering av neutrofiler från flödet med hjälp av Micromodellen Ibidi (avsnitt 7-9). I frånvaro av TNF, lite om några neutrofiler följs endothelial monolager (Figur 2A). Detta var väntat, eftersom obehandlad / vila EG uttrycker inte de nödvändiga adhesionsmolekyler (selektiner) eller kemokiner att stödja bindande 25,26. I motsats, cytokin-stimulering ökade signifikant neutrofil vidhäftning till endotelet på ett dos-beroende sätt (Figur 2A). Adhesion förblir normalt stabila under loppet av analysen. Bindning av leukocyter till obehandlat endotel indikerar att antingen EG aktiveras (dvs, förorenat med LPS under odlingsprocessen) och / eller neutrofilerna aktiverades under isoleringsprocessen. I själva verket har LPS visats öka uttrycket av E-selektin, ICAM-1 och VCAM-25-27 januari på ytan av EG, så att de kan binda neutrofiler.

    Vid en analys av beteendet hos de rekryterade neutrofiler vi observerar vanligtvis en dosberoende minskning av andelen neutrofiler rullande (Figur 2B) med en samtidig dosberoende ökning av andelen neutrofiler migrerar genom endothelial monolager (figur 2C). Vid lägre doser av TNFa-stimulering (1 U / ml) en större andel av neutrofiler verkar fas ljus vilket indikerar att de är fästa till den apikala ytan av endotelet (Figur 2B). I motsats, vid 10 och 100 U / ml (högre doser) cirka 40% av de rekryterade neutrofilerna visas fas mörker vid 2 minuter vilket indikerar att dessa celler har migrerat genom den endoteliala monoskiktet och är under endotelet (figur 2C). Neutrofiler kan migrera genom EG inom 1 - 2 min, med själa når maximal nivåer vid ~ 10 min efter perfusion 28. Här har vi observerat en ökning av neutrofila transmigration från 40% vid 2 min till 60% med 9 min efter perfusion (figur 2C). Vi observerade ingen effekt av TNFa koncentration på hastigheten för valsning (~ 3 | j, m / sek) eller migrera (~ 10-12 pm / min) neutrofiler.

    I filtret baserade modellen, ökade TNF-stimulering neutrofiladhesion i ett dosberoende sätt liknande den som ses med hjälp av Micromodellen Ibidi (Figur 3A). I termer av beteende, neutrofil rullning var opåverkad av TNFa dos (figur 3B), medan en dosberoende ökning av procenttransmigration observerades (figur 3C). I denna serie experiment observerade vi ingen signifikant effekt av tid på neutrofila trans (Figur 3C).

    Vi tillhandahåller metoder för att generera två olika co-kultur konstruktioner, varderasom utformats för att svara på specifika frågor. I Ibidi mikrosmodellen, EG och MSC odlas i ett enda monoskikt i direkt kontakt med varandra. Denna modell är användbar för att undersöka effekten av terapeutisk injektion av MSC i blodet och deras efterföljande integrering i EG monolager. I motsats i filterbaserade modellen, EG och MSC odlas på motsatta sidor av filtret i omedelbar närhet men inte nödvändigtvis i direkt kontakt. Detta mer liknar vävnad, med endotelceller som bildar ett monoskikt som representerar blodkärlet, och MSC är bosatt i den subendoteliala utrymmet. Detta tillåter oss att undersöka effekterna av vävnads bosatta MSC på svaret från EG till cytokinstimulering.

    Utifrån våra erfarenheter, observerar vi att maximal neutrofila rekrytering och transendotelial migration inträffar när EG stimuleras med 100 U / ml TNF. Som sådan har vi använt denna koncentration för att undersöka effekten av MSC samodlingpå endotel rekrytering av neutrofiler från flödet. Här presenterar vi uppgifterna för BMMSC i samodling med EG hjälp av mikros och filterbaserade modeller kan dock andra typer av MSC också undersökas t.ex. WJMSC. I båda modellerna närvaro av BMMSC reducerade signifikant neutrofil vidhäftning till EG jämfört med EG odlade ensam (Figur 4A). Co-kulturen hade ingen effekt på beteendet hos rekryterade neutrofiler, med liknande nivåer av valsning och själa observeras på EG odlade ensam eller med MSC (Figur 4B och C). Således kan MSC modifiera EG svar på cytokinstimulering, som undertrycker deras förmåga att stödja neutrofila rekrytering från flödet.

