Den Bioconjugation og Radiosynthesis af

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den ekstraordinære affinitet, specificitet og selektivitet af antistoffer gør dem særdeles attraktive vektorer for tumor målrettet PET radioaktive lægemidler. På grund af deres multi-dages biologisk halveringstid, skal antistoffer være mærket med positron-emitterende radionuklider med relativt lange fysiske forfald halveringstider. Traditionelt positron-emitterende isotoper 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 timer), og 64 Cu (t 1/2 = 12,7 timer) er blevet anvendt til at mærke antistoffer til PET-billeddannelse. For nylig har imidlertid feltet oplevet en dramatisk stigning i brugen af positron-emitterende radiometal 89 Zr i antistofbaserede PET imagografimidler. 89 Zr er en næsten ideel radioisotop for PET imaging med immunokonjugater, som det har en fysisk halvdel -liv (t 1/2 = 78,4 timer), som er kompatibel med de in vivo farmakokinetik af antistoffer og udsender en relativ lav eneRGY positron, der producerer billeder i høj opløsning. Endvidere kan antistoffer ligefrem mærket med 89 Zr hjælp af siderofor-afledte chelator desferrioxamin (DFO). I denne protokol, vil prostata-specifikke målretning membran-antigen-antistof J591 anvendes som et modelsystem til at illustrere (1) bioconjugation af den bifunktionelle chelator DFO-isothiocyanat til et antistof, (2) radiosynthesis og oprensning af en 89 Zr- DFO-mAb radioimmunokonjugatet, og (3) in vivo PET billeddannelse med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunokonjugatet i en musemodel af cancer.

Introduction

På grund af deres bemærkelsesværdige følsomhed, affinitet og selektivitet er antistoffer længe været betragtet som lovende vektorer til levering af radioisotoper til cancerceller. Imidlertid har deres anvendelse i positronemissionstomografi (PET) billeddannelse været hæmmet af manglen på en passende positron-emitterende radioisotop for deres mærkning. 1-3 En af de mest kritiske overvejelser i udformningen af radioimmunoconjugates matcher den fysiske forfald halv- levetid radioisotop til in vivo-farmakokinetik af antistoffet. Mere specifikt antistoffer har ofte forholdsvis lange, multi-dages biologiske halveringstider, og derfor skal mærkes med radioisotoper med sammenlignelige fysiske halveringstider. For PET billedbehandlingsprogrammer har antistoffer traditionelt været radioaktivt mærket med 64 Cu (t 1/2 = 12,7 timer), 86 Y (t 1/2 = 14,7 timer), eller 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4, Men hver af 5disse radioisotoper besidder væsentlige begrænsninger, der hæmmer deres egnethed til klinisk billeddannelse. Mens radioimmunoconjugates mærket med 86 Y og 64 Cu har vist lovende i prækliniske undersøgelser, begge isotoper besidder fysiske halveringstider, der er for kort til at være effektiv til billeddannelse i mennesker. 124 Jeg derimod har en næsten ideel fysisk halveringstid for billeddannelse med antistoffer, men det er dyrt og har suboptimale henfald egenskaber, der fører til relativt lav opløsning kliniske billeder. Endvidere kan 124-mærket radioimmunoconjugates underkastes dehalogenering in vivo, en proces, der kan sænke tumor-til-baggrund aktivitet forhold. 6,7

Drevet til at finde en positron-emitterende radioisotop at fortrænge 64 Cu, 86 Y, og 124 jeg i radioimmunoconjugates har givet næring den seneste stigning i forskning i 89 Zr-mærkede antistoffer. 8-12 Than årsag til fremkomsten af 89 Zr er ligetil: de radiometal besidder næsten ideelle kemiske og fysiske egenskaber til brug i diagnostiske PET radioimmunoconjugates 13 89 Zr fremstilles via 89 Y (p, n) 89 Zr reaktion på en cyklotron ved hjælp af en. kommercielt tilgængelige og 100% naturligt forekommende 89 Y målet. 14,15 Den radiometal har en positron udbytte på 23%, henfalder med en halveringstid på 78,4 timer og udsender positroner med den relativt lave energi 395,5 keV (figur 1). 13,16,17 Det er vigtigt at bemærke, at 89 Zr udsender også en høj energi, 909 keV γ-ray med 99% effektivitet. Mens dette emission ikke griber energisk med de udsendte 511 keV fotoner, det kræver ekstra overvejelser med hensyn til transport, håndtering og dosimetri. Trods denne advarsel disse henfaldskarakteristikkerne sidste ende betyder, at 89 Zr ikke kun har en gunstigere half-liv for billeddannelse med antistoffer end 86 Y og 64 Cu men kan også producere billeder med højere opløsning end 124 I, som udsender positroner med højere energier 687 og 975 keV, samt et antal fotoner med energier inden 100-150 keV af 511 keV positron-skabte fotoner. 13 Endvidere 89 Zr er også sikrere at håndtere, billigere at fremstille, og residualizes i tumorer mere effektivt end dets radioaktivt modstykke. 18,19 En mulig begrænsning af 89 Zr er, at det ikke har en terapeutisk isotopologue fx 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapi). Dette udelukker opførelsen af ​​kemisk identiske, surrogat billeddannende midler, der kan anvendes som dosimetriske spejdere til deres terapeutiske kolleger. Når det er sagt, undersøgelser tyder på, at 89 Zr-mærkede antistoffer har potentiale som billeddannende surrogater for 90 Y- og 177 Lu-mærkede immunkonjugater.20,21

Fra et kemisk synspunkt, som et gruppe IV metal, 89 Zr eksisterer som en 4 kation i vandig opløsning. ZR 4+ ion er stærkt opladet, relativt stor (effektiv ionradius = 0,84 Å), og kan klassificeres som en "hård" kation. Som sådan er det udviser en præference for ligander, der bærer op til otte hårde, anioniske ilt donorer. Let den mest almindelige chelatoren anvendt i 89 Zr-mærkede radioimmunoconjugates er desferrioxamin (DFO), en siderofor-afledt, acyklisk chelator bærer tre hydroxamat grupper. Liganden stabilt koordinerer Zr 4+ kation hurtigt og rent ved stuetemperatur på biologisk relevante pH-niveauer, og den resulterende Zr-DFO-kompleks forbliver stabil i løbet af flere dage i saltvand, blodserum og fuldblod. 22 Computational studier tyder stærkt at DFO danner et hexacoordinate kompleks med Zr 4+, hvori metallet center er koordineret til tre Neutral og tre anioniske ilt donorer af liganden samt to eksogene vand ligander (Figur 2). 23,24 In vivo opførsel radioimmunoconjugates beskæftiger den 89 Zr-DFO konjugering stillads har generelt været fremragende. Men i nogle tilfælde, billedbehandling og akutte biodistributionsstudier har vist forhøjede aktivitetsniveauer i knoglerne i mus injiceret med 89 Zr-mærkede antistoffer, data, der tyder på, at osteophilic 89 Zr 4+ kation frigives fra chelatoren in vivo og efterfølgende mineralizes i knoglen. 25. For nylig har en række undersøgelser af udviklingen af nye 89 Zr 4+ chelatorer især ligander med otte ilt donorer har optrådt i litteraturen. 24,26,27 dog på nuværende tidspunkt, DFO er den mest anvendte chelator i 89 Zr-mærket radioimmunoconjugates med en bred margin. En række forskelligebioconjugation strategier er blevet anvendt til at fastgøre DFO til antistoffer, herunder bioorthogonal klik kemi, omsætning af thiol-reaktivt DFO konstruktioner med cysteiner i antistoffet, og omsætningen af aktiveret ester-bærende DFO konstruktioner med lysiner i antistoffet. 4,28- 30 Let den mest almindelige strategi har imidlertid været anvendelsen af et isothiocyanat-bærende derivat af DFO, DFO-NCS (figur 2). 22 Denne kommercielt tilgængelig bifunktionel chelator robust og pålideligt danner stabile, covalent thiourinstof-bindinger med lysinerne i antistof (figur 3).

I de seneste år har en lang række 89 Zr-DFO-mærkede radioimmunoconjugates blevet rapporteret i litteraturen. Prækliniske undersøgelser har især været rigelige, og byder antistoffer lige fra de mere velkendte cetuximab, bevacizumab og trastuzumab til mere esoteriske antistoffer såsom CD105-targeting TRC105 og fPSA-targeting 5A10. 30-36 Senere har et lille antal tidlige fase kliniske forsøg med 89 Zr-DFO-mærkede antistoffer opstod i litteraturen. Konkret har grupper i Nederlandene publicerede forsøg beskæftiger 89 Zr-DFO-cmAb u36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, og 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Derudover er en række andre kliniske forsøg med 89 ZR-mærkede radioimmunoconjugates er igangværende, herunder efterforskning her på Memorial Sloan Kettering Cancer Center ved hjælp af PSMA-målretning 89 Zr-DFO-J591 for prostatakræft billedbehandling og HER2-rettet 89 Zr-DFO-trastuzumab for brystkræft billeddannelse. 23, 30 Hertil kommer, mens radiomærkede antistoffer forbliver de mest almindelige 89 Zr-mærkede radioaktive lægemidler den radiometal er også i stigende grad været ansat andre vektorer, herunder peptider, proteiner og nanomaterialer. 38-43

Den modularitet med denne 89 Zr-DFO mærkning metode er et enormt aktiv. Repertoiret af biomarkør målretning antistoffer er stadigt voksende, og interessen for at udføre in vivo PET-billeddannelse ved hjælp af disse konstruktioner er i hastig vækst. Som et resultat mener vi, at udviklingen af ​​mere standardiserede fremgangsmåder og protokoller kan gavne området. En fremragende skrevet forsøgsprotokol til DFO-NCS konjugering og 89 Zr radioaktiv mærkning er allerede blevet offentliggjort af Vosjan, et al. 22 Vi føler, at det visuelle demonstration, som dette arbejde yderligere kunne hjælpe efterforskerne ny på disse teknikker. I protokollen ved hånden, vil prostata-specifikke målretning membran-antigen-antistof J591 anvendes som et modelsystem til at illustrere (1) bioconjugation af den bifunktionelle chelator DFO-isothiocyanat til et antistof, (2) radiosynthesis og oprensning af 89 ZR-DFO-mAb radioimmunokonjugatet,og (3) in vivo PET billeddannelse med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunokonjugatet i en musemodel af cancer. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de in vivo dyreforsøg beskrevne blev udført efter en godkendt protokol og under de etiske retningslinjer for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

1. Konjugering af DFO-NCS til J591

  1. I et 1,7 ml mikrocentrifugerør, fremstilles en opløsning 2-5 mg / ml J591 i 1 ml af enten 1x phosphatpufret saltvand (pH 7,4) eller 0,5 M HEPES-buffer (pH 7,4).
  2. Opløs DFO-NCS i tørt DMSO ved en koncentration på mellem 5-10 mm (3,8-7,6 mg / ml). Lydbehandles eller vortex opløsningen grundigt for at lette fuldstændig opløsning.
  3. Indstil pH af J591 opløsning til 8,8-9,0 ved tilsætning af små portioner (<10 pi) af 0,1 M Na 2 CO 3.
  4. Når antistoffet løsning er i den korrekte pH, tilsættes et volumen af ​​DFO-NCS opløsning svarende til en 3-4-fold molært overskud af det bifunktionelle chelator.
    1. For eksamenPLE, tilsættes 4-5 pi af en 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-opløsning (40,4 nmol DFO-NCS) til 1 ml af en 2 mg / ml J591 antistof opløsning (13,3 nmol J591). Mængden af ​​DMSO i den endelige vandige reaktionsblanding bør ikke overstige 2% v / v.
  5. Inkuberes reaktionsblandingen i 30 minutter ved 37 ° C på en omrøring varmeblok ved 350 rpm.
  6. Efter 1 time ved 37 ° C, oprense det resulterende immunokonjugat ved hjælp af en færdigpakkede engangs størrelse udelukkelse afsaltning søjle med en 50.000 molekylvægt cut-off under anvendelse af 0,5 M HEPES-buffer (pH 7,4) som eluent. Dette skridt vil give en 2 ml opløsning af den færdige J591-DFO konstruktion.
  7. Måle koncentrationen af ​​J591-DFO konstruere en UV-Vis spektrofotometer.
  8. Hvis der ønskes en højere koncentration af konstruktionen koncentreres J591-DFO opløsning under anvendelse af en centrifugal filterenhed med en 50.000 molekylvægt cut-off.
  9. Opløsningen opbevares af den færdige J591-DFO immunkonjugatet ved -20 ° C i mørke.

2. Radiomærkning J591-DFO med 89 Zr

ADVARSEL: Dette trin i protokollen indebærer håndtering og manipulation af radioaktivitet. Før du udfører disse trin eller udfører andet arbejde med radioaktivitet forskere bør rådføre sig med deres hjem institutions Radiation Safety afdeling. Bør tages alle mulige skridt for at minimere udsættelse for ioniserende stråling.

BEMÆRK: Af hensyn til korrekt radiokemiske note-føring skal måles, er mængden af ​​radioaktivitet i prøven ved hjælp af en dosiskalibrator og registreres før og efter trin 2,2-2,13 i protokollen nedenfor. Dette vil hjælpe med nøjagtig bestemmelse af radiokemiske udbytter og specifikke aktiviteter.

  1. Der fremstilles en opløsning af 0,5-2,0 mg J591-DFO i 200 pi 0,5 M HEPES-buffer, pH 7,5.
  2. Pipette et volumen af ​​<sup> 89 Zr 4+ stamopløsning (typisk leveres i 1,0 M oxalsyre) svarende til 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) i en 2 ml plast skruelåg mikrocentrifugerør. Juster lydstyrken af ​​denne opløsning til i alt 300 pi anvendelse af 1,0 M oxalsyre.
  3. Juster pH-værdien af 89 Zr 4+ opløsning til 6,8-7,5 ved anvendelse af 1,0 M Na 2 CO 3. Begynd med at tilsætte 250 pi 1,0 M Na 2 CO 3 til 89 Zr 4+ opløsning og efterfølgende tilføje mindre (<10 pi) portioner af base for at opnå den ønskede pH.
  4. Tilføj den ønskede mængde af pH-justeret 89 Zr 4+ løsning på J591-DFO opløsning fremstillet i trin 2.1.
  5. Kontroller pH af radiomærkning reaktionsblandingen for at sikre, at det falder inden for det ønskede område af 6,8-7,5.
  6. Inkubér radiomærkning reaktion i 60 minutter ved stuetemperatur på en omrøring varmeblok ved 350 rpm.
  7. Efter 60 minutters inkubation, måle radiolabeling udbyttet af reaktionen ved hjælp af radio-TLC.
    1. Til dette formål spot 1 uCi af radiomærkning reaktionsblandingen på en silica-imprægneret TLC strip. Lad portionen til tørre, køre TLC ved anvendelse af en eluent af 50 mM DTPA (pH 5,5) og analysere TLC strimler ved hjælp af en radio-TLC scanner. 89 Zr 4+ bundet til J591-DFO konstruktion vises til grund (R f <0,1), mens gratis 89 Zr 4+ kationer vil blive chelateret med DTPA og elueres med opløsningsmiddelfronten (Rf> 0,9).
    2. Beregn radiomærkning udbyttet af reaktionen ved at integrere radiochromatogram, dividere arealet under kurven fra Rf 0,0-0,1 med det samlede areal under kurven, og multiplicere med 100.
  8. Hvis radiomærkning Udbyttet er tilstrækkelig (typisk en teoretisk specifik aktivitet på> 2 mCi / mg), stands reaktionen med 5 pi 50 mM DTPA, pH 5,5.
  9. Oprens den resulterende immunokonjugat USIng en færdigpakkede engangs størrelse udelukkelse afsaltning søjle med en 50.000 molekylvægt cut-off ved hjælp af en eluent af enten 0,9% sterilt saltvand med 5 mg / ml gentisinsyre eller 0,25 M natriumacetat (pH 5,5) med 5 mg / ml gentisinsyre . Dette skridt vil give en 2 ml opløsning af den udfyldte 89 Zr-DFO-J591 radioimmunokonjugatet.
  10. Efter oprensning kontrollere den radiokemiske renhed af de 89 Zr-DFO-J591 hjælp radio-TLC som beskrevet i trin 2.7.
  11. Beregne den samlede radiomærkning udbyttet af reaktionen ved at dividere mængden af aktivitet oprindeligt tilsat til antistoffet løsning af mængden af radioaktivitet isoleret med det oprensede 89 Zr-DFO-J591 radioimmunokonjugatet.
  12. Beregn den endelige specifikke aktivitet ved at dividere mængden af aktivitet isoleret med det rensede 89 Zr-DFO-J591 radioimmunokonjugatet af den oprindelige masse af DFO-J591 i radioaktiv mærkning reaktion.
  13. Hvis der ønskes en højere koncentration, koncentrere the 89 Zr-DFO-J591 opløsning under anvendelse af en centrifugal filterenhed med en 50.000 molekylvægt cut-off.
    BEMÆRK: gentisinsyre anvendt i det endelige oprensningstrin er en radio-beskyttelsesmiddel anvendes til at minimere nedbrydning af antistoffet skyldes radiolyse 46 Mens opbevaring af 89 Zr-DFO-J591 radioimmunokonjugatet for op til 48 timer ved 4 ° C. er muligt, er det ikke anbefales. Hvis radioimmunkonjugatets skal opbevares, anvende 0,25 M natriumacetat (pH 5,5) med 5 mg / ml gentisinsyre som lagerbuffer for at minimere risikoen for hypochlorit-medieret radiolyse. 47

3. In vivo PET Imaging med 89 Zr-DFO-J591

ADVARSEL: Som i protokol afsnit 2, dette trin i protokollen indebærer håndtering og manipulation af radioaktivitet. Før du udfører disse trin forskere bør rådføre sig med deres hjem institutions Radiation Safety afdeling. Alle possibbør tages le skridt til at minimere udsættelse for ioniserende stråling.

  1. Hos mandlige athymiske nøgne mus, subkutant implantat 5 x 10 6 LNCaP prostatacancerceller og tillade disse at vokse til en 100-150 mm 3 xenograft (3-4 uger efter inokulering). 44
  2. Fortynd 89 Zr-DFO-J591 radioimmunokonjugatet til en koncentration på 1,0 mCi / ml i 0,9% sterilt saltvand.
  3. Injicer 200 pi af 89 Zr-DFO-J591-opløsning (200 uCi 7.4 MBq). I den laterale halevene af xenograft-bærende mus 48
  4. Ved det ønskede imaging tidspunkt (f.eks, 12, 24, 48, 72, 96 eller 120 timer efter injektion), bedøver musen med en 2% isofluran: gasblanding oxygen.
  5. Placer musen på sengen af ​​det lille dyr PET-scanner, og opretholde anæstesi under scanningen ved hjælp af en 1% isofluran: gasblanding ilt. Forud for at placere dyret på scannerpladen, kontrollere anæstesi ved hjælp af tå-pinch metode og Apply oftalmologiske salve til øjnene på musen for at forhindre udtørring under anæstesi. 49
  6. Erhverve PET data for mus via en statisk scanning med minimum 40 millioner sammenfaldende begivenheder ved hjælp af en energi vindue på 350-700 keV og en tilfældighed timing vindue på 6 ns. 50
  7. Efter at have afsluttet købet af billedet, ikke forlader musen uden opsyn og ikke placere den i et bur med andre mus, indtil det har genvundet bevidstheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første skridt i denne protokol bøjningen af ​​DFO-NCS til antistoffet er typisk ganske robust og pålidelig. Generelt kan det oprensede, chelator-modificerede immunokonjugat opnås i> 90% udbytte, og under anvendelse af 3 molækvivalenter af DFO-NCS i den oprindelige konjugationsreaktion vil give en vis-of-mærkning af chelatoren omtrent 1,0-1,5 DFO / mAb. De 89 Zr radioaktiv mærkning og purifikationstrin proceduren er også ligetil. Ved de koncentrationer, der er skitseret i ovennævnte protokol, radioaktiv mærkning udbytter på> 80% og dermed specifikke aktiviteter> 2,0 mCi / mg er typisk efter 60 minutter ved stuetemperatur. Radioen-TLC-kromatogram af det rå radiomærkning blandingen vil sandsynligvis afsløre nogle DTPA-bundet 89 Zr 4+ der eluerer ved opløsningsmiddelfronten (figur 4A). Men efter standsning af reaktionen med DTPA og oprensning 89 Zr-DFO-mAb konstruere via gelpermeationskromatografi er radiochemical renhed af det oprensede, isolerede 89 Zr-DFO-mAb-konjugat skal være> 95% (figur 4B). I tilfælde af at den radiokemiske renhed af det isolerede 89 Zr-DFO-mAb konjugatet er mindre end 95%, skal rensning procedure gentages forud for udførelse af en in vitro eller in vivo forsøg.

Går videre til in vivo eksperimenter, i protokollen beskrevet ovenfor, athymiske nøgne mus der bærer PSMA-udtrykkende, LNCaP prostatakræft xenotransplantater blev ansat til at undersøge in vivo adfærd 89 Zr-DFO-J591. Både akut biodistribution og PET-billeddannelse eksperimenter viste, at 89 Zr-DFO-J591 klart afgrænser de prostatakræft xenotransplantater med fremragende billedkvalitet kontrast og høje tumor-til-baggrund aktivitet nøgletal (figur 5). Optagelsen af ​​radioimmunkonjugatets i tumoren er tydelig allerede efter 24 timer (20,9% ± 5,6% ID / g), og aktivitetenkoncentration i tumoren stiger til et maksimum på 57,5% ± 5,3% ID / g ved 96 timer efter injektion. Som det er typisk for radioimmunoconjugates, en relativt høj koncentration af radiotracer er til stede i blodet på tidlige tidspunkter (9,1% ± 5,3% ID / g ved 24 timer), efterfulgt af en langsom nedgang i mængden af ​​radioaktivitet i blodet over løbet af eksperimentet. Den ikke-målvæv med den højeste aktivitet blev knoglen, hvilket viste optagelse værdier omkring 10% ID / g hele eksperimentet, formentlig som følge af in vivo frigivelse af osteophilic kation 89 Zr 4+. Alle andre organer, herunder hjerte, lunge, lever, milt, mave, store og tyndtarmen, nyre og muskel viste koncentrationer relativt lave aktivitet, ofte et godt stykke under 5% ID / g. Som en kontrol blev en yderligere gruppe af mus injiceret co-injiceret 300 ug umærket DFO-J591 for at mætte antigenet og illustrerer således selektiv blokering. Criti tisk, det blokerende eksperiment sænket optagelse af radioimmunkonjugatets i tumoren fra 48,9% ± 9,3% ID / g til 23,5% ± 11,1% ID / g efter 72 timer efter injektion, klart indikerer, at 89 Zr-DFO-J591 målretter selektivt sin antigen.

Figur 1
Figur 1. (A) En forenklet henfald ordning og (B) nogle fremtrædende henfald karakteristika for 89 Zr 13,16,17 IT = isomere overgang.; EF = elektron capture. Ændret og genoptrykt med tilladelse fra Deri, et al. Nuklearmedicin og biologi. 40, 3-14 (2013). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

re 2 "src =" / files / ftp_upload / 52521 / 52521fig2highres.jpg "width =" 700 pixel "/>
Figur 2. (A) Strukturen af DFO-NCS med de koordinerende oxygenatomer farvet rød; (B) en DFT-afledte struktur af Zr-DFO koordinationskompleks. Ændret og genoptrykt med tilladelse fra Deri, et al. Journal of Medicinal Chemistry. 57, fra 4849 til 4860 (2014). Copyright 2014 American Chemical Society. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3

Figur 3. Skema af bioconjugation og radioaktiv mærkning af 89 Zr-DFO-J591.ET = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Repræsentative radio-TLC kromatogrammer af den rå radiomærkning blanding (A) og oprenset produkt (B) på 89 Zr-DFO-J591. Radio-TLCS blev kørt på silica strimler under anvendelse af en eluent af 50 mM DTPA, pH 5,0. Venligst klik her for en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Supragingival PET billeder af 89 Zr-DFO-J591 (11,1-12,9 MBq [300-345 uCi] injiceret via halevenen i 200 pi 0,9% sterilt saltvand) i athymiske nøgne mus der bærer subkutane, PSMA-udtrykkendeLNCaP prostatakræft xenotransplantater (hvide pile) mellem 24 og 120 timer efter injektion. Modificeret og genoptrykt med tilladelse fra Zeglis, et al. Bioconjugate Chemistry. 24, 1057-1067 (2013). Copyright 2013 American Chemical Society. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens byggeriet, radioaktiv mærkning, og billedbehandling på 89 Zr-DFO-labled radioimmunoconjugates er generelt en temmelig enkel procedure, er det vigtigt at holde et par vigtige overvejelser i tankerne i hvert trin i processen. For eksempel, måske den mest sandsynlige årsag til bekymring under konjugering trin i proceduren er sammenlægning af antistoffet under konjugationsreaktionen. Dette problem er mest ofte et produkt af dårlig blanding af konjugeringsreaktionen efter tilsætningen af DFO-NCS stamopløsning. 22 Når dette sker, kan den ikke-homogen fordeling af DFO-NCS forårsage høje niveauer af lokal reaktion med antistof, som igen kan føre til aggregering. Dette problem kan være relativt let omgås ved tilsætning af DFO-NCS stamopløsning i små portioner (<5 pi), grundig blanding af reaktionsblandingen efter tilsætningen af ​​DFO-NCS, og omrøring af reaktionsblandingen på en temperature-kontrollerede shaker. Desuden, efter konjugering og rensning af DFO-mAb konstruktion, er det vigtigt præcist at bestemme antallet af DFO konjugeret til hvert mAb. Den fulde karakterisering af antallet af DFO chelater pr antistof kan opnås ved hjælp af radiometriske isotopisk fortynding forsøg svarende til dem, der udføres af Holland et al. Og Anderson, et al., Selvom MALDI-TOF-massespektrometri er et levedygtigt alternativ. 14,23 , 30,51,52 Under radioaktiv mærkning trin let den mest almindelige problem er lavere end forventet radioaktiv mærkning udbytter. Hvis uventet lave udbytter forekomme trods ihærdigt efter ovennævnte protokol, findes tre forskellige strategier til fejlfinding: (1) inkubation af radioaktiv mærkning reaktion i længere mængder af tid (f.eks 2-3 timer); (2) at gentage radiomærkning under anvendelse af en højere koncentration af antistof; eller (3) at gentage den oprindelige DFO-NCS konjugering under anvendelse af en højere molært overskud af the bifunktionel chelator.

Mens DFO-NCS konjugering er letkøbt og robust, en af ​​dens ubestridelige svagheder er, at det ikke er stedspecifikt: DFO-NCS danner thiourinstof bindinger med tilgængelige lysiner i antistoffet uanset om deres holdning. Som et resultat er det muligt, at de chelatorer kan blive føjet til antigen-bindende region af antistoffet, at dette berører immunoreaktivitet af 89 Zr-DFO-mærkede konjugat. Derfor skal en fin balance i opførelsen af 89 Zr-mærkede radioimmunoconjugates: større antal chelatorer pr antistof lette højere specifikke aktiviteter, men højere grader af mærkningen også øge risikoen for at kompromittere immunoreaktiviteten af konstruktionen. I sidste ende er målet enkelt: vedhæfte så mange chelatorer som nødvendigt uden at det går immunoreaktivitet. Efter opnåelse af den oprensede 89 Zr-DFO-mAb radioimmunokonjugatet, er det vigtigt at bestemme in vivo eksperimenter. Til dette formål, anbefaler vi at bruge in vitro-metoder er offentliggjort af Lindmo et al. 53,54 Hvis immunreaktiviteten af konstruktionen er mindre end 80-90%, kan det være nødvendigt at vende tilbage til konjugationsreaktionen og tilføje færre DFO dele pr antistof. Alternativt, hvis immunreaktivitet af det oprensede 89 Zr-DFO-mAb er høj (> 90%) og højere specifikke aktiviteter der ønskes, kan det være muligt at fastgøre flere chelatorer til antistoffet uden faldende immunoreaktivitet.

Endelig in vivo opførslen af en 89 Zr-DFO-mærkede antistof er naturligvis stærkt afhængig af både identiteten af antistoffet og tumormodel anvendes. I modelsystemet præsenteres her, den maksimale optagelse værdien i tumoren når ca. 60% ID / g; rapporterer imidlertid i litteraturen for maksimal tumoroptagelse values ​​spænder fra så lavt som 15-20% ID / g til så højt som 80-90% ID / g 33,44,55-57 Ligeledes mængden af optagelse i ikke-målvæv -. især lever og milt - kan variere meget afhængigt af antistof / antigen-systemet blev undersøgt. Den specifikke aktivitet af 89 Zr-DFO-mærkede antistof er en vigtig overvejelse for in vivo eksperimenter. Litteratur værdier for specifikke aktiviteter 89 Zr-DFO-mAbs ligger typisk 1-6 mCi / mg (37-222 MBq / mg). 8,10 Generelt højere specifikke aktiviteter er at foretrække, da de nedbringer sandsynligheden for utilsigtet mætning af antigen (dvs. selv-blokering). Dette bliver især tilfældet i systemer med lavere niveauer antigenekspression. Uanset antistof / antigen-system, ingen in vivo undersøgelse af en 89 Zr-DFO-mærket imagografimiddel er komplet uden en demonstration af selektivitet. Dette kan opnås via blokering forsøg medstore mængder af umærket biomolekyle eller anvendelse af en cellelinje, der ikke udtrykker det pågældende antigen. I fremgangsmåden beskrevet heri, blev den tidligere anvendte, men selektiviteten af 89 Zr-DFO-J591 er også blevet påvist ved brug PSMA-negative PC3 prostatakræft xenotransplantater. 23

Det er vigtigt at bemærke, at på trods af sine klare fordele, dette DFO-NCS-baserede syntetiske metode er ikke perfekt. Som vi har diskuteret, DFO er ikke en ideel chelator til 89 Zr 4+, og den ikke-site-specifikke karakter konjugeringsreaktionen kan bevise besværlige. For at omgå disse problemer, til spændende indsats udvikle nye chelatorer for 89 Zr 4+ og stedspecifikke radioaktiv mærkning metoder er i øjeblikket i gang, men disse nye teknologier skal stadig optimeres og valideret i både laboratoriet og klinikken. 24,26,27, 29,44 I sidste ende er DFO-NCS metode til konstruktion af89 Zr-DFO-mærkede antistoffer har vist sig at være et yderst effektivt redskab til syntese af radioimmunoconjugates og har potentialet til at blive anvendt til at skabe en bred vifte af klinisk nyttige radiofarmaceutika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Prof. Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton og Dr. Serge Lyaschenko for nyttige samtaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14, (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23, (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8, (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7, (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20, (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8, (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12, (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40, (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9, (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36, (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45, (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8, (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11, (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35, (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55, (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39, (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33, (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5, (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51, (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57, (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38, (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20, (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49, (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37, (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5, (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51, (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48, (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2, (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39, (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87, (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52, (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18, (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13, (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22, (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30, (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6, (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24, (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170, (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46, (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147, (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34, (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33, (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36, (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72, (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121, (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1, (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52, (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53, (1), 113-120 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics