Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ici, nous présentons un protocole d'injecter des agents de contraste ultrasonores de microbulles dans la vie, isolés en fin de gestation embryons murins de la scène. Cette méthode permet l'étude des paramètres de perfusion et de marqueurs moléculaires vasculaires au sein de l'embryon en utilisant à haute fréquence échographie de contraste amélioré.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

échographie de rehaussement du contraste permet l'utilisation d'agents de contraste à microbulles de visualiser et caractériser l'environnement vasculaire. Ces agents permettent l'évaluation non invasive de la microcirculation, la vascularisation et la fonction cardiovasculaire. En outre, la modification de la surface de la bulle peut conduire à la liaison à microbulles ciblée biomarqueurs endotheliales, comme démontré dans des applications précliniques de l'angiogenèse, l'athérosclérose et l'inflammation faisant 1,2 imagerie par ultrasons moléculaire des événements vasculaires possibles. Échographie de contraste amélioré peut donc être utilisée pour identifier les environnements complexes et variés qui influencent états vasculaires sains et malades 3-5.

Dans le cours des dernières années, l'intérêt pour l'utilité de l'imagerie de microbulles a étendu au modèle polyvalent d'embryon de souris. Comme un modèle de développement des mammifères, l'introduction de microbulles dans le système vasculaire embryonnaire améliore physiologiqueétude du système circulatoire en développement (par exemple, le flux sanguin, le débit cardiaque) et en cas de transgéniques et des modèles de souris mutantes ciblés de la maladie cardiaque 6,7, peut fournir des indications sur la façon dont les facteurs génétiques de modifier la fonction cardiovasculaire. En fait, 2D analyse quantitative et qualitative du cerveau embryonnaire vasculaire ont déjà été atteints 8. En outre, l'embryon de souris présente comme un excellent modèle pour l'examen de la liaison de microbulles ciblées à des marqueurs vasculaires in vivo. Bartelle et al. 9, par exemple, ont mis en place des microbulles avidine en embryon ventricules cardiaque pour évaluer la liaison ciblées dans BIO TAG-Bira embryons transgéniques et d'examiner l'anatomie vasculaire. La génération de modèles hétérozygotes et homozygotes souris peut également être utilisé comme un substitut pour des études de modèle de tumeur visant à définir la nature quantitative de l'échographie moléculaire - une étape importante dans la traduction de cette technique à la clinique.

8-10. Dans injections in utero, cependant, faire face à un certain nombre de défis. Il se agit notamment des conseils d'injection, la nécessité de contrer le mouvement dans la mère et l'embryon extériorisé, le maintien de la viabilité hémodynamique chez la mère et embryons extériorisés, portant sur ​​les effets à long terme de l'anesthésie et de complications dues à un saignement 11. Par conséquent, l'objectif de l'enquête était de développer une technique pour injecter microbulles en vie isolé des embryons à un stade avancé 12. Cette option offre plus de liberté en matière de contrôle d'injection et le positionnement, la reproductibilité du plan d'imagerie sans entrave, et l'analyse d'image simplifiée et la quantification.

Dans la présente étude, nous présentons une nouvelle procédure pour l'injection de microbulles en vivant embryons murins for les fins de l'étude du comportement cinétique microbulles et d'étudier la liaison à des marqueurs de surface endothéliales endogènes microbulles ciblées. Non linéaire échographie de contraste spécifique est utilisé pour mesurer un certain nombre de paramètres de perfusion de base, y compris la mise en valeur de crête (PE), lavez-la fréquence et de temps pour culminer (TTP) dans isolées embryons E17.5. Nous démontrons également la validité du modèle d'embryons pour évaluer la nature quantitative de l'échographie moléculaire dans une perte de endogline embryonnaire de modèle de souris fonction transgénique, où endogline est une cible cliniquement pertinente en raison de sa forte expression dans les cellules endothéliales vasculaires dans les sites de l'angiogenèse active 13 . L'adhésion de l'endogline ciblée (MB E), isotype de rat IgG 2 commande (MB C) et non ciblées (MB U) microbulles est évaluée dans endogline hétérozygote (+/- Eng) et homozygote endogline (ENG + / +) exprimant des embryons. Analyse du bindi cibléeng révèle que l'échographie moléculaire est capable de différencier entre les génotypes de endogline et concernant les densités de récepteurs à des niveaux moléculaires quantifiables à ultrasons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

REMARQUE: Les procédures expérimentales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de soins des animaux au Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procédures pour le traitement sans cruauté des animaux doivent être respectées en tout temps. Il est supposé que l'enquêteur est formé dans le fonctionnement de base d'un système d'imagerie par ultrasons. Ce protocole fonctionne mieux avec deux personnes.

1. Modèles animaux

  1. Compagnon CD-1 mâle et femelle Mus musculus d'obtenir des embryons de type sauvage pour les études de perfusion.
  2. Pour les études d'imagerie moléculaire, de générer la souris Eng par recombinaison homologue en utilisant des cellules souches embryonnaires de 129 origine / Ola comme décrit par Bourdeau et al. 14.
    1. Les souris de rétrocroisement B6- Eng, veuillez acquis du Dr Michelle Letarte, sur le CD-1 arrière-plan. Le CD-1 Utiliser Eng rétrocroisés embryons, ainsi que leur Eng + / + co littermatentrols. Accoupler les souris de produire des embryons mis en scène.

2. Préparation expérimentale

  1. Initier accouplement de souris et de vérifier bouchons quotidienne. Jour embryonnaire 0,5 est défini comme midi de la journée d'un bouchon vaginal est observée.
  2. Préparer support d'embryon par addition de 50 ml de sérum bovin fœtal, 5 ml de 1 M de HEPES et 5 ml de pénicilline-streptomycine (10 000 unités de pénicilline, 10 000 ug de streptomycine) à 500 ml du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec haute teneur en glucose (4500 mg / L). Envelopper la bouteille dans du papier et de garder réfrigérés à 4 ° C.
  3. Centrifugeuse gel échographique clair dans 50 ml tubes coniques à 140 g pendant 20 min. Dessinez gélifier jusqu'à 30 ml dans des seringues. Remplissez supplémentaires (marqué) 30 ml seringues avec tampon phosphate salin (PBS) et mettre de côté. Une portée d'embryons exige généralement entre 2-3 seringues de gel de l'échographie et 4 seringues de PBS.
  4. Tirez environ 30 aiguilles de verre et serrez doucement pour une bande de pâte à modelerdans une boîte de culture cellulaire de 100 x 20 mm. Cela assure que les aiguilles sont séparées et sûr pendant la manipulation. Aide d'un extracteur de verre, utilisez les paramètres suivants sur 1 x 90 mm capillaires de verre à filament: Chauffeur 77, 55 Sous aimant, aimant principal 70.
  5. Préparer dix à douze plaques de dissection (assez pour se assurer que chaque embryon dans une litière recevra sa propre boîte), en utilisant un ratio de 1: 8 en volume d'agent de durcissement à la base. Verser 40 ml de base dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 5-6 ml agent de durcissement et remuer avec un bâton en bois.
    1. Verser dans 60 x boîtes de culture de 15 mm, chaque remplissage de moitié environ. Laisser reposer O / N à définir.
  6. Attacher Luer femelle à 400 mm de longs morceaux de chlorure de polyvinyle (PVC) tube (diamètre interne: 0,79 mm). Le tube doit atteindre à partir de la pompe à seringue pour l'étape d'ultrasons confortablement.

3. expérimental

  1. Disposer la plate-forme d'imagerie sous le microscope chirurgical avec un moteur 3D et réseau linéaire 21 MHz transducteur.
    1. Orient la plate-forme de sorte que le rail de montage est sur la gauche, à l'étape positionné directement sous le microscope.
    2. Fixer le moteur 3D à la rotule du bras se étendant de la plate-forme. Vissez le poste de libération rapide de la pince de la sonde dans la libération rapide monter sur le moteur, vers l'avant, et de positionner la tête de transducteur dans la pince, la fixation de la serrure.
    3. Fixez le connecteur de la sonde dans le port actif sur le panneau avant du panier. Allumer la machine.
  2. Initier le transducteur à ultrasons de 21 MHz, la sélection du réglage 'de cardiologie »pour des études d'imagerie moléculaire, et« générale »pour les études de perfusion. Maj tous les curseurs temps gain compensation à la position milieu exact. Pour «mode Contraste ', définir les paramètres suivants: Fréquence: 18 MHz, la puissance de transmission: 4%, (0,39 MPa), contraste Gain: 30 dB, Foci: 6 et 10 mm, Contraste Mode: non linéaire, le temps d'éclatement: 100% à 0,1largeur sec, faisceau: Large.
  3. Aliquotes 40 ml de milieu d'embryon chacun en quatre 50 ml tubes coniques. Placez sur la glace.
  4. Chauffer 1 L d'eau dans un bécher de 2 L. sur une plaque chauffante. Maintenir à 45 ° C. Ajouter une seringue de gel d'ultrasons et PBS dans le bécher pour préchauffer. Maintenir cette température par le contrôle d'un thermomètre à tout moment.
  5. Mettre de côté dix à douze seringues et 1 ml de dix à douze 21 g d'aiguilles pour l'injection de microbulles.

4. Intervention chirurgicale

NOTE: Demander à un assistant de préparer les bulles (étape 5) tandis que le chirurgien commence l'intervention chirurgicale. Le protocole décrit ici a été adapté de Whiteley et al 15.

  1. Recueillir E16,5 ou E17.5 embryons de la souris femelle enceinte suivants dislocation cervicale.
    REMARQUE: Les effets de l'anesthésie sur les embryons ne ont pas encore été étudiées en détail 16. D'autres méthodes, y compris la décapitation, peuvent être op appropriéetions pour le sacrifice des souris enceintes.
    1. Couper ouvrir l'abdomen de révéler l'utérus et les embryons. Soigneusement et rapidement enlever l'utérus en coupant à l'extrémité des cornes utérines (sectionnement des vaisseaux ovariens et utérins) et la séparation au vagin et la vessie.
    2. En utilisant une pince à échardes, transférer l'utérus à un tube de 40 ml de milieu d'embryon glacée aussi rapidement que possible sans endommager les embryons. Jeter la carcasse de la souris.
  2. Déménagerais dans un microscope et la scène. Déposer l'utérus dans une boîte de culture cellulaire de 100 x 20 mm. Transférer l'utérus dans un nouveau plat rempli de 50 ml de milieu d'embryons frais.
  3. Utilisation stérilisé (pulvérisation d'éthanol à 70%) des pinces fines, déchirer délicatement et retirez les membranes externes de l'utérus commençant à une extrémité. Exposer la caduque placentaire, pariétal sac vitellin et la membrane de Reichert pour séparer et éliminer de la vésicule ombilicale viscérale sous-jacent.
  4. On dissèque les embryons une par une, en maintenant la y viscéralesacs OLK intactes et de manutention le placenta aussi doucement que possible 17. Prenez soin d'éviter la rupture de la vésicule ombilicale que les embryons pop immédiatement.
    1. Utilisez la cuillère perforée pour déplacer les embryons à un autre plat conservé dans la glace avec les médias d'embryons frais. Garder les embryons réfrigérés jusqu'à ce que nécessaire. Changer les médias dans le plat de chaque embryon 1-1,5 h. Avec ces conditions embryons sont viables jusqu'à 4 h après la dissection.