    Figur 1
    Figur 1. Etablera EG-MSC samodling och analysera neutrofila rekrytering med hjälp av en flödesbaserad vidhäftningsanalys. (A) (i) primär EG och (ii) passage 3 BMMSC odlas på vävnadsodlingsflaskor. (B) mikroskop av EG och MSC odlades på 6-såväl Transwell filterinsatser. (C) Diagram över perfusionssystemet används för att generera flöde. (D) Schematisk representation av den parallella plattfilterflödeskammaren. (E) Micrograph av (i) fast förbunden (FA) och (ii) transmigrated (TM) neutrofiler efter rekryteringen från flöde till EG stimulerades med 100 U / ml TNFa . Bilder C och D är tagna från figur 2 och 3 i Methods in Molecular Biology:. T-cells Trafficking, 2010, sid 53-54 28 med tillstånd från Springer Science and Business Media Klicka här för att se en större version av denna figur.


    . Figur 2. Neutrofil rekrytering från flöde till TNFa-stimulerade EG använder Ibidi microslides EG stimulerades med ökande koncentrationer av TNFa (0 - 100 U / ml) under 4 timmar. En 4 min bolus av neutrofiler var perfusion över EG monolager vid 0,05 Pa. (A) neutrofiladhesion värderas till 2 min. ANOVA visade en signifikant effekt av TNF-behandling på neutrofiladhesion, p <0,01. Neutrofil beteende bedömdes vid 2 och 9 minuter och uttryckt i procent av vidhäftande celler som var (B) valsning eller (C) transmigrated. ANOVA visade en signifikant effekt av TNF-behandling på beteendet hos vidhäftande neutrofiler, p <0,001. I C, visade ANOVA en signifikant tid på transmigrated neutrofiler p <0,01. Data är medelvärde ± SEM från n = 3 experiment. * P <0,05 och **p <0,01 jämfört med den ostimulerade (0 U / ml) EG: s kontroll av Dunnetts eftertest. ## p <0,01 och ### p <0,001 jämfört med en U / ml EG samtidigt punkten genom Bonferroni Post- test.

    Figur 3
    . Figur 3. Neutrofil rekrytering från flöde till TNFa-stimulerade EG med hjälp av filterbaserad analys EG stimulerades med ökande koncentrationer av TNFa (0 - 100 U / ml) under 4 timmar. En 4 min bolus av neutrofiler var perfusion över EG monolager vid 0,1 Pa. (A) neutrofiladhesion värderas till 2 min. ANOVA visade en signifikant effekt av TNF-behandling på neutrofiladhesion, p <0,001. Neutrofil beteende bedömdes vid 2 och 9 minuter och uttryckt i procent av vidhäftande celler som var (B) valsning eller (C) transmigrated. I C, ANOVA showed en signifikant effekt av tid och cytokin-behandling på neutrofila själa, p <0,05. Data är medelvärde ± SEM från n = 3 experiment. ** P <0,01 och *** p <0,001 jämfört med den ostimulerade (0 U / ml) EG: s kontroll av Dunnetts eftertest. # P <0,05 jämfört med ett U / ml EG samtidigt punkten av Bonferroni post -test.

    Figur 4
    Figur 4. neutrofila rekrytering från flödet till TNF-stimulerade EG-BMMSC samkulturer. BMMSC samodlades med EG för 24 h före stimulering med 100 U / ml TNF under 4 timmar. En 4 min bolus av neutrofiler var perfusion över EG monolager vid 0,05 Pa för (A, C, E) microslides och 0,1 Pa för (B, D, F) filter. (AB) neutrofiladhesion bedömdes vid 2 min. Neutrofil beteende bedömdes vid 2 och 9 mi och uttryckt i procent av vidhäftande celler som var (CD) valsning eller (EF) transmigrated. I C och D, ANOVA visade en signifikant effekt av odlingsbetingelser på neutrofila rullande, p <0,05. I E och F, ANOVA visade en signifikant effekt av tid på neutrofila själa, p <0,05. Dock inga signifikanta skillnader observerades i själa mellan individuella behandlingar av Bonferroni efter provet. Data är medelvärde ± SEM från n = 5 experiment. * P <0,05 jämfört med EG monokultur genom parat t-test eller Bonferroni post-test.

    Kompletterande Video 1. Analys av neutrofila rullande hastigheter. EG odlades på en Transwell filter stimulerades med 100 U / ml TNFa under 4 h. En bolus av neutrofiler var perfusion över EG för 4min. Representant digitaliserad sekvens av en enda 10 sek fält tagit 2min efter perfusion. Förändringen i läge av ett enda rullande neutrofil från början till slutet av 10 sek sekvensen kan användas för att beräkna den hastighet vid vilken den neutrofila rullar.

    Kompletterande Video 2. Analys av neutrofilmigration hastigheter. EG odlades på en Transwell filter stimulerades med 100 U / ml TNFa under 4 h. En bolus av neutrofiler var perfusion över EG under 4 min. Representant digitaliserad sekvens av en enda 5 min fältet för att följa utvecklingen av transmigrated neutrofiler. Detta kan användas för att beräkna hastigheten.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Här beskriver vi två in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av cirkulerande neutrofiler med inflammerat endotel. En stor fördel med dessa modeller är förmågan att analysera varje steg i leukocytadhesionen kaskad i ordning, som skulle uppträda in vivo. Vi har tidigare observerat en dosberoende ökning av neutrofiladhesion till och själa genom TNF-stimulerad EG 9,29. Vi beskriver också hur de båda modellerna kan anpassas för att studera effekterna av stromaceller på leukocytrekrytering. Här, MSC samodlades med EG i en Ibidi Micro eller på motsatta sidor av ett poröst filter. Detta tillåter båda celltyperna för att kommunicera med varandra, därigenom modifiera varandras fenotyp och respons. Vi har visat här, och i tidigare studier 23, att närvaron av MSC tryckte neutrofil adhesion till TNFa-stimulerade EG. Detta indikerar att stromaceller modifiera EG svartill cytokiner och därefter förändrar rekrytering av cirkulerande leukocyter.

    Förutom de modeller som beskrivs ovan, Cellix Biochips, Bioflux plattor och Glyotech parallell plattflödeskammare är kommersiellt tillgängliga flödeskanalssystem som ger en yta för odling av endotel och observera rekrytering. I alla system, bör vissa parametrar beaktas samtidigt upprättande endotelceller kulturer och utföra flödesbaserade vidhäftningsanalyser, varav några är markerade nedan och i tidigare rapporter 30,31. Eventuella antiinflammatoriska medel, såsom hydrokortison, som kan påverka de cytokinsvar bör utelämnas från mediet under hela kulturen och analysen 18,29. När du använder Ibidi mikros se till att det inte finns några luftbubblor i flödeskanalen under kulturen i EG eftersom dessa kommer att störa EG monolager. Integriteten för endothelial cellslager bör bekräftas före cytokine-behandling, eftersom neutrofiler binder till luckorna i monolager där BSA har belagt att mikros / filtret. Det är också viktigt att se till att EG bibehålls vid 37 ° C under hela cytokin-stimulering eftersom TNF är temperaturkänsligt och endast har maximal effekt vid 37 ° C. För analysen flödet själv, välj en lämplig tvättbuffert, använder vi oftast PBSA för korta analyser (mindre än 30 min) och M199-medium kompletterat med BSA (0,15%) för längre analyser (1-48 tim) 30,31. Slutligen se till att det inte finns några luftbubblor i flödeskanalen under analysen eftersom detta stör flödet, skadar EG cellslager och aktiverar vidhäftande neutrofiler.

    En av de stora fördelarna med de flercelliga in vitro modeller som beskrivs här är deras förmåga att replikera vivo interaktioner mellan EG och stromaceller i. Det är svårt att isolera effekterna av specifika stromala komponenter in vivooch att modifiera dem på ett kontrollerat sätt. I våra modeller, kan stromaceller manipuleras för att belysa hur de kommunicerar med EG och påverka den inflammatoriska processen vid hälsa och sjukdom. Till exempel med hjälp siRNA teknik vi har tidigare visat att produktionen av IL-6 av MSC vid samtidig kulturen är nödvändig för deras immunsuppressiva effekter 23. Varje modell kan användas för att behandla specifika frågor dvs effekten av vävnads bosatt stromaceller (filterbaserad modell) eller terapeutiskt administrerade stromaceller (Ibidi microslides och andra kommersiellt tillgängliga system) på leukocytrekrytering. I båda fallen har vi titreras olika stromal celltyper för att säkerställa deras livskraft och att upprätta en lämplig förhållande mellan stromal cell till EG för bedömning effekter på rekryteringen 15,25. Likaså odlingsmedium måste vara förenliga med varje celltyp införlivas i modellen. I våra händer samkulturer typiskt utförs i stromacells- medium 11,18,23,31.

    Använda filtret baserad modell, har vi tidigare visat att olika stromaceller modulera förmågan hos EG att stödja adhesion och migration av leukocyter i ett vävnadsspecifikt sätt och att dessa effekter blir förändrad i kroniska sjukdomar 3. Detta ledde till tanken att stromaceller etablera vävnadsspecifika "adresskoder" som aktivt reglerar rekryteringen av leukocyter till inflammerad vävnad 24. Dessa modeller är särskilt utformade för att undersöka de första stadierna av rekrytering i detalj men inte kan studera den efterföljande migration inom subendoteliala utrymmet (dvs bort från endotel i vävnaden). Flercelliga, flerskiktade 3D ​​konstruktioner såsom en statisk kollagengel analys 12,32 vore lämpligare för att studera dessa senare faser av rekrytering.

    Våra flödesbaserad vidhäftnings modellerna är mycket mångsidig. Vi har desfaktorer beskrivs deras användning i samband med neutrofila rekrytering, men andra leukocyter delmängder kan undersökas på ett liknande sätt. Vi har också använt Ibidi mikrossystemet för att undersöka rekrytering av cirkulerande MSC av EG 23, och om detta sker genom samma vidhäftning kaskad rapporterades för leukocyter. Likaså dessa modeller kan användas för att undersöka rekrytering och införlivandet av metastatiska tumörcellinjer, och deras efterföljande effekter på endotelceller svar och leukocytrekrytering. Alternativt skulle filterbaserade modellen anpassas för att införliva olika typer av stromala celler (t.ex. fibroblaster, podocyter, glatta muskelceller) från friska vävnader 13,21 och ställen för sjukdomen 11,18,20. Detta skulle göra det möjligt att studera vävnadsspecifika regulatoriska vägar verkar på samma nivå som på EG och / eller leukocyter. I samtliga fall kan granskas störningar av normala regulatoriska processer i en rad sjukdomstillstånd för att identifiera key regulatoriska mediatorer (såsom IL-6 och TGF) och potentiella nya terapeutiska mål. I samband med kronisk inflammation dessa medel kan användas för att stänga av rekryteringsprocessen, medan det i cancerbiologi man kunde föreställa deras användning för att slå på rekrytering för att rikta tumören.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7, (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91, (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6, (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164, (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82, (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142, (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6, (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28, (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39, (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85, (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131, (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7, (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187, (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48, (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54, (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52, (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43, (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88, (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193, (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26, (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31, (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136, (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317, (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40, (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics