Busulfan als myelosuppressiven Agenten zur Erwirtschaftung stabiler Hochrangige Knochenmark Chimärismus bei Mäusen

Medicine

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Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

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Abstract

Protocol

HINWEIS: Ethikerklärung: Dieses Protokoll wurde überprüft und von der Animal Care Committee der Simon Fraser University zugelassen (UACC; erlauben Zahlen 1037K-12 und 1060K-03) und ist in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care, der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der EWG Richtlinie.

1. Spezielle Überlegungen

HINWEIS: Busulfan ist zytotoxische. Behandeln und entsorgen Sie nach dem Sicherheitsdatenblatt und institutionellen Richtlinien.

  1. Führen Sie alle Techniken aseptisch in einer Sterilbank.
  2. Sterilisieren von Instrumenten vor der durch Wickeln in einer geeigneten Verpackung, beispielsweise einer abziehbaren Verpackung und Autoklavieren zu verwenden.
  3. Während das Risiko für eine Infektion mit niedriger Busulfan Anlage gegenüber Bestrahlung, Griff Tieren nur in einer laminaren Strömungshaube für die ersten 2 Wochen nach der Transplantation.

2. KonditionierungEmpfänger Mäuse

  1. Verdünne Busulfan bis 3 mg / ml mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ml.
    HINWEIS: Es ist wichtig, um eine frische Verdünnung von Busulfan kurz vor jeder Tag der Injektion verwendet werden.
  2. Verwalten Sie 20 mg / kg des verwässerten Busulfan auf Empfängermäuse über IP-Injektion täglich.
  3. Täglich wiederholen IP-Injektionen von 20 mg / kg Busulfan, bis zu einer Gesamtdosis von 60-100 mg / kg abgegeben wurde (dh für eine 80 mg / kg Gesamtdosis verabreichen 20 mg / kg Busulfan für 4 aufeinanderfolgende Tage).

3. Isolierung von Spenderknochenmarkzellen

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde erfolgreich zur Isolierung und Vorbereitung BM-Zellen von bis zu 5 Spendermäusen eingesetzt. Typischerweise wird die Zellausbeute pro Maus etwa 30 bis 40.000.000 BMDCs, die ausreicht, um 12 bis 16 Empfängermäuse verpflanzen ist. Wenn mehr Donormäusen benötigt das Protokoll müssen entsprechend angepasst werden.

  1. Nach dem letzten Tag der Busulfan Anlage EuthAL TEN ein GFP Spendermaus (1-6 Monate) mit CO 2 (oder von anderen Euthanasie-Verfahren bei Hochschule angenommen). Zur Vermeidung von Transplantat Komplikationen verwenden syngenen Spendern, die das gleiche Geschlecht wie die Empfänger sind.
  2. Spray-Maus mit 70% Ethanol. Fahrstuhl Haut an den Bauch und mit chirurgische Scheren einen Einschnitt durch die Haut aus der Bauchhöhle bis das Bein auf die Knöchel. Halten Sie den Fuß fest ziehen Sie die Haut vom Knöchel zur Hüfte Freilegung der Beingewebe.
  3. Schneiden Sie Muskel- und Fettgewebe aus dem Oberschenkelknochen, das Hüftgelenk aus.
  4. Langsam nach unten auf den Fuß, das Bein zu verlängern, drücken Sie die Schere gegen das Hüftgelenk. Schneiden Sie gerade über dem Kopf des Oberschenkelknochens kümmert sich nicht um den Oberschenkelknochen selbst geschnitten.
  5. Zur Aufrechterhaltung der Sterilität, halten Sie das Bein mit dem Fuß, und reinigen Sie alle verbleibenden Gewebe von den Knochen durch Reiben der Knochenoberfläche mit autoklaviert Gewebe.
  6. Trennen Sie die Oberschenkel und Schienbein durch Schneiden durch das Kniegelenk undlegen Sie das Femur in einer Kulturschale mit steriler PBS. Auf Eis inkubieren.
  7. Entfernen und entsorgen Sie das Wadenbein, indem an den Stellen, wo das Wadenbein verbindet sich mit dem Schienbein. Legen Sie die Tibia in der Kulturschale mit dem Oberschenkelknochen und auf Eis inkubieren.
  8. Die Schritte 3,2-3,7 für das andere Bein, und gegebenenfalls weitere Spendermäusen. Nach der Entfernung der Knochen, sterilisieren chirurgische Instrumente mit einem heißen Perle Sterilisator oder verwenden Sie eine neue Reihe von sterilen Instrumente für die weiteren Schritte.
  9. Für den Oberschenkelknochen, halten Sie die Oberschenkel mit einer Pinzette und mit chirurgische Scheren sorgfältig "Rasur" die distalen Enden der Knochen. So wenig von den Knochen wie nötig, um die BM Höhle freizulegen.
  10. Füllen Sie eine Spritze mit 3 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 23 G Nadel. Vorsichtig trug die Nadel in die BM Höhle und spülen Sie das BM in eine sterile Petrischale. Achten Sie darauf, die Markhöhle mit der Nadelspitze zu kratzen, um die Entfernung aller gewünschten Zellen zu gewährleisten. Nach der Extraktionsicherzustellen, dass der rote BM nicht mehr sichtbar ist und der Knochen wird jetzt weiß.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 3,9-3,10 für nachfolgende Oberschenkelknochen, die Bündelung all der BM in der gleichen Kulturschale.
  12. Für die Schienbeine, halten Sie die Tibia mit einer Pinzette vorsichtig "Rasur" das Ende, wo das Schienbein bis zum Knie, um den BM Höhle aussetzen befestigt. Machen Sie einen zweiten Schnitt entlang der Knochen, wo die sichtbaren roten BM endet.
  13. Füllen Sie eine Spritze mit 3 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 25 G Nadel. Schieben Sie die Nadel in die BM Hohlraum (vom Ende, die bis zu den Knien befestigt war) und spülen Sie das BM in der Kulturschale mit dem BM aus den Oberschenkelknochen. Kratzen die Wände des Hohlraums BM mit der Nadel, um alle Zellen zu entfernen. Nach der Extraktion zu gewährleisten, dass die rote BM nicht mehr sichtbar ist und der Knochen wird jetzt weiß.
  14. Wiederholen Sie die Schritte von 3,12 bis 3,13 für nachfolgende tibiae, die Bündelung all der BM in der gleichen Kulturschale.
  15. Sanft verreiben die BM mit einer 1 ml Pipettenspitze, um die c distanzierenEllen.
  16. Passieren die Zellsuspension durch ein 40 & mgr; M Korbfilter in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Schale mit PBS, um alle verbleibenden Zellen und übertrage diese durch den Filter in dem Zentrifugenröhrchen.
  17. Zentrifuge 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
  18. Re-suspendieren des Pellets in 3 ml Erythrozyten Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min.
  19. Hinzufügen ~ 30 ml sterilem PBS, die Lysepuffer quenchen.
  20. Zentrifuge 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
  21. Resuspendieren des Pellets in 1 ml sterilem PBS. Halten Sie auf dem Eis.
  22. Nehmen ein kleines Aliquot des Zellhomogenats mit PBS verdünnt (1: 100 für 1 Maus, 1: 200 für die 2-Mäuse, etc.), um die Anzahl der Zellen zu quantifizieren, unter Verwendung eines Hämocytometers.
  23. Verdünne die Zellsuspension auf 8 x 10 6 Zellen / ml und Inkubation auf Eis bis zur Injektion.

4. Knochenmarktransplantation

  1. Fill ein 0,5-ml-Spritze (mit einer 28 G Nadel Insulin) mit 300 ul verdünnten Zellsuspension für jede Maus injiziert werden. Seien Sie sicher, dass alle in der Spritze Luftblasen zu entfernen.
  2. Platzieren Sie die Maus Käfig mit den konditionierten Empfängermäuse auf einem Heizkissen und lassen Sie die Schwanzvenen zu erweitern.
  3. Nehmen Sie eine Empfängermaus und in die Rückhalteeinrichtung. Wischen Sie den Schwanz mit chirurgischen Gaze mit 70% Ethanol eingeweicht.
  4. Halten Sie das Heck und mit der Fase nach oben, sanft die Nadel in eine der seitlichen Schwanzvenen und injizieren Sie die Zellsuspension.
  5. Halten chirurgischer Gaze auf die Injektionsstelle, bis die Blutung aufhört vor dem Einführen der Maus in einen neuen sauberen Käfig.

5. Schätzung der Umfang der BM Chimärismus

HINWEIS: Chimärismus Ebenen sind in der Regel variable im peripheren Blut nach 1 Woche nach der KMT, und als solche Chimärismus Ebenen werden in der Regel geschätzt mindestens 2 Wochen nach der KMT. Ebenen der chimerism sollte> 80% GFP + Zellen im peripheren Blut in 3-4 Wochen erreichen nach der KMT.

  1. Bereiten FACS Puffer (2 mM EDTA + 2% fötalem Rinderserum in PBS).
    HINWEIS: FACS-Puffer bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
  2. Platzieren Sie die Maus in einem Halterohr und rasieren Sie das Fell auf dem hinteren Bein, um die laterale Vena saphena aus.
  3. Dünn Mantel das Bein mit Vaseline und durchbohren die Vena saphena mit einer 25 G-Nadel.
  4. Sammeln etwa 50 ul Blut mit Heparin beschichteten Kapillarröhrchen. Füge das Blut in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml FACS-Puffer. Mischen Sie das Rohr durch Umdrehen und Lagerung auf Eis.
  5. Halten chirurgischer Gaze auf die Injektionsstelle bis die Blutung aufhört, bevor er Maus wieder in den Käfig.
  6. Zentrifugieren der Blutproben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand.
  7. Re-suspendieren des Pellets in 500 ul Erythrocyten-Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min.
  8. 1 ml FACS-Puffer, um die Lysepuffers quenchen.
  9. Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand.
  10. Führen Sie eine zweite Lyseschritt in 500 ul Erythrozyten Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 8,5 min.
  11. 1 ml FACS-Puffer, um die Lysepuffers quenchen.
  12. Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand. Überprüfen Sie, ob das Pellet ist jetzt weiß.
    HINWEIS: Wenn das Pellet noch rot angezeigt wird, kann ein zusätzlicher Lyse, bevor Sie mit dem nächsten Schritt benötigt.
  13. Resuspendieren des Pellets in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifugiere die Proben für 5 min bei 900 x g. Entfernen Sie den Überstand.
  14. Re-suspendieren des Pellets in 300 ul FACS-Puffer und Quantifizierung GFP + -Zellen mittels Durchflusscytometrie (ANMERKUNG: An diesem Punkt jede gewünschte Immunfärbung der Zellen kann durchgeführt werden unter Verwendung von Standardtechniken vor der Durchflusszytometrie-Analyse).

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Representative Results

Die Verabreichung von 60-100 mg / kg Busulfan im allgemeinen gut von Mäusen gut vertragen. Doch in der Regel Tiere, Gewicht zu verlieren während der Konditionierungsphase (~ 5-10%) und damit die Nahrung muss unter Umständen mit Leckereien wie bestrahlt Sonnenblumenkerne zu essen zu fördern ergänzt werden. Ebenen der Chimärismus von> 80% GFP + Zellen im peripheren Blut und BM konsequent erreichbar mit 60 bis 100 mg / kg Busulfan 7 sein. Unser Labor hat erfolgreich dieses Protokoll, mit dem über 100 chimären Mäusen mit> 80% GFP + Zellen im peripheren Blut und BM erzeugen, und praktisch alle unsere BMTS bei der Verwendung von syngenen Spender und Empfänger erfolgreich sind. Abbildung 1 zeigt die Konzentrationen von Chimärismus Wochen quantifiziert im peripheren Blut von Mäusen, die mit 100 mg / kg Busulfan konditioniert Empfangen eines erfolgreichen syngenen BMT (n = 3) und Mäuse mit 80 mg / kg Busulfan konditioniert Empfangen eines erfolglosen allogenen BMT (n = 3). Chimärismus Stufen> 80% sind typically von 3-4 Wochen gegründet nach der KMT. 2 zeigt repräsentative FACS Daten der peripheren Blut, die einen erfolgreichen und nicht erfolgreichen BMT. Abbildung 3 zeigt, dass diese Chimärismus bleibt für mindestens ein Jahr in der BM festgelegt (n = 3), und daß Anlage mit Fahrzeug nicht ausreicht, BM-Chimärismus zu induzieren (n = 3). Zwar gibt es keine signifikanten Unterschiede in den Niveaus der BM Chimärismus erreicht mit Dosen von 60-100 mg / kg Busulfan, GFP + Zellen akkumulieren im ZNS in einer dosisabhängigen Weise. Darüber hinaus wird diese Akkumulation dramatisch bei neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS 7 erhöht. Figur 4 zeigt GFP + Zellakkumulation in der Lendenregion der Wirbelsäule in einem Wildtyp (n> 20) und ALS-Mausmodell (n> 20).

Figur 1
Abbildung 1. Die Empfängermäuse Anlagemit Busulfan und GFP + Knochenmarkszellen aus einem syngenen Spender transplantiert erreichen eine hohe anhalt Chimärismus im Blut. Weekly durchflusszytometrischen Daten zeigen GFP + Chimärismus im peripheren Blut von erfolgreich transplantierten Mäuse mit 100 mg / kg Busulfan konditioniert, gefolgt von syngenen Knochenmarktransplantation (schwarz) und erfolglos transplantierten Mäusen mit 80 mg / kg Busulfan gefolgt von allogenen Knochenmarktransplantation (grau) konditioniert. Die Ergebnisse sind Mittel von n = 3 Mäuse / Gruppe, Fehlerbalken stellen SEM.

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative durchflusszytometrischen Daten zeigen GFP + -Zellen im peripheren Blut 3 Wochen nach der Knochenmarktransplantation bei Mäusen, die mit 100 mg / kg Busulfan. (A) Streudiagramm Gating Strategie (B) ein erfolgloser allogen konditionierteneic Knochenmarktransplantation ist, und (C) ein erfolgreicher syngenen Knochenmarkstransplantation. Ergebnisse von n> 3 Mäusen repräsentativ sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Repräsentative durchflusszytometrischen Daten zeigen GFP + -Zellen im Knochenmark 1 Jahr nach der Knochenmarktransplantation. (A) Streudiagramm mit Gating-Strategie, (B) Fahrzeuganlage Mäuse und (C) 100 mg / kg Busulfan Anlage Mäusen. Ergebnisse von n = 3 Mäusen repräsentativ sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.


Abbildung 4. Das Knochenmark abgeleiteten Zellen reichern sich im ZNS von Busulfan Anlage Mäusen eine Knochenmarktransplantation. Immunhistochemische Analyse von Teilen der Lendengegend des Rückenmarks von (A, C) Wildtyp-Mäusen und (B, D) Ende isoliert Krankheitsstadium ALS-Mäuse. GFP + -Zellen sind grün markiert. Die Ergebnisse sind repräsentativ Bilder von n> 20 Mäuse für jedes Modell. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Busulfan Anlage ermöglicht die Erzeugung von High-Level BM Chimärismus in Mäusen, die mit hämatopoetischen Zellen, die leicht nachweisbar sind. Diese Konditionierung kann ohne die Notwendigkeit für Bestrahlungsanlagen durchgeführt werden. Außerdem ist die Myelosuppression mit den Dosen von Busulfan in diesem Protokoll umrissen gut verträglich Minimierung toxischer Nebenwirkungen von myeloablativen Dosis der Bestrahlung verursacht werden, und somit kann eine weitere geeignete Technik zur BM Chimärismus in junge, alte oder erkrankten Mäusen, die eher zu erzeugen anfälliger für die Bestrahlung myeloablativen. Einige RIC Protokolle verwenden niedrigen, nicht-myleoablative Dosen von Gesamtkörperbestrahlung, um die Nebenwirkungen zu minimieren, wobei diese Protokolle erfordern noch Bestrahlungseinrichtungen und in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis kann in Chimärismus Stufen, die niedriger als die erzielbare Busulfan führen Anlage 13. Vor kurzem wurde Treosulfan für BM Anlage 8,14 verwendet. Wie Busulfan, Treosulfan conditienantrieb und BMT ist geeignet zur Erzeugung von Mäusen mit einem hohen Grad an Chimärismus im BM 14. Jedoch ist Treosulfan in Nordamerika nicht ohne weiteres erreichbar ist, und die Dosis von Treosulfan erforderlich, um vergleichbare Niveaus von Chimärismus Busulfan Anlage zu erreichen, ist wesentlich höher als Busulfan (~ 5-10 fach) 14. Darüber hinaus an diesen wirksamen Dosen Treosulfan mehr toxische Nebenwirkungen in Mäusen im Vergleich zu Busulfan (K. Peake, J. Manning, und C. Krieger, unveröffentlichte Beobachtungen) zu haben scheint. Periphere Blut Chimärismus kann auch durch Erzeugung parabiotic Mäusen, die chirurgisch Verknüpfung beinhaltet die Zirkulation einer Empfängermaus zu einer Spendermaus hergestellt werden. Im Gegensatz zu ganzen BM Transplantationen ermöglicht Parabiose für periphere Blut Chimärismus in einer physiologischen aufzustellen, ohne dabei BM-eingeschränkten Vorläuferzellen in den Kreislauf, obwohl Parabiose ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren, das lediglich zu ca. 50% Spenderzellen in den peripheral Blut der Empfängermäuse 15.

Die hier vorgestellte Protokoll stützt sich auf mit Empfänger und Spender Mäusen, die das gleiche Geschlecht sind, sowie mit syngenen Empfänger und Spender Mausstämme, um die Möglichkeit einer Transplantat-Abstoßung zu minimieren. Obwohl viele geeignete Spender- und Empfängerstämme sind im Handel erhältlich, zur Schaffung Chimärismus in mismatched allogenen Mäusen (dh signifikant in MHC-Haplotyp) problematisch sein kann. In solchen Fällen, in denen allogenen Mäusen sind die einzigen geeigneten Mäusen vorhanden, eine Vorstudie sollte zuerst auf eine kleine Gruppe von Mäusen durchgeführt, um festzustellen, ob Busulfan Anlage in der Lage ist, die zu einem hohen Grad an stabiler Chimärismus werden. Wir haben einen gewissen Erfolg Umpflanzen Donor BMDCs aus C57BL / 6-GFP-Mäusen isoliert wurden, in C57BL / 6 hatte; SJL Empfänger, obwohl nicht alle transplantierten Mäusen etabliert aufrechterhalten Chimärismus (~ 30%). Die Zugabe von Cyclophosphamid, ein starkes Immunsuppressivum oft uin Verbindung mit Busulfan klinisch Sed 16 kann verwendet werden, um die Erfolgsquote der allogenen Transplantation zu verbessern. Wenn jedoch C57BL / 6-GFP-Zellen wurden in einer Dreifach transgenes Mausmodell für Alzheimer-Krankheit bei einem gemischten C57BL / 6 transplantiert; 129 genetischen Hintergrund, Busulfan und Cyclophosphamid Anlage waren nicht ausreichend für die Erzeugung stabiler BM-Chimären (2B), während stabile engraftment konnten folgende tödliche Bestrahlung. Somit wird in Situationen, in denen die allogene Transplantate benötigt werden, kann die Bestrahlung eine geeignetere Konditionierung aufgrund der vollständigen Myeloablation und schwerer Immunsuppression, die auftritt.

Mehrere zusätzliche Maßnahmen, um die Chimärismus und Konsistenz dieses Protokoll zu maximieren genommen werden. Entscheidend ist, dass frische Verdünnungen von Busulfan zur Injektion im Idealfall kurz vor Busulfan Verabreichung hergestellt, wie die Potenz von Busulfan scheint langfristig reduziert werdenLagerung. Zusätzlich wird, wenn Verreiben des BM, um die Zellen zu dissoziieren, ist es wichtig, dies zu tun, vorsichtig, um nicht die Knochenmarkszellen schädigen. Während dies in einigen Klumpen von Gewebe, das nicht vollständig gelöst sind und somit eine etwas geringere Ausbeute, die allgemeine Gesundheit und die Qualität der dissoziierten Zellen werden besser führen. Ebenso werden alle Schritte, die Resuspension des Pellets erfordern auch leicht durchgeführt werden.

Hohe Konzentrationen von Chimärismus konsistent mit erreicht werden 60, 80 und 100 mg / kg Dosen von Busulfan 7 (Figuren 1 - 3). Darüber hinaus gibt es eine dosisabhängige Erhöhung der Akkumulation von GFP + -Zellen im ZNS von Wildtyp-8,9 und ALS Mäusen 7. Wir und andere haben ebenfalls beobachtet, eine Erhöhung der Anzahl der Akkumulations GFP + Zellen im ZNS von Mausmodellen von Neurodegeneration im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 7,8,10. Letalen Bestrahlung führt zu einer noch größeren Zahl von GFP + BMDCs, verglichen mit 60-100 mg / kg-Dosen von Busulfan 7 obwohl eine neue Studie schlägt vor, dass ein myeloablativen Dosis von Busulfan (125 mg / kg) führt zu einer höheren Anzahl von GFP + -Zellen in das Gehirn im Vergleich zur Gesamtkörperbestrahlung 9. Hinweise darauf, dass BMDC Eintritt in das ZNS von letal bestrahlten Mäusen kann durch zumindest teilweise sein, zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Während Busulfan nicht angezeigt wird, um die BBB zu stören, basierend auf der Abwesenheit von Serum-Proteine ​​(Albumin) im ZNS 11 ist Busulfan in der Lage, leicht die BBB 17,18 und so wurde vorgeschlagen, dass Busulfan Anlage kann innerhalb eröffnen Nischenraum das ZNS, die durch eigene BMDCs 8 gefüllt ist. Interessant ist, dass die Ergebnisse der Wilkinson et al. Zeigen, dass die GFP + Zellen reichern sich im ZNS von Busulfan Anlage Mäuse aufgrund einer Chemokin Einstellungsmechanismus während GFP + Zellakkumulation in letal bestrahlten Mäusen scheint aufgrund inflammator seiny Mechanismen durch die Bestrahlung selbst 9 erzeugt. Treosulfan nicht erscheint, um die ZNS-Zustand und folglich wenige GFP + -Zellen wurden im ZNS Treosulfan konditioniert Mäusen 8 gefunden. Es bleibt die Wirkung verschiedener Dosen von Busulfan bestimmt werden kann auf andere als das ZNS Gewebe zu haben, obwohl Busulfan ist bekannt, die Leber, die Lunge und die Nieren 6 zielen. Das Busulfan kann andere Gewebe bedingen sollte bei der Wahl einer Dosis von Busulfan für neue Experimente genommen werden.

Während diese Busulfan Anlage Protokoll ist relativ einfach durchzuführen, die Erzeugung von Mäusen mit chimären BM ist ein mächtiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um blutbildende Zellen zu untersuchen. Die Vielzahl von transgenen Mäusen im Handel erhältlich, zusammen mit der Fähigkeit Genmanipulation Mäusen und BMDCs, dramatisch erhöht das Potential dieses Protokolls. Zum Beispiel gibt es verschiedene Mausmodelle, wo der GFP-Expression ist beschränktspezifische Zelltypen und Linien, wie CX3CR1-GFP-Mäuse, die GFP in myelomonozytäre Linie Zellen 19 zum Ausdruck überwiegend. Diese Mäuse können als Spender so dass für die Untersuchung bestimmter hämatopoetischer Zellpopulationen in vivo verwendet werden. Eine Anzahl von verschiedenen Fluorophoren existieren zusätzlich zu GFP, die genutzt werden können, um zu trans und überwachen BMDCs aus zwei (oder mehr) unterschiedlichen Spendern, eine Technik, die für kompetitive Assays 20 eingesetzt werden können. Weiterhin wurde eine Anzahl von verschiedenen transgenen Mausmodellen von Krankheiten existieren, die als Empfänger verwendet werden, um die Rolle von BMDCs in einer Vielzahl von Störungen zu untersuchen. Nach der Transplantation, Spenderzellen können mittels Immunhistochemie untersucht wird, oder durch FACS isoliert und untersucht unter Verwendung einer Reihe von biochemischen Techniken. Darüber hinaus können erweiterte Imaging-Technologien wie Zwei-Photonen-Mikroskopie für die Live-in-vivo-Nachweis von Fluorophoren wie GFP 21 realisiert werden. Letztlich istist vorgesehen, dass BMDCs könnte gentechnisch zur therapeutischen Molekülen liefern Geweben wie der CNS in Busulfan Anlage Empfänger abzuzielen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

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References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239, (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21, (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2, (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9, (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8, (4), e60661 (2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21, (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8, (3), e58544 (2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14, (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77, (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32, (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10, (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8, (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4, (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30, (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20, (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55, (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

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