5. microbulles Préparation

REMARQUE: Effectuez imagerie moléculaire avec des ultrasons en utilisant les deux microbulles ciblées et non ciblées. Une expérience unique peut nécessiter jusqu'à trois flacons séparés de microbulles: microbulles i) anticorps ciblée microbulles, ii) anticorps isotype contrôle ciblées et iii) microbulles non ciblées. L'agent de contraste se présente comme une poudre sèche et le gel doit être reconstitué avec une solution saline avant l'injection. Il ya ~ 2 x 10 9 microbulles dans chaque microb non cibléeflacon ubble et ~ 8,8 x 10 8 microbulles dans les flacons prêts cibles. Les microbulles sont stables pendant jusqu'à 3 heures après la reconstitution.

  1. Reconstitution des cibles Prêt flacons
    NOTE: Des exemples de préparations prêtes cibles: microbulles de endogline ciblées (MB E, avec rat biotinylé MJ 7/18 anticorps à endogline de la souris; en installations d'hybridation de la maison); vasculaire récepteur du facteur de croissance endothelial 2 (VEGFR2) microbulles ciblées (Mo V, à la biotine anti-souris CD309); isotype de rat anticorps IgG de contrôle 2 microbulles ciblées (MB C, biotine isotype de rat IgG deux cibles de maîtrise IgG2a de souris).
    1. Diluer la solution d'anticorps (20 pg) dans 1 ml (volume final) d'une solution saline. Garder sur la glace.
    2. Remplir la seringue avec 1 ml de solution saline, en supprimant toutes les bulles d'air. Fixation de l'aiguille 21 G, injectez lentement la solution dans le flacon de microbulles.
    3. Retirer lentement le piston, retirer 1 ml d'air, et de retirer l'aiguille. Doucementagiter. Laisser reposer 5 min sur la glace.
      REMARQUE: microbulles ultrasons peuvent être détruits dans des environnements à haute pression.
    4. Après le temps écoulé, remplissez une nouvelle seringue avec la dilution d'anticorps et d'ajouter au flacon approprié. Agiter doucement. Laissez le mélange (maintenant 2 ml) reposer pendant 10 min. Garder sur la glace. En supposant que la conjugaison complète de la surface, le nombre moyen de ligand lié pour les microbulles est d'environ 18 ligands 7600 / um 2.
  2. Reconstitution des flacons non ciblées
    1. Remplir la seringue avec 1 ml de solution saline, en supprimant toutes les bulles d'air. Fixation de l'aiguille 21 G, injectez lentement la solution dans le flacon de microbulles.
    2. Retirer lentement le piston, retirer 1 ml d'air, et de retirer l'aiguille. Agiter doucement. Laisser reposer 5 min. Ajouter un supplément de 1 ml de solution saline, comme décrit ci-dessus. Agiter doucement et laisser reposer 10 min sur la glace.
  3. Coulter comptage
    1. Agiter doucement le flacon de microbulles souhaitée et d'en tirer ~50 ul de la solution dans une seringue de 1 ml à l'aide de l'aiguille 21 G. Injecter les microbulles dans un 2 ml microtube vide.
    2. Introduire à la pipette un échantillon de 10 ul de la solution de microbulles de stock en 10 ml de diluant.
    3. Après mélange doux, d'évaluer la concentration et la taille des distributions de la population de microbulles en utilisant soc comptage (voir la liste des matériaux). Compter un minimum de trois mesures de 50 ul (par flacon d'échantillon) à l'aide d'une ouverture 30 um.
  4. Microbulles Préparation pour injection
    REMARQUE: L'assistant effectue cette étape lorsque 'injection de microbulles dans des embryons' (étape 6) est introduite. Chaque embryon est injecté une fois, avec le type de microbulles choisi pour chaque injection afin d'être sélectionné au hasard par l'assistant de telle sorte que tous les types de microbulles sont uniformément répartis dans la procédure, mais donnés dans un ordre aléatoire. Se assurer que le chirurgien est aveugle au type de bulle étant injecté.
    1. Déterminer ee volume de la solution stock bulle nécessaire pour produire une concentration finale de 1 x 10 8 Mo / ml dans un volume de 400 pi (calculer le volume en utilisant les concentrations mesurées dans des actions 5.3.3). Aliquoter le volume correspondant de solution saline dans un tube à centrifuger vide.
    2. Agiter doucement le flacon microbulles sélectionnée et attirera un volume excédentaire (~ 50 pi supérieure à celle calculée ci-dessus) de la solution dans une seringue de 1 ml en utilisant l'aiguille 21 G. Injecter les microbulles dans un tube à centrifuger vide.
    3. Pipeter le volume nécessaire de solution stock microbulles et ajouter à l'aliquote de solution saline. Mélanger en remuant délicatement avec la pointe de la pipette.
    4. Aspirer la solution de microbulles dilué dans une seringue propre en utilisant l'aiguille 21 G. Retrait de l'aiguille, éliminer les bulles d'air de la seringue et fixer le luer et de tubes. Poussez lentement la solution à la fin de la fabrication de tubes sûr de ne pas générer les bulles d'air.
    5. Insérez le Syringe dans une pompe à perfusion à seringue fixé pour distribuer les microbulles à un débit de 20 ul / min pour un volume total de 20 ul. Attacher une aiguille de verre tiré à l'extrémité de la tubulure. Déplacer la pompe près de l'étape d'injection.

6. injection de microbulles dans des embryons

  1. Choisissez au hasard et retirer (avec une cuillère perforée) un embryon de l'antenne des médias réfrigérés. Placez dans un plat de dissection situé sur la scène de l'échographie dans le stéréoscope et enlever la vésicule ombilicale et des membranes amniotiques avec les fines pinces, coupe / déchirure du côté qui apparaît moins vascularisée (le côté antimesometrial). Ceci est plus facilement obtenu en perçant une zone adjacente à la zone de tête.
    1. Couper suffisant pour enlever l'embryon de l'intérieur, mais pas plus. Stabiliser les plats de dissection à l'aide de petits morceaux de pâte à modeler.
  2. Manœuvrer délicatement le sac de partout dans l'embryon. Positionner l'embryon de son côté, avec le placenta etvaisseaux ombilicaux devant. En utilisant les broches insectes, cerner la vésicule ombilicale (4 broches recommandé) et les bords du placenta nécessaire d'apposer en place. Évitez les gros vaisseaux.
  3. Laver l'embryon pré-chauffé à 45 ° C jusqu'à ce que l'embryon PBS ravive. Identifier la veine ombilicale et son réseau vasculaire associée. Placez le plat de sorte que l'injection peut être effectuée confortablement.
    NOTE: Une fois réchauffé, du sang dans l'embryon commencera à couler, le pompage visiblement dans l'artère ombilicale. Lorsque le flux commence d'abord, les veines sera un rouge vif, avec le sang dans les vaisseaux apparaissant rapidement identiques. Les branches provenant de la veine ombilicale recouvrent généralement ceux de l'artère ombilicale à la surface placentaire.
  4. Une fois que l'embryon a relancé, couvrir (mais pas le placenta) avec du gel US préchauffé, en étant sûr de retirer délicatement les bulles d'air (en utilisant les pince fine) de partout dans l'embryon. Compléter le plat préalablement chauffé PBS.
    NOTE: Gardez un œil sur le niveau de solutidans les seringues PBS et de gel et ajouter seringues de sauvegarde dans le bécher de chauffage au besoin.
  5. Montez l'aiguille de verre sur une grosse boule de pâte à modeler sur le bord du plat de dissection et insérer l'extrémité de l'aiguille dans le PBS. Choisir une veine sur la surface du disque chorionique placentaire, aussi loin de la branche principale raisonnable, couper la pointe à la taille avec des ciseaux. Injection est plus facile si la pointe est coupée à un léger angle. Supprimer tous les bords dentelés du verre en utilisant le bord des ciseaux à ressort.
  6. Utilisation de la pompe seringue, injecter lentement la solution de microbulles à 20 pl / min dans l'aiguille de verre jusqu'à ce que tout l'air est expulsé de la pointe de l'aiguille et de microbulles peut être vu de circuler librement dans le PBS. Arrêtez la pompe et pour réinitialiser un volume d'injection de 20 pi. Ne pas permettre à l'air d'entrer dans le système vasculaire de l'embryon au cours de l'injection.
  7. Insérez la pointe de l'aiguille de verre doucement dans l'une des veines dans le placenta et se assurer qu'il est immobile. Balancer loin le stèretête de oscope et la position du transducteur ci-dessus l'embryon. Initier imagerie.

7. Ultrason Molecular Imaging

NOTE: En utilisant les conditions d'imagerie non linéaires de contraste précédemment définies, positionner le transducteur de façon que l'embryon se trouve également entre les foyers à 6 et 10 mm. Une fois positionné, commencer l'injection en bolus de microbulles. Lorsque l'injection est terminée, démarrer la minuterie.

  1. Imagerie de perfusion
    1. Assurez-vous que le nombre maximum d'images pour le mode de contraste non linéaire est sélectionnée en appuyant sur ​​le bouton 'de gestion d'étude »et en cliquant sur ​​l'onglet" Préférences "en haut du navigateur de l'étude. Cochez la case appropriée dans la fenêtre «Préférences».
    2. Réglez les paramètres d'imagerie en lançant imagerie non linéaire. Appuyez sur le bouton 'mode de contraste »sur le panneau de commande. Affiner le gain 2D en ajustant le «gain & #8217; composer à 30 dB, réduire la puissance à 4% en utilisant le «pouvoir» cadran, diminuer la fréquence de 1 Hz en utilisant la «fréquence» cadran et réglez la largeur du faisceau (au coin en bas à gauche) à l'échelle à l'aide du rouleau à billes / souris.
      NOTE: Toutes les commandes sont situées sur le panneau du système à ultrasons de contrôle.
    3. Capturer l'ensemble de lavage et à la dissipation de la microbulle bolus par l'enregistrement d'une boucle ciné 20 min à un débit de 1 Hz de trame. Appuyez sur SCAN / gel pour démarrer l'acquisition de données.
    4. Une fois la séquence complète des images a été capturé, appuyez sur le bouton «magasin ciné» situé sur le panneau de commande pour enregistrer la séquence d'images dans la mémoire tampon du système. Le système crée un ciné boucle horodaté des données du modèle de contraste non linéaires acquises.
  2. Ciblée microbulles Imaging
    1. Sous «Préférences», régler le temps de rafale à 0,1 sec. Définissez les paramètres d'imagerie appropriés en utilisant les contrôles described ci-dessus (7.1.2.).
    2. Initier imagerie de contraste non linéaire en appuyant sur ​​le bouton «mode de contraste» sur le panneau de commande. Se assurer que l'embryon est correctement situé sous le transducteur, et que le débit de l'agent de contraste à microbulles par l'embryon est visible dans l'image en mode non linéaire de contraste.
    3. Pour évaluer la liaison au cours d'études d'imagerie moléculaire embryonnaires microbulles ciblées, de permettre aux microbulles de circuler au repos pendant 3 min et 40 s après l'achèvement de l'injection. Cette fois est de permettre la rétention des microbulles circulent. De scan / le gel 'Appuyez sur pour arrêter l'imagerie pendant ce temps.
    4. À 3 min et 40 sec, l'imagerie de CV pour confirmer que l'embryon est encore visible, est suffisamment couvert avec du PBS, et que les bulles continuent à circuler. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'imagerie.
    5. Acquérir la séquence perturbations / reconstitution après l'injection 3 min et 50 sec en enregistrant un «pré-destructionséquence de réponse acoustique tion 'à 29 Hz. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'acquisition de données. Après l'injection de 4 min 18,19, lancer un 0,1 sec à haute fréquence acoustique rafale. Appuyez sur le bouton «éclater» à mettre en œuvre une rafale.
    6. Continuer à enregistrer des cadres pour le reste de la séquence (jusqu'à ce que la ligne de mémoire tampon est pleine) et sauver la boucle ciné en appuyant sur «magasin ciné».
    7. Recueillir une boucle ciné supplémentaire de microbulles circulation. Cette séquence d'imagerie ultérieure «post-destruction» est supposé contenir ne circulant signaux de bulles qui ont reconstitué les faisceau. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'imagerie et «magasin ciné» afin de recueillir les images.
    8. Étiqueter les boucles de ciné après imagerie chaque embryon. De la gestion de l'étude 'Appuyez sur, sélectionnez le fichier en utilisant la bille et le bouton, appuyez sur «label d'image" et le nom "select" appropriée.

    8. Manipulation des embryons après l'injection

    1. Imagerie Post, déplacer le transducteur, dégoupiller l'embryon et l'euthanasie (via la décapitation, la dislocation cervicale, dioxyde de carbone asphyxie, ou une anesthésie suivie par le gel ou la fixation rapide) comme vous le souhaitez.
    2. Pour chaque injection ultérieure de l'embryon un segment plat frais de dissection, aiguille, la seringue et le tube doit être utilisé, avec la préparation de la prochaine fournée de l'injection de microbulles prise de solution lieu lors de la dissection et de renouveau.
    3. Enregistrer des échantillons de tissus (par exemple, la queue, le cerveau) pour des analyses supplémentaires (par exemple, le génotypage déterminée par analyse PCR de l'ADN isolé de queue, lacz coloration, ou des mesures semi-quantitatives d'expression de biomarqueurs en utilisant des empreintes occidentaux 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L'injection d'agents de contraste ultrasonore dans ex utero des embryons de souris dépend de l'isolement réussi de vie, les embryons au stade gestationnel tardif de l'utérus et le maintien de la viabilité au cours de l'injection et l'imagerie par ultrasons associée. Une fois que l'embryon a été extériorisé et positionné, comme le montre la figure 1, l'injection soigneuse de l'agent de contraste dans le système vasculaire embryonnaire est possible. Une image ultrasonore en mode B typique d'un embryon E17.5 de souris est représentée sur la figure 2A. Le lavage dans de microbulles et l'amélioration correspondante de la veine cave inférieure, le coeur, le cerveau, et dans l'animal entier peut être capturé en utilisant des procédés d'imagerie non linéaires de contraste, ce qui démontre la faisabilité de cette technique. Points de temps individuels sont représentés dans la figure 2B et montrent l'évolution contraste avec le temps.

En enregistrant l'ensemble lavage-in et de wash-out of bolus de microbulles, il est possible de mesurer les différents paramètres de perfusion. Dans une analyse en ligne, l'outil de trace de la région de contraste a été utilisé pour créer 1,5 mm 2 régions d'intérêt (ROI) dans les hémisphères cérébraux droit et gauche embryonnaires. L'intensité moyenne de signal à l'intérieur de ces régions d'intérêt a été ensuite tracée en fonction du temps et lissée au moyen d'un filtre médian en sept points. De la courbe d'intensité de contraste résultant (représenté sur la figure 2C), la mise en valeur de crête cerveau a été déterminée. Le taux de lavage en, défini comme la pente entre 10% et 50% de l'amélioration maximale du pic (PE), a également été calculé. Enfin, le temps de pic (TTP) a été calculée à partir de l'apparition du signal à l'amélioration du temps de pic. Les différences dans les paramètres de perfusion moyen pour les types de bulles différents ont été testés à l'aide de tests t distincts 12. Ces résultats, résumés au tableau 1, montrent que l'injection de microbulles fournit une valeuMéthode mesure pour déterminer les paramètres de perfusion importants chez la souris de développement.

L'introduction de micro-bulles dans le système vasculaire embryonnaire permet également l'utilisation d'embryons de souris en tant que systèmes modèles pour définir et caractériser les capacités quantitatives de l'imagerie par ultrasons moléculaire. Dans l'exemple suivant, une perte de fonction modèle, où la manipulation génétique des motifs généré hétérozygotes et homozygotes expression de l'endogline de souris embryonnaires, a été utilisé pour tester l'aptitude d'imagerie par ultrasons moléculaire de différencier les génotypes. Après l'injection et la mise en oeuvre de l'imagerie destruction / la reconstitution de microbulles, le rapport de l'intensité moyenne du signal de la "pré-destruction 'à des séquences« post-destruction »a été utilisé pour produire une mesure du signal moléculaire appelé le contraste signifie rapport de puissance (CMPR ). Un modèle linéaire mixte (avec des ajustements Bonferroni faites pour les comparaisons multiples) a été effectuée pour déterminer w ue il n'y avait aucune différence significative entre endogline ciblée, de contrôle et de microbulles non ciblée se lier à des embryons de Eng (injection de poste identifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) des échantillons de la queue) Eng + / + ou. Les moyens de la CRPM estimés (moyenne ± 95% Intervalle de confiance (CI)) sont présentées pour chaque microbulles et des embryons de type à la figure 3 et sont résumés dans le tableau 2.

Ces résultats fournissent une preuve concrète que l'injection d'agents de contraste ultrasonore dans les embryons de vie isolées peut être atteint. En outre, ce protocole facilite l'évaluation des paramètres de perfusion et peut être utilisé pour comparer les modèles de liaison dans des embryons de maladie vasculaire, dans le but d'élucider les capacités de l'imagerie par ultrasons microbulles moléculaire ciblée.

.jpg "/>
Figure 1. expérimental mis en place pour l'injection de microbulles dans des embryons isolés. A 21 MHz transducteur en réseau linéaire est positionné au-dessus d'une extériorisée E16,5 embryon vivant comme une solution de microbulles de 20 ul est injectée dans une veine placentaire en utilisant une canule en verre. Barre d'échelle = 10 mm. De Denbeigh, JM et al. 12 avec la permission. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Ultrasound Imaging de vie extériorisé E17.5 embryons. (A) de l'image ultrasonore en mode B d'un embryon. Avant l'injection de microbulles ciblés (t = 0 sec). (B) image de contraste non-linéaire de l'embryon avant et après l'injection de microbulles. Contraste non linéaire image de priou d'injection de microbulles (t = 0 sec). Seules les interfaces très réfléchissantes (par exemple, os) sont visibles, avec un signal minimale des tissus mous. Ci-dessous, l'image de contraste non linéaire des microbulles à l'intérieur de l'embryon à t = 50 s, t = 120 s et t = 420 s après une injection de bolus. Le contraste est détectée tout au long de l'animal, y compris le cœur et le cerveau. Paramètres (C) de perfusion provenant de courbes d'intensité dans le temps. parcelle intensité de microbulles en fonction du temps dans un seul ROI dans le cerveau embryonnaire. paramètres de perfusion sont identifiés sur le graphique, y compris la mise en valeur de crête (PE), lavez-du taux (pente), et le temps de pic (TTP). Pointes de flèches: R = côtes, Ht = cœur, Br = cerveau. au, unités arbitraires; ROI, région d'intérêt; sec, secondes. Barre d'échelle = 3 mm. Ce chiffre a été modifié depuis Denbeigh, JM et al. 12. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Figure 3
3. ratios figure Résumé des contraste moyen signifie de puissance (CRPM) pour endogline ciblée (MB E), le contrôle (MB C) et microbulles non ciblées (MB U) dans Eng + / + et les embryons eng. CMPRs de endogline ciblées microbulles étaient significativement plus élevés (***, p <0,001) que celles recueillies pour MB MB C et U, (non significativement différent de l'autre, quel que soit le génotype). MB liaison E se est révélé être significativement plus élevé dans Eng + / + embryons (marqueurs sombres) par rapport àLes embryons de Eng (marqueurs de lumière). Les résultats présentés en moyenne ± intervalle de confiance de 95%. n indique le nombre d'embryons uniques dans chaque catégorie. De Denbeigh, JM et al. 22 avec la permission. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Type de microbulles T-tests
p-valeur
Paramètre Perfusion MB U MB C MB V MB U vs Mo C MB U vs Mo V MB <sub> C vs Mo V
Pic amélioration, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0,19 0,06 0,81
Taux Wash-in (au / sec) 0,008 ± 0,002 0,009 ± 0,002 0,011 ± 0,002 0,18 0,01 0,09
Time to Peak, TTP (s) 53,75 ± 7,96 51,75 ± 4,46 45,00 ± 5,33 0,55 0,03 0,03
# embryons injectés 4 4 3

Tableau 1. Résumé des E17.5 paramètres de perfusion embryonnaire. Moyenne ± écart-types issus de parcelles d'intensité de temps pour toutes les ROI de l'embryon (a.u. = Unités arbitraires). Le tableau comprend des mesures pour non ciblée (MB U), IgG 2 contrôle ciblé (MB C) et VEGFR2 (MB V) microbulles ciblées. T-tests séparés ont été effectuées pour comparer les groupes. Ce tableau a été modifié depuis Denbeigh, JM et al. 12.

Type de microbulles Génotype CRPM Mean 95% Intervalle de confiance
MB E Eng + / + 9,71 9,05, 10,38
Eng +/- 5,51 4,87, 6,15
MB C Eng + / + 1,42 0,41, 2,43
Eng +/- 1,46 0,45, 2,47
MB U Eng + / + 1,7 0,65, 2,75
Eng +/- 1,76 0,67, 2,84
Modèle linéaire mixte: entre sujets Effets
df Fa valeur de p
Génotype 1 12,75 <0,001
Type de microbulles 2 147,65 <0,001
Génotype * Type de microbulles 2 18,29 <0,001

Tableau 2. Résumé des linéaires analyse de modèle mixte pourmicrobulles de liaison dans les embryons, avec une correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. Génotype, le type de microbulles et l'interaction combinée (génotype * Type de microbulles) se sont révélés être des facteurs importants dans la détermination de la CRPM. df = degrés de liberté. De Denbeigh, JM et al. 22 avec la permission.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ultrasons agents de contraste ont été injectés dans des embryons de souris gestation stade avancé et des images de contraste non linéaires ont été acquis pour mesurer les paramètres de perfusion et de microbulles ciblées contraignant. Imagerie réussie des microbulles à l'intérieur du système vasculaire embryonnaire était dépendant d'un certain nombre de facteurs, le premier étant embryon viabilité. Tous les équipements et appareils ont été préparées à l'avance afin de minimiser le temps nécessaire pour l'isolement des embryons dans l'utérus au début de l'injection. Comme les effets de l'exposition unique ou répétée à l'anesthésie sur des souris embryonnaires ne ont pas été étudiées en détail, l'utilisation de l'anesthésie chez la mère a été évitée avant le sacrifice 16. Au cours de l'isolement de l'embryon, il était important pour éviter d'endommager le sac jaune et d'assurer embryons ont été maintenus réfrigérés en tout temps, dans les médias sur l'embryon souvent rafraîchi. Lorsque extérioriser l'embryon avant l'injection et pendant épinglant, principaux vaisseaux vitellins ont été évités de limiter la likelihood de saignement, ce qui pourrait être mortel. Nous avons constaté que lorsque la relance de l'embryon, ce qui était le mieux pour couvrir la première le placenta et de l'embryon avec du PBS, avant d'appliquer le gel de l'échographie à l'embryon dans un va-et-vient et d'éliminer les grosses bulles avec une pince. Le reste de la boîte de Petri a été ensuite rempli avec du PBS. L'utilisation de gel et PBS limité la possibilité de poches d'air entre l'embryon et le transducteur, qui pourraient influer sur la qualité de l'image. Comme l'embryon relancé, le sang a commencé à couler, le pompage visiblement dans l'artère ombilicale tandis que les veines ombilicales sont apparus rouge 23 lumineux. Pour référence, les branches provenant de la veine ombilicale recouvrent généralement ceux de l'artère ombilicale à la surface placentaire. Même se il était possible d'injecter dans les artérioles de labyrinthe placentaires, l'injection des microbulles dans le sens de débit réduit saignement placentaire et veinules injections également permis les microbulles à passer directement à travers l'embryon avant ème circulationrugueuse le placenta.

En raison de leur fragilité, la préparation et la manipulation microbulles également besoin de soins. microbulles d'ultrasons peuvent être détruits dans des environnements à haute pression. Par conséquent, exactement la même procédure a été répétée au cours de chaque concentration de reconstitution et de bulle a été mesuré pour assurer la cohérence expérimentale. Un flacon unique de microbulles était généralement suffisant pour environ 5-7 embryons. Etant donné que les microbulles sont stables à l'intérieur de la fiole jusqu'à 3 h, plusieurs flacons ont été souvent nécessaire pour une seule expérience. Pour éviter de déchirer le tissu, ce était mieux pour le pointe du verre de l'aiguille d'injection pour être forte et couper sur un léger angle en se approchant du navire au plus petit angle possible. Une fois parés, la pointe de l'aiguille devait être suffisamment grande pour que les bulles de se écouler facilement à travers la fin sans agglutination, mais assez petit pour tenir facilement dans le navire. La taille idéale était généralement <100 um. Certains pratiquent à juger appropriétaille était nécessaire. Dans le cas où la pointe a été coupé trop grande, ou se est bloqué, une nouvelle aiguille de verre a été appliquée. Il certains cas, il était possible de couper l'aiguille légèrement au-dessus du blocage. Il était essentiel que l'air ne soit pas autorisé à entrer dans le système vasculaire de l'embryon lors de l'injection, car cela pourrait entraîner la mort de l'animal et ne était pas souhaitable lors de l'imagerie (bulles d'air pourraient se loger dans le système vasculaire de l'embryon et être détectable dans l'image échographique , augmenter artificiellement tout signal mesuré). Imagerie de contraste non linéaire effectuée dans ce protocole utilisé un état de l'art à haute fréquence (21 MHz) système de micro-échographie (Vevo2100) jumelé avec des réseaux linéaires conçus spécifiquement pour imagerie du petit animal (MS250). Micro- ou haute -Echographie de fréquence est l'un des rares modalités capables, à ce moment, pour fournir des images de haute résolution de vivre embryons et les nouveau-nés 16 murins. Ce système peut obtenir des résolutions axiales et latérales de 75 um et 165 μm respectivement à des profondeurs aussi grandes que 15 mm. Il était donc possible à l'image l'ensemble embryon à des résolutions beaucoup plus élevés que généralement réalisé en utilisant des instruments cliniques et le signal acoustique de microbulles peuvent être distingués des tissus en utilisant des méthodes d'imagerie de contraste non linéaires (y compris l'inversion d'impulsion et techniques de modulation d'amplitude 24). Bien que nous avions le meilleur succès avec les paramètres ultrasonores décrites ici, il est possible que certains ajustements à ces paramètres sera également produire des résultats satisfaisants. Dans tous les cas, une faible puissance est requise pour l'imagerie de microbulles pour éviter la destruction indésirable des microbulles avant le début d'une salve alors que la courte rafale élimine seulement une petite fraction de la population de microbulles. Avec la pratique, toute la procédure pour un seul embryon, du positionnement à l'achèvement de l'imagerie par ultrasons moléculaire, a duré environ 15 minutes. Nous avons injecté avec succès le plus grand nombre de 12 embryons dans une litièreune seule session.

expériences d'injection ont été limitées à une fenêtre de 4 heures en raison de la viabilité des embryons limité. Comme la répartition des microbulles était dépendant de la circulation de l'embryon lui-même, les injections ne pourrait avoir lieu avant le temps cardiaque (E8.5) et le flux détectable dans le vitelline et ombilical circulation (E9.5) a été créé 25. Avec la maturation du placenta pas complète tant E14.5, l'injection d'agents de contraste à travers le labyrinthe placentaire a été limitée aux embryons de milieu à la fin de l'âge gestationnel. D'après les observations, les embryons étaient plus proches à terme plus résistantes et peuvent supporter une augmentation de leur volume vasculaire mieux que leurs homologues plus jeunes. Ensemble, ces facteurs restreints contraste amélioré échographie de la vascularisation embryonnaire à des étapes ultérieures de développement et de croissance angiogénique. Cela peut affecter la disponibilité de modèles de souris transgéniques, car la manipulation des récepteurs impliqués dans Vascdéveloppement et la maintenance parti- (par exemple, VEGFR2, VCAM-1) peut conduire à létalité ou des défauts dans le développement embryonnaire et la réglementation des systèmes circulatoires embryonnaires 26,27. Néanmoins, un certain nombre de systèmes modèles pertinents sont disponibles pour les marqueurs vasculaires d'intérêt, notamment α 2 β 1 28, α v β 3 29, de plaquettes molécule-1 d'adhérence des cellules endotheliales 30, et l'adhésion cellulaire vasculaire molécule-1 31, molécule d'adhésion intercellulaire -1 et 32 -2 et 33 34 P-sélectine. Qui plus est, le cerveau histogénèse commence après la mi-gestation 11, ce qui rend l'expression de marqueurs angiogéniques dans ce tissu probable et fournissant ainsi une excellente alternative au modèle traditionnel de la tumeur pour les études évaluant les aspects quantitatifs de l'imagerie moléculaire.

La nature ex vivo des injections ne présenter certains limitations. Il est important de noter qu'après les embryons ont été retirés de la mère et du labyrinthe placentaire percé, il ne était généralement pas possible (ni souhaitable) à faire des injections répétées. En outre, isoler l'embryon de la circulation maternelle limite l'apport de nutriments et O 2, et devrait santé embryonnaires à se détériorer avec le temps. Bien que la réfrigération et la renaissance prolonge la viabilité des embryons, il peut également avoir un impact la fonction cardiaque. Par exemple, nous avons observé que les embryons isolés avaient une fréquence cardiaque réduite (données non incluses, consultez Denbeigh et al. 12) par rapport à ceux précédemment observés in vivo 35. Il est donc probable que les études évaluant la physiologie cardiovasculaire ne seront pas refléter avec précision dans des conditions in vivo. Avec peu d'études caractérisant hémodynamique circulatoires dans l'embryon vivant de la souris à un stade avancé, cependant, il est difficile de dire avec certitude dans quelle mesure ces conditions expérimentales peuvent alter fonction physiologique. Une alternative consiste à effectuer des injections in utero, soit à travers une incision laparoscopique 36 ou par le ventre de la mère enceinte directement 37, bien que cette approche peut présenter son propre ensemble de défis 11. Dans certains cas, l'isolement et l'extériorisation de l'embryon peut également entraîner une hémorragie significative du sac vitellin. Bien que nous avons découvert que nous pouvions inhiber le flux sanguin à ultrasons avec un gel, une perte importante de sang pourrait affecter la prestation et la concentration de microbulles, et ces animaux ont été exclus de l'analyse. Enfin, alors que l'isolement ne limite maternelle et sources embryonnaires de mouvement, mouvement périodique lié à l'activité cardiaque est inévitable. Nous avons choisi de l'image du cerveau statique afin d'examiner directement l'effet de l'expression du récepteur sur le signal microbulles ciblées, mais la mise en œuvre en temps réel compensation de mouvement contraste amélioré échographie 38 maiétendre ces études à d'autres organes.

Il ya quelques applications d'imagerie qui sont actuellement en mesure d'évaluer le paysage vasculaire de la salle de développement embryon de souris. Certaines études ont effectué avec succès imagerie en temps réel de la circulation sanguine dans les ex vivo embryons murins utilisant Doppler balayé source tomographie par cohérence optique 39,40, tandis que l'imagerie par résonance magnétique, la corrosion vasculaire jette, microtomographie et la projection tomographie optique ont été mis en œuvre post-mortem 16. Ce est regrettable, car cette période de croissance embryonnaire peut révéler des informations cruciales concernant le développement et la fonction vasculaire précoce. Imagerie microbulles dans les embryons vivants pourrait donc contribuer à notre compréhension de la physiologie du développement. Il pourrait également être utilisé pour visualiser la distribution de biomarqueurs dans le corps entier du fœtus de souris vivante en temps réel, bien que cette technique est peu probable pour remplacer les méthodes existantes (y compris histologieet l'imagerie de fluorescence) pour la mesure de signaux moléculaire dans le tissu embryonnaire. La masse se développe rapidement des navires dans les embryons, cependant, ressemble étroitement à la croissance tumorale, avec l'expression d'un grand nombre des mêmes récepteurs clés identifiés dans l'angiogenèse tumorale 41,42 et peut donc servir comme un excellent substitut de la tumeur pour les études portant sur ​​les capacités quantitatives de moléculaire ultrasons. Nous prévoyons donc que les méthodes décrites seront utiles non seulement pour évaluer et caractériser les modèles embryonnaires de la santé vasculaire et la maladie grâce à l'imagerie fonctionnelle, mais offre une avenue pour explorer les forces et les limites de l'imagerie moléculaire ainsi. Son application pourrait également se étendre à d'autres domaines intéressants de l'enquête, y compris in utero thérapie de transfert de gène où microbulles ont été testés comme un moyen de fournir de l'ADN nu pour les tissus de la souris fœtale 10. En variante, la cartographie vasculaire 3D de l'embryon vivant est également possible,qui peuvent fournir des informations précieuses sur les anomalies morphologiques chez des souris génétiquement modifiées. Introduction d'agents de contraste ultrasonore dans les embryons vivants isolés pourrait donc être un autre outil pour accroître notre compréhension de la maladie vasculaire et la traduction des applications d'échographie contraste renforcé à la clinique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48, (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47, (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37, (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260, (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242, (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26, (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110, (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5, (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48, (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40, (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17, (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10, (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121, (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47, (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51, (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258, (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26, (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18, (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36, (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20, (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17, (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13, (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4, (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103, (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3, (8), (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